肺微生态是指肺部的特定微生物群。肺微生态通过直接破坏作用、诱发炎性细胞活化以及炎性因子释放使肺部处于慢性炎症状态，进而发展为肺癌。肺癌患者与健康者的肺微生态存在显著差异，某些特定微生物菌群可作为肺癌诊断的标志物。而特定微生物群落与免疫治疗的疗效相关，微生物组成还可能作为免疫相关不良反应的标志物。肺微生态与肺癌之间关联的研究挑战与机遇并存。该文将围绕肺微生态在肺癌发生、诊断及免疫治疗中的意义与价值进行阐述，以期为相关领域的基础和临床研究工作者提供借鉴。
引用本文： 田霞, 田攀文, 李为民. 肺微生态在肺癌发生、诊断及免疫治疗中的作用. 华西医学, 2021, 36(1): 14-18. doi: 10.7507/1002-0179.202012089 复制
肺癌是全世界癌症相关病死率最高的恶性肿瘤，5 年生存率为 4%～17%[1]。近年来，肺癌的筛查和个体化治疗取得了巨大进展，免疫治疗在非小细胞肺癌中的应用取得了里程碑式进展，为驱动基因阴性的晚期非小细胞肺癌患者带来新的希望。传统观念认为下呼吸道为无菌状态[2]，但随着二代测序技术的广泛应用，多项研究表明存在肺微生态，且与人体健康和呼吸系统疾病（包括肺癌）相关[3-5]。近年来，国内外研究显示，肺微生态可以通过炎症、代谢及信号通路等途径影响肺癌的发生发展，并可能影响免疫治疗的临床疗效[6-7]，为肺癌的免疫治疗带来了新的思路。但是，肺微生态与肺癌发生之间的确切关联机制、肺微生态对肺癌的诊断价值以及肺微生态在肺癌免疫治疗中的意义，均尚未完全阐明。本文将围绕上述问题进行阐述，以期为相关领域的基础和临床研究工作者提供借鉴。
1 肺微生态的概念
肺微生态指肺部的特定微生物群，人体各个部位几乎都存在着大量的微生物，它们通过产生一些生物活性化合物，如维生素、短链脂肪酸、脂多糖等，影响人体健康以及促进一系列慢性疾病的发展[8-9]。既往普遍认为肺部是无菌的，但随着二代测序技术的出现，也在肺部发现了微生物，“肺部无菌”的传统观念被颠覆。后续研究也表明不论是健康者还是呼吸道疾病患者，其下呼吸道中均存在不同的微生物群[3-4]。基于健康成人的支气管肺泡灌洗标本显示，肺微生物菌群的组成与上呼吸道（包括口咽和鼻腔）的细菌门组成类似，但组成比例存在差异，主要包括放线杆菌、硬壁菌、拟杆菌以及蛋白细菌，韦荣球菌属、链球菌属和假单胞菌属等为其优势菌群属[10-11]。此外，随着个体年龄增长，机体逐渐形成一个独特且相对稳定的肺微生态，细菌负荷增加，细菌组成由以革兰杆菌和硬壁菌转变为以类杆菌为主，这种变化与程序性死亡蛋白-1 依赖的调节性 T 细胞增多有关，调节性 T 细胞能增强机体对环境过敏原的耐受性[12]。另外，肺微生态对宿主免疫系统的形成与成熟有重要促进作用，出生后最初 2 周接触微生物是机体形成健康免疫系统所必需的[13]。这一功能主要与肺泡巨噬细胞和树突状细胞诱导调节性 T 细胞的产生以及释放转化生长因子-β、白细胞介素（interleukin，IL）-10 等细胞因子所发挥的免疫调节作用相关[14-15]。调节性 T 细胞通过产生一系列细胞分子（如 IL-10、IL-2、转化生长因子-β 及 IL-3 等）来诱导免疫耐受及免疫抑制[16]。一项探讨首次接触空气过敏原时的年龄与发生气道炎症可能性及程度关联的分析研究显示，小鼠出生后特定微生物菌群的出现对调节性 T 细胞的发育是必要的[12]。此外，还有研究表明在存在特定肺微生物菌群的情况下，肺泡巨噬细胞对脂多糖刺激的免疫反应减弱[17]。综上，特定肺微生物菌群的出现对于机体免疫耐受的建立至关重要。
2 肺微生态与肺癌的发生
恶性肿瘤细胞在宿主体内不受控制地增殖，既往研究认为遗传和环境因素在其中起重要作用[18-20]，而近年来研究发现肺微生物群可能参与这一过程[6, 21]。微生物通过产生致癌代谢产物、毒素或者与单核细胞及树突细胞等抗原提呈细胞上的 Toll 样受体相结合，调节肺组织炎症因子，诱发慢性炎症，进而破坏细胞周期，导致控制细胞增殖、肿瘤发生的信号通路上调，促进肺癌发生[7, 22-24]。有学者通过分析肺腺癌患者的微生物组成，发现在微囊藻毒素激发的非小细胞肺癌细胞系和肺腺癌蓝藻阳性组织中，CD36（Toll 样受体分子）水平降低，多腺苷二磷酸核糖聚合酶水平升高，指出蓝藻源性微囊藻毒素激活了导致肺癌发生的炎症途径，在细胞增殖和癌变中起重要作用[25]。另一项探究 IL-17C 在肺肿瘤微环境中作用机制的研究显示，在慢性阻塞性肺疾病患者中常出现不可分型流感嗜血杆菌和铜绿假单胞菌等细菌性病原体的定植，它们通过破坏气道上皮细胞和放大肺部炎症，促进慢性阻塞性肺疾病的发展，再进一步进展为肺癌。另外，不可分型流感嗜血杆菌还能诱导 IL-17C 产生，进而调节肿瘤相关炎症，促进肿瘤生长[26-27]。综上，肺微生态以慢性炎症为基础，通过直接破坏作用、诱发炎性细胞活化以及炎性因子释放使肺部处于慢性炎症状态，进而进展为肺癌。此外，共生菌能刺激骨髓细胞产生依赖髓样分化因子 88 的 IL-1b 和 IL-23，诱导 Vγ6+Vδ1+γδT 细胞增殖和活化，产生促进炎症和肿瘤细胞增殖的 IL-17 和其他效应分子[28]。而另一项研究表明，气道上皮细胞暴露于韦荣球菌、普雷沃菌和链球菌后细胞外调节蛋白激酶和磷脂酰肌醇 3-激酶信号通路被激活，诱导气道上皮细胞发生转化，促进肿瘤发生[29-30]。由此可见，肺微生物菌群在肺癌发生中起关键作用，它通过刺激某些应答细胞产生效应分子，影响机体的信号传导通道，形成适合肿瘤细胞生长的微环境。
3 肺微生态与肺癌的诊断
近年来，肺微生态是否可作为肺癌的诊断标志物是研究的热点。Yu 等[31]通过比较 165 份肺癌患者的非恶性肺组织发现，肺癌患者肿瘤组织中的α 多样性（样本中微生物群的数量及分布）降低。而另一些研究者发现，肺癌患者口腔和痰标本的颗粒菌、乏养菌属和链球菌属较健康对照组增多；而肺癌患者支气管肺泡灌洗标本的厚壁菌、TM7 菌（暂定名 Saccharibacteria，这是一大类目前无法培养的细菌）、韦荣球菌和巨球菌属更为丰富[32-33]。还有一项研究分析了肺癌患者支气管细菌定植特征，显示 48.1% 的样本中存在流感嗜血杆菌、肠杆菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯菌属和肺炎链球菌等致病菌[34]。上述研究均表明肺癌患者与健康受试者的肺微生态组成存在较大差异。此外，有研究显示，韦荣球菌属、嗜二氧化碳噬细胞菌、食酸菌属（蛋白细菌门）、假单胞菌和巨球菌属对肺癌的早期诊断具有重要价值[15, 35-37]。因此，未来某些特定微生物菌群或可作为肺癌诊断的标志物。
4 肺微生态与肺癌的免疫治疗
目前肺癌的治疗方法包括化学治疗、放射治疗、分子靶向治疗等，但都只能让部分晚期肺癌患者获益[1]。免疫检查点抑制剂的开发和应用使肺癌治疗取得了重大突破，其中最重要的负性免疫检查点是位于 T 淋巴细胞表面的蛋白质：调节外周组织 T 细胞活性的程序性死亡蛋白-1 分子和在抗原提呈过程中调节淋巴结淋巴细胞功能的细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原 4 分子[38-40]。抗细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4 单克隆抗体伊匹单抗用于治疗晚期黑色素瘤取得成功后，免疫检查点抑制剂被应用于多种恶性肿瘤研究并用于临床[38-39, 41]。基于 CheckMate 017 和 CheckMate 057 的结果，抗程序性死亡蛋白-1 单克隆抗体纳武利尤单抗首先被美国和欧洲联盟等批准用于晚期非小细胞肺癌二线治疗[42-43]。而对于驱动基因阴性的晚期非小细胞肺癌，无论程序性死亡蛋白配体-1 的表达水平如何，抗程序性死亡蛋白-1 单克隆抗体帕博利珠单抗联合化学治疗是一线标准治疗；对程序性死亡蛋白配体-1 表达≥1% 的患者，帕博利珠单抗也是一线治疗药物[44-48]。但是，不同患者对免疫治疗的反应不同，经过临床验证，除程序性死亡蛋白配体-1 的表达情况外，还有很多潜在生物标志物可以预测免疫治疗的疗效，如肿瘤突变负荷[49]、微卫星高度不稳定及错配修复基因缺失[50]等，但均不是预测免疫治疗效果的理想指标。还需要进一步阐明免疫检查点抑制剂的反应机制和耐药机制，寻找新的生物标志物，精准预测获益人群，致力于精准免疫肿瘤学领域的发展。
随着特定微生物群落对正常免疫系统发育和药物作用影响的研究不断深入，微生物对于肿瘤免疫治疗的影响备受关注[51]。多项研究显示微生物菌群可以介导免疫治疗的不同反应，并可能作为潜在的治疗靶点和生物标志物[52-54]。一项研究分析了转移性黑色素瘤患者免疫治疗前的粪便样本，显示共生微生物组成与临床反应之间存在显著相关性，并且肿瘤缓解患者肠道中存在更为丰富的长双歧杆菌、屎肠球菌和产气柯林斯菌，用肿瘤缓解患者的粪便重建无菌小鼠可以增强 T 细胞反应，提高抗程序性死亡蛋白-1/程序性死亡蛋白配体-1 治疗的效果[52]。另一项研究表明，粪便菌群移植可以改善无菌或抗生素治疗的小鼠抗程序性死亡蛋白-1 的抗肿瘤效果，接受粪菌移植的无反应者的嗜黏蛋白-艾克曼菌增加[53]。此外，共生双歧杆菌通过调节树突状细胞的作用及一些细胞因子的释放，进而促进机体抗肿瘤反应，改变肠道微生物的组成并调节抗程序性死亡蛋白配体-1 治疗[54]。同时，多项关注抗生素使用的研究表明，抗生素对接受免疫检查点抑制剂的患者的预后造成了负面影响[55-60]。因此，无论是粪菌移植还是抗生素的使用，均提示微生物菌群组成与免疫治疗之间存在相关性，微生物菌群作为生物标志物预测免疫检查点抑制剂疗效有一定潜力。而另一项研究显示，在小鼠结肠炎模型中，双歧杆菌通过细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4 阻断减轻了免疫相关性结肠炎[61]，说明微生物菌群还可以作为免疫相关不良反应的调节因子。虽然上述研究大多集中于肠道微生态与免疫治疗，但随着肺微生态研究的不断深入，肺微生态对免疫治疗的价值会越来越被重视。
5 小结与展望
肺微生态与肺癌之间存在密切的联系，但还有很多问题尚待研究。肺微生态与肺部癌细胞之间的相互作用机制，以及远端肠道菌群和肺部菌群如何协同调节肺部肿瘤炎症过程和抗肿瘤免疫之间的平衡尚不清楚。肺微生态作为肺癌诊断标志物仍需要大样本的临床研究来证实。肺微生态如何预测免疫治疗的优势获益人群仍不明确。肺微生态与免疫治疗耐药之间的联系也需要进一步的研究。此外，肺微生态领域的研究还需要克服一些客观障碍，如下呼吸道取样的技术难度、健康肺中极低的细菌负荷量、样本极易被上呼吸道菌群污染以及缺乏研究肺微生态的动物模型等。另外，肺微生态的变化与年龄、性别、抗生素使用、吸烟、合并的其他呼吸系统疾病等众多因素有关，这也给肺微生态与肺癌相关的研究带来挑战。期待未来肺微生态与肺癌相关的基础与临床转化研究能为肺癌的诊疗提供新的思路和方法。
肺癌是全世界癌症相关病死率最高的恶性肿瘤，5 年生存率为 4%～17%[1]。近年来，肺癌的筛查和个体化治疗取得了巨大进展，免疫治疗在非小细胞肺癌中的应用取得了里程碑式进展，为驱动基因阴性的晚期非小细胞肺癌患者带来新的希望。传统观念认为下呼吸道为无菌状态[2]，但随着二代测序技术的广泛应用，多项研究表明存在肺微生态，且与人体健康和呼吸系统疾病（包括肺癌）相关[3-5]。近年来，国内外研究显示，肺微生态可以通过炎症、代谢及信号通路等途径影响肺癌的发生发展，并可能影响免疫治疗的临床疗效[6-7]，为肺癌的免疫治疗带来了新的思路。但是，肺微生态与肺癌发生之间的确切关联机制、肺微生态对肺癌的诊断价值以及肺微生态在肺癌免疫治疗中的意义，均尚未完全阐明。本文将围绕上述问题进行阐述，以期为相关领域的基础和临床研究工作者提供借鉴。
1 肺微生态的概念
肺微生态指肺部的特定微生物群，人体各个部位几乎都存在着大量的微生物，它们通过产生一些生物活性化合物，如维生素、短链脂肪酸、脂多糖等，影响人体健康以及促进一系列慢性疾病的发展[8-9]。既往普遍认为肺部是无菌的，但随着二代测序技术的出现，也在肺部发现了微生物，“肺部无菌”的传统观念被颠覆。后续研究也表明不论是健康者还是呼吸道疾病患者，其下呼吸道中均存在不同的微生物群[3-4]。基于健康成人的支气管肺泡灌洗标本显示，肺微生物菌群的组成与上呼吸道（包括口咽和鼻腔）的细菌门组成类似，但组成比例存在差异，主要包括放线杆菌、硬壁菌、拟杆菌以及蛋白细菌，韦荣球菌属、链球菌属和假单胞菌属等为其优势菌群属[10-11]。此外，随着个体年龄增长，机体逐渐形成一个独特且相对稳定的肺微生态，细菌负荷增加，细菌组成由以革兰杆菌和硬壁菌转变为以类杆菌为主，这种变化与程序性死亡蛋白-1 依赖的调节性 T 细胞增多有关，调节性 T 细胞能增强机体对环境过敏原的耐受性[12]。另外，肺微生态对宿主免疫系统的形成与成熟有重要促进作用，出生后最初 2 周接触微生物是机体形成健康免疫系统所必需的[13]。这一功能主要与肺泡巨噬细胞和树突状细胞诱导调节性 T 细胞的产生以及释放转化生长因子-β、白细胞介素（interleukin，IL）-10 等细胞因子所发挥的免疫调节作用相关[14-15]。调节性 T 细胞通过产生一系列细胞分子（如 IL-10、IL-2、转化生长因子-β 及 IL-3 等）来诱导免疫耐受及免疫抑制[16]。一项探讨首次接触空气过敏原时的年龄与发生气道炎症可能性及程度关联的分析研究显示，小鼠出生后特定微生物菌群的出现对调节性 T 细胞的发育是必要的[12]。此外，还有研究表明在存在特定肺微生物菌群的情况下，肺泡巨噬细胞对脂多糖刺激的免疫反应减弱[17]。综上，特定肺微生物菌群的出现对于机体免疫耐受的建立至关重要。
2 肺微生态与肺癌的发生
恶性肿瘤细胞在宿主体内不受控制地增殖，既往研究认为遗传和环境因素在其中起重要作用[18-20]，而近年来研究发现肺微生物群可能参与这一过程[6, 21]。微生物通过产生致癌代谢产物、毒素或者与单核细胞及树突细胞等抗原提呈细胞上的 Toll 样受体相结合，调节肺组织炎症因子，诱发慢性炎症，进而破坏细胞周期，导致控制细胞增殖、肿瘤发生的信号通路上调，促进肺癌发生[7, 22-24]。有学者通过分析肺腺癌患者的微生物组成，发现在微囊藻毒素激发的非小细胞肺癌细胞系和肺腺癌蓝藻阳性组织中，CD36（Toll 样受体分子）水平降低，多腺苷二磷酸核糖聚合酶水平升高，指出蓝藻源性微囊藻毒素激活了导致肺癌发生的炎症途径，在细胞增殖和癌变中起重要作用[25]。另一项探究 IL-17C 在肺肿瘤微环境中作用机制的研究显示，在慢性阻塞性肺疾病患者中常出现不可分型流感嗜血杆菌和铜绿假单胞菌等细菌性病原体的定植，它们通过破坏气道上皮细胞和放大肺部炎症，促进慢性阻塞性肺疾病的发展，再进一步进展为肺癌。另外，不可分型流感嗜血杆菌还能诱导 IL-17C 产生，进而调节肿瘤相关炎症，促进肿瘤生长[26-27]。综上，肺微生态以慢性炎症为基础，通过直接破坏作用、诱发炎性细胞活化以及炎性因子释放使肺部处于慢性炎症状态，进而进展为肺癌。此外，共生菌能刺激骨髓细胞产生依赖髓样分化因子 88 的 IL-1b 和 IL-23，诱导 Vγ6+Vδ1+γδT 细胞增殖和活化，产生促进炎症和肿瘤细胞增殖的 IL-17 和其他效应分子[28]。而另一项研究表明，气道上皮细胞暴露于韦荣球菌、普雷沃菌和链球菌后细胞外调节蛋白激酶和磷脂酰肌醇 3-激酶信号通路被激活，诱导气道上皮细胞发生转化，促进肿瘤发生[29-30]。由此可见，肺微生物菌群在肺癌发生中起关键作用，它通过刺激某些应答细胞产生效应分子，影响机体的信号传导通道，形成适合肿瘤细胞生长的微环境。
3 肺微生态与肺癌的诊断
近年来，肺微生态是否可作为肺癌的诊断标志物是研究的热点。Yu 等[31]通过比较 165 份肺癌患者的非恶性肺组织发现，肺癌患者肿瘤组织中的α 多样性（样本中微生物群的数量及分布）降低。而另一些研究者发现，肺癌患者口腔和痰标本的颗粒菌、乏养菌属和链球菌属较健康对照组增多；而肺癌患者支气管肺泡灌洗标本的厚壁菌、TM7 菌（暂定名 Saccharibacteria，这是一大类目前无法培养的细菌）、韦荣球菌和巨球菌属更为丰富[32-33]。还有一项研究分析了肺癌患者支气管细菌定植特征，显示 48.1% 的样本中存在流感嗜血杆菌、肠杆菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯菌属和肺炎链球菌等致病菌[34]。上述研究均表明肺癌患者与健康受试者的肺微生态组成存在较大差异。此外，有研究显示，韦荣球菌属、嗜二氧化碳噬细胞菌、食酸菌属（蛋白细菌门）、假单胞菌和巨球菌属对肺癌的早期诊断具有重要价值[15, 35-37]。因此，未来某些特定微生物菌群或可作为肺癌诊断的标志物。
4 肺微生态与肺癌的免疫治疗
目前肺癌的治疗方法包括化学治疗、放射治疗、分子靶向治疗等，但都只能让部分晚期肺癌患者获益[1]。免疫检查点抑制剂的开发和应用使肺癌治疗取得了重大突破，其中最重要的负性免疫检查点是位于 T 淋巴细胞表面的蛋白质：调节外周组织 T 细胞活性的程序性死亡蛋白-1 分子和在抗原提呈过程中调节淋巴结淋巴细胞功能的细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原 4 分子[38-40]。抗细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4 单克隆抗体伊匹单抗用于治疗晚期黑色素瘤取得成功后，免疫检查点抑制剂被应用于多种恶性肿瘤研究并用于临床[38-39, 41]。基于 CheckMate 017 和 CheckMate 057 的结果，抗程序性死亡蛋白-1 单克隆抗体纳武利尤单抗首先被美国和欧洲联盟等批准用于晚期非小细胞肺癌二线治疗[42-43]。而对于驱动基因阴性的晚期非小细胞肺癌，无论程序性死亡蛋白配体-1 的表达水平如何，抗程序性死亡蛋白-1 单克隆抗体帕博利珠单抗联合化学治疗是一线标准治疗；对程序性死亡蛋白配体-1 表达≥1% 的患者，帕博利珠单抗也是一线治疗药物[44-48]。但是，不同患者对免疫治疗的反应不同，经过临床验证，除程序性死亡蛋白配体-1 的表达情况外，还有很多潜在生物标志物可以预测免疫治疗的疗效，如肿瘤突变负荷[49]、微卫星高度不稳定及错配修复基因缺失[50]等，但均不是预测免疫治疗效果的理想指标。还需要进一步阐明免疫检查点抑制剂的反应机制和耐药机制，寻找新的生物标志物，精准预测获益人群，致力于精准免疫肿瘤学领域的发展。
随着特定微生物群落对正常免疫系统发育和药物作用影响的研究不断深入，微生物对于肿瘤免疫治疗的影响备受关注[51]。多项研究显示微生物菌群可以介导免疫治疗的不同反应，并可能作为潜在的治疗靶点和生物标志物[52-54]。一项研究分析了转移性黑色素瘤患者免疫治疗前的粪便样本，显示共生微生物组成与临床反应之间存在显著相关性，并且肿瘤缓解患者肠道中存在更为丰富的长双歧杆菌、屎肠球菌和产气柯林斯菌，用肿瘤缓解患者的粪便重建无菌小鼠可以增强 T 细胞反应，提高抗程序性死亡蛋白-1/程序性死亡蛋白配体-1 治疗的效果[52]。另一项研究表明，粪便菌群移植可以改善无菌或抗生素治疗的小鼠抗程序性死亡蛋白-1 的抗肿瘤效果，接受粪菌移植的无反应者的嗜黏蛋白-艾克曼菌增加[53]。此外，共生双歧杆菌通过调节树突状细胞的作用及一些细胞因子的释放，进而促进机体抗肿瘤反应，改变肠道微生物的组成并调节抗程序性死亡蛋白配体-1 治疗[54]。同时，多项关注抗生素使用的研究表明，抗生素对接受免疫检查点抑制剂的患者的预后造成了负面影响[55-60]。因此，无论是粪菌移植还是抗生素的使用，均提示微生物菌群组成与免疫治疗之间存在相关性，微生物菌群作为生物标志物预测免疫检查点抑制剂疗效有一定潜力。而另一项研究显示，在小鼠结肠炎模型中，双歧杆菌通过细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4 阻断减轻了免疫相关性结肠炎[61]，说明微生物菌群还可以作为免疫相关不良反应的调节因子。虽然上述研究大多集中于肠道微生态与免疫治疗，但随着肺微生态研究的不断深入，肺微生态对免疫治疗的价值会越来越被重视。
5 小结与展望
肺微生态与肺癌之间存在密切的联系，但还有很多问题尚待研究。肺微生态与肺部癌细胞之间的相互作用机制，以及远端肠道菌群和肺部菌群如何协同调节肺部肿瘤炎症过程和抗肿瘤免疫之间的平衡尚不清楚。肺微生态作为肺癌诊断标志物仍需要大样本的临床研究来证实。肺微生态如何预测免疫治疗的优势获益人群仍不明确。肺微生态与免疫治疗耐药之间的联系也需要进一步的研究。此外，肺微生态领域的研究还需要克服一些客观障碍，如下呼吸道取样的技术难度、健康肺中极低的细菌负荷量、样本极易被上呼吸道菌群污染以及缺乏研究肺微生态的动物模型等。另外，肺微生态的变化与年龄、性别、抗生素使用、吸烟、合并的其他呼吸系统疾病等众多因素有关，这也给肺微生态与肺癌相关的研究带来挑战。期待未来肺微生态与肺癌相关的基础与临床转化研究能为肺癌的诊疗提供新的思路和方法。