引用本文： 陈昱, 杨眉, 王蓉, 廖红艳, 毛志刚, 郑沁. BenchMark 全自动特殊染色机在肝脏穿刺活检网状纤维染色中的应用. 华西医学, 2020, 35(9): 1090-1093. doi: 10.7507/1002-0179.201912082 复制
目前，影像医学和血清学技术不断进步，促使肝脏疾病诊断准确性显著提高。但肝脏穿刺（肝穿）活检的形态病理学检查仍是诊断肝脏疾病的金标准[1]，它能检测出肝脏的炎症、肿瘤及纤维化程度，病理形态学苏木精-伊红染色结合特殊染色可对肝穿活检的诊断提供重要的形态学依据[2]。网状纤维染色是肝穿活检的一项重要特殊染色项目。网状纤维染色主要显示：① 肝小叶内肝板中的网状纤维支架分布及走向；② 肝细胞增生的结节及花结节周围包绕的网状纤维；③ 肝小叶界面网状纤维的塌陷程度及纤维间隔；④ 小叶结构紊乱的状况及严重程度。因此网状纤维染色在肝穿组织的临床诊断中具有重要意义[3]。网状纤维有多种染色方法，常见的有 Foot 染色法、改良 Gomori 网状纤维染色、Gordon-Sweet 染色法、网状纤维染色-渡边改良法等方法[3-6]。这些手工方法由于操作步骤繁琐，耗时长，易受操作人员工作经验、各环节染色时间难于精准控制等多因素干扰，易导致个别病例染色失败，需反复、多次染色[7-8]。为进一步改良染色效果，提高工作效率，本研究探索了 BenchMark 全自动特殊染色机在肝穿活检网状纤维染色中的应用效果，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源
回顾性连续选取四川大学华西医院 2019 年 4 月—5 月诊断明确的网状纤维染色阳性的肝穿标本 30 例。本研究经四川大学华西医院生物医学伦理委员会审查通过，批件号：2019 年审（977）号。
1.2 试剂
仪器法试剂：网状组织染色液（Reticulum II Staining Kit，美国 Ventana 医疗系统公司，批号：F02006，效期：2020-01-01）。手工法试剂：为本实验室根据 Foot 染色标准操作规程（standard operating procedure，SOP）的配方自行配制的试剂。
1.3 方法
所有标本分别按照下列条件进行预处理：4% 中性缓冲甲醛固定，全自动脱水机处理，石蜡包埋，选用黏附载玻片，切片厚度 5 μm，65℃ 烤箱烤片 30 min。预处理完成后切片一式两份，分别进行仪器法和手工法染色。
1.3.1 上机染色步骤
采用 BenchMark 全自动特殊染色机进行染色。步骤如下：① 烤片 65℃ 4 min，脱蜡 75℃ 20 min；② 加 300 μL 氧化剂，37℃ 8 min 后冲洗；③ 加 200 μL 漂白剂，37℃ 16 min 后冲洗；④ 加 300 μL 敏化剂，37℃ 8 min 后冲洗；⑤ 加 200 μL 银染液 A，37℃ 20 min 后冲洗；⑥ 加 200 μL 还原剂，37℃ 4 min 后冲洗；⑦ 加 200 μL 调色剂，37℃ 4 min 后冲洗；⑧ 加 200 μL 定影剂，37℃ 4 min 后冲洗；⑨ 加 200 μL 核固红染色液，4 min 后冲洗。后处理步骤：① 95% 乙醇脱水 2 min；② 无水乙醇脱水 5 min；③ 环保透明剂透明，中性树胶封片保存。
1.3.2 手工染色步骤
手工染色采用 Foot 染色法[9-10]，按照本室 SOP 进行操作：① 切片常规脱蜡至蒸馏水；② 加入 0.25% 高锰酸钾水溶液浸泡 5 min，蒸馏水冲洗 2～3 次；③ 5% 草酸水溶液浸洗，至漂白为止，流水充分冲洗，冲洗后蒸馏水洗 2～3 次；④ 浸入 2.5% 铁明矾 5 min，蒸馏水洗 2～3 次；⑤ 浸入新鲜配制的氨银液 5 min；⑥ 4% 中性缓冲甲醛溶液还原 2 min，蒸馏水洗 2～3 次；⑦ 0.25% 氯化金水溶液调色 4 min，流水冲洗；⑧ 浸入 5% 硫代硫酸钠水溶液 1～5 min，流水充分冲洗；⑨ 根据需要，可用 Van Gieson 染液、核固红等染液复染。后处理步骤：① 按照 65%、75%、85%、95% 的乙醇顺序依次脱水 1～2 s；② 无水乙醇脱水 5 min；③ 环保透明剂透明，中性树胶封片保存。
1.4 评价方法
两种方法染色完成后，均请有丰富阅片经验的主任病理医师在显微镜下观察、盲法评估染色效果。方法：① 染色成功：网状纤维呈黑色，背景呈红色，纤维清晰均匀，背景干净，无污染。② 染色欠佳（包括但不仅限于以下几项）：网状纤维断断续续，不连贯；只有背景染色和一些断裂的纤维；网状纤维断裂，染色呈点状分布，颜色较浅。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 21.0 软件进行统计分析。两种方法染色成功率的比较采用配对 χ2 检验（McNemar 法），双侧检验水准 α=0.05。
2 结果
BenchMark 特殊染色系统染色效果稳定可靠，30 例标本均染色成功（图1a），染色成功率 100.0%。手工染色稳定性稍差，30 例标本中，成功 23 例，染色成功率 76.7%；7 例染色效果欠佳，具体表现为网状纤维断裂、染色过浅（图1b～1d）。两种方法染色成功率差异有统计学意义（χ2=5.143，P=0.023）。
图1
两种方法进行肝穿组织网状纤维染色的效果（10×40）
a. 仪器染色，网状纤维呈黑色，背景染色呈红色，网状纤维排列连续；b. 手工染色，网状纤维断断续续，不连贯；c. 手工染色，仅见红色背景，偶见黑色网状纤维；d. 手工染色，网状纤维断裂，造成网状纤维呈点状分布
3 讨论
3.1 网状纤维染色的原理
网状纤维染色的原理是：氨银液易被组织内的网状纤维细胞吸附，而不易与其他细胞结合。氨银染液与组织的蛋白质结合后，经甲醛作用生成黑色或棕黑色的金属银，而沉积于组织内及其表面；再经氯化金调色后，用硫代硫酸钠溶液洗去组织上未还原的银盐，将组织内的网状纤维清晰显色。网状纤维染色可对临床肝脏疾病的诊断和治疗提供重要的形态学依据。因此做好一张完整而清晰的肝穿组织网状纤维染色是肝穿准确诊断的重要保障[9]。
3.2 影响仪器法网状纤维染色效果的因素
临床对肝脏穿刺组织的前处理不合规范，可能原因包括但不限于肝穿组织固定不及时、固定时间短，或是取材后在风力过大的通风系统中放置时间过久。这些因素可导致肝穿组织在网状纤维染色中出现银染过浅，网状纤维断裂，组织中部分银染色清晰、部分未着色等现象[11-12]。同时如果仪器染色条件设置不合理，或者仪器使用维护不当，也易造成染色失败。现笔者将多年的仪器使用经验分享如下。
3.2.1 清洗缓冲液
银染对清洗缓冲液的 pH 值要求非常严格，新配置的清洗缓冲液 pH 值>4.5，在装有缓冲液的大桶中放置 2～3 d 后，pH 值会随时间和温度等因素影响而下降，从而导致银染失败或是出现阴阳现象（组织半边有网状纤维半边只有背景染色）。针对这一现象我们必须严格执行如下步骤：① 新鲜配制的大桶中的清洗缓冲液最好在 2 d 内用完，每一次进行网状纤维染色前，必须将上机的缓冲试剂瓶中剩余的旧的清洗缓冲液倒去，然后加入新的清洗缓冲液；② 进行肝穿组织网状纤维染色时，机器上只使用一个缓冲试剂瓶，并且在每次染色之前对机器各管道进行一次净化清洗程序，以保证网状纤维染色的染色结果；③ 按照仪器操作手册，定期执行仪器的日、周、月维护保养程序；④ 定期清洗仪器管道，并消毒，至少每 3 个月进行 1 次，并填写清洗及消毒记录。
3.2.2 载玻片
质量良好的载玻片是保证仪器法染色质量的重要因素之一。若玻片表面涂层良好，清洗缓冲液在玻片表面会均匀散开；若玻片表面涂层不好，清洗缓冲液在玻片表面散开不均匀，也会导致染色液在载玻片上分布不均，使部分组织着色而部分组织未着色。因此，我科室在做肝穿网状纤维染色时使用黏附载玻片以保证染色质量[12]。
3.2.3 切片厚度
切片厚度也是影响肝穿组织网状纤维染色的重要因素[13]。仪器法肝穿组织网状纤维染色时，切片厚度必须≥5 μm；若切片厚度<5 μm，则染色结果不佳，会出现网状纤维断裂，组织中部分网状纤维染出，部分网状纤维未染出来的现象，或者是整张切片都未染出银染部分[13]。
3.2.4 银染色时间
银染色时间的长短影响肝穿组织网状纤维染色效果[14]。根据我室探索，仪器法银染时间以 20 min 为最佳，此条件下网状纤维染色清晰且分布均匀。银染时间过长易导致脱片，背景颜色较深，难以区分网状纤维和其他组织；银染时间较短易造成网状纤维染色浅且断断续续，或是呈点状分布。因此我们在肝穿组织网状纤维染色时宜选用最佳银染时间以保证染色的质量[15-16]。
3.3 影响手工法网状纤维染色效果的因素
手工法染色易受干扰，常见因素如下：① 试剂：手工法需多种试剂，大部分均需手工配制，难以标准化，质量难以保证；并且手工法部分试剂需回收使用，回收次数受标本量及操作者主观因素影响，均会影响染色效果。② 人员素质：手工染色易受操作者的染色经验、人员能力、操作手法等多因素的干扰。③ 染色程序标准化：操作过程难以完全标准化，并且易受外界因素干扰。
因此，肝穿组织的网状纤维染色需要我们从组织的前期处理开始，切片以及染色的每一步骤都要严格按照染色要求来完成，任何一个环节出现问题都会导致染色失败。BenchMark 全自动特殊染色机的染色稳定性及染色效果明显优于手工染色法，并且节约了实验室人力资源，提高了工作效率；但其对仪器的依赖程度高，试剂成本稍高于手工方法，限制了其在中小型病理科室的推广。无论何种方法，一张制备精良的肝穿纤维染色玻片才是临床肝穿准确诊断的重要依据，实验室可根据各自的实际情况，选择适合的方法。
目前，影像医学和血清学技术不断进步，促使肝脏疾病诊断准确性显著提高。但肝脏穿刺（肝穿）活检的形态病理学检查仍是诊断肝脏疾病的金标准[1]，它能检测出肝脏的炎症、肿瘤及纤维化程度，病理形态学苏木精-伊红染色结合特殊染色可对肝穿活检的诊断提供重要的形态学依据[2]。网状纤维染色是肝穿活检的一项重要特殊染色项目。网状纤维染色主要显示：① 肝小叶内肝板中的网状纤维支架分布及走向；② 肝细胞增生的结节及花结节周围包绕的网状纤维；③ 肝小叶界面网状纤维的塌陷程度及纤维间隔；④ 小叶结构紊乱的状况及严重程度。因此网状纤维染色在肝穿组织的临床诊断中具有重要意义[3]。网状纤维有多种染色方法，常见的有 Foot 染色法、改良 Gomori 网状纤维染色、Gordon-Sweet 染色法、网状纤维染色-渡边改良法等方法[3-6]。这些手工方法由于操作步骤繁琐，耗时长，易受操作人员工作经验、各环节染色时间难于精准控制等多因素干扰，易导致个别病例染色失败，需反复、多次染色[7-8]。为进一步改良染色效果，提高工作效率，本研究探索了 BenchMark 全自动特殊染色机在肝穿活检网状纤维染色中的应用效果，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源
回顾性连续选取四川大学华西医院 2019 年 4 月—5 月诊断明确的网状纤维染色阳性的肝穿标本 30 例。本研究经四川大学华西医院生物医学伦理委员会审查通过，批件号：2019 年审（977）号。
1.2 试剂
仪器法试剂：网状组织染色液（Reticulum II Staining Kit，美国 Ventana 医疗系统公司，批号：F02006，效期：2020-01-01）。手工法试剂：为本实验室根据 Foot 染色标准操作规程（standard operating procedure，SOP）的配方自行配制的试剂。
1.3 方法
所有标本分别按照下列条件进行预处理：4% 中性缓冲甲醛固定，全自动脱水机处理，石蜡包埋，选用黏附载玻片，切片厚度 5 μm，65℃ 烤箱烤片 30 min。预处理完成后切片一式两份，分别进行仪器法和手工法染色。
1.3.1 上机染色步骤
采用 BenchMark 全自动特殊染色机进行染色。步骤如下：① 烤片 65℃ 4 min，脱蜡 75℃ 20 min；② 加 300 μL 氧化剂，37℃ 8 min 后冲洗；③ 加 200 μL 漂白剂，37℃ 16 min 后冲洗；④ 加 300 μL 敏化剂，37℃ 8 min 后冲洗；⑤ 加 200 μL 银染液 A，37℃ 20 min 后冲洗；⑥ 加 200 μL 还原剂，37℃ 4 min 后冲洗；⑦ 加 200 μL 调色剂，37℃ 4 min 后冲洗；⑧ 加 200 μL 定影剂，37℃ 4 min 后冲洗；⑨ 加 200 μL 核固红染色液，4 min 后冲洗。后处理步骤：① 95% 乙醇脱水 2 min；② 无水乙醇脱水 5 min；③ 环保透明剂透明，中性树胶封片保存。
1.3.2 手工染色步骤
手工染色采用 Foot 染色法[9-10]，按照本室 SOP 进行操作：① 切片常规脱蜡至蒸馏水；② 加入 0.25% 高锰酸钾水溶液浸泡 5 min，蒸馏水冲洗 2～3 次；③ 5% 草酸水溶液浸洗，至漂白为止，流水充分冲洗，冲洗后蒸馏水洗 2～3 次；④ 浸入 2.5% 铁明矾 5 min，蒸馏水洗 2～3 次；⑤ 浸入新鲜配制的氨银液 5 min；⑥ 4% 中性缓冲甲醛溶液还原 2 min，蒸馏水洗 2～3 次；⑦ 0.25% 氯化金水溶液调色 4 min，流水冲洗；⑧ 浸入 5% 硫代硫酸钠水溶液 1～5 min，流水充分冲洗；⑨ 根据需要，可用 Van Gieson 染液、核固红等染液复染。后处理步骤：① 按照 65%、75%、85%、95% 的乙醇顺序依次脱水 1～2 s；② 无水乙醇脱水 5 min；③ 环保透明剂透明，中性树胶封片保存。
1.4 评价方法
两种方法染色完成后，均请有丰富阅片经验的主任病理医师在显微镜下观察、盲法评估染色效果。方法：① 染色成功：网状纤维呈黑色，背景呈红色，纤维清晰均匀，背景干净，无污染。② 染色欠佳（包括但不仅限于以下几项）：网状纤维断断续续，不连贯；只有背景染色和一些断裂的纤维；网状纤维断裂，染色呈点状分布，颜色较浅。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 21.0 软件进行统计分析。两种方法染色成功率的比较采用配对 χ2 检验（McNemar 法），双侧检验水准 α=0.05。
2 结果
BenchMark 特殊染色系统染色效果稳定可靠，30 例标本均染色成功（图1a），染色成功率 100.0%。手工染色稳定性稍差，30 例标本中，成功 23 例，染色成功率 76.7%；7 例染色效果欠佳，具体表现为网状纤维断裂、染色过浅（图1b～1d）。两种方法染色成功率差异有统计学意义（χ2=5.143，P=0.023）。
图1
两种方法进行肝穿组织网状纤维染色的效果（10×40）
a. 仪器染色，网状纤维呈黑色，背景染色呈红色，网状纤维排列连续；b. 手工染色，网状纤维断断续续，不连贯；c. 手工染色，仅见红色背景，偶见黑色网状纤维；d. 手工染色，网状纤维断裂，造成网状纤维呈点状分布
3 讨论
3.1 网状纤维染色的原理
网状纤维染色的原理是：氨银液易被组织内的网状纤维细胞吸附，而不易与其他细胞结合。氨银染液与组织的蛋白质结合后，经甲醛作用生成黑色或棕黑色的金属银，而沉积于组织内及其表面；再经氯化金调色后，用硫代硫酸钠溶液洗去组织上未还原的银盐，将组织内的网状纤维清晰显色。网状纤维染色可对临床肝脏疾病的诊断和治疗提供重要的形态学依据。因此做好一张完整而清晰的肝穿组织网状纤维染色是肝穿准确诊断的重要保障[9]。
3.2 影响仪器法网状纤维染色效果的因素
临床对肝脏穿刺组织的前处理不合规范，可能原因包括但不限于肝穿组织固定不及时、固定时间短，或是取材后在风力过大的通风系统中放置时间过久。这些因素可导致肝穿组织在网状纤维染色中出现银染过浅，网状纤维断裂，组织中部分银染色清晰、部分未着色等现象[11-12]。同时如果仪器染色条件设置不合理，或者仪器使用维护不当，也易造成染色失败。现笔者将多年的仪器使用经验分享如下。
3.2.1 清洗缓冲液
银染对清洗缓冲液的 pH 值要求非常严格，新配置的清洗缓冲液 pH 值>4.5，在装有缓冲液的大桶中放置 2～3 d 后，pH 值会随时间和温度等因素影响而下降，从而导致银染失败或是出现阴阳现象（组织半边有网状纤维半边只有背景染色）。针对这一现象我们必须严格执行如下步骤：① 新鲜配制的大桶中的清洗缓冲液最好在 2 d 内用完，每一次进行网状纤维染色前，必须将上机的缓冲试剂瓶中剩余的旧的清洗缓冲液倒去，然后加入新的清洗缓冲液；② 进行肝穿组织网状纤维染色时，机器上只使用一个缓冲试剂瓶，并且在每次染色之前对机器各管道进行一次净化清洗程序，以保证网状纤维染色的染色结果；③ 按照仪器操作手册，定期执行仪器的日、周、月维护保养程序；④ 定期清洗仪器管道，并消毒，至少每 3 个月进行 1 次，并填写清洗及消毒记录。
3.2.2 载玻片
质量良好的载玻片是保证仪器法染色质量的重要因素之一。若玻片表面涂层良好，清洗缓冲液在玻片表面会均匀散开；若玻片表面涂层不好，清洗缓冲液在玻片表面散开不均匀，也会导致染色液在载玻片上分布不均，使部分组织着色而部分组织未着色。因此，我科室在做肝穿网状纤维染色时使用黏附载玻片以保证染色质量[12]。
3.2.3 切片厚度
切片厚度也是影响肝穿组织网状纤维染色的重要因素[13]。仪器法肝穿组织网状纤维染色时，切片厚度必须≥5 μm；若切片厚度<5 μm，则染色结果不佳，会出现网状纤维断裂，组织中部分网状纤维染出，部分网状纤维未染出来的现象，或者是整张切片都未染出银染部分[13]。
3.2.4 银染色时间
银染色时间的长短影响肝穿组织网状纤维染色效果[14]。根据我室探索，仪器法银染时间以 20 min 为最佳，此条件下网状纤维染色清晰且分布均匀。银染时间过长易导致脱片，背景颜色较深，难以区分网状纤维和其他组织；银染时间较短易造成网状纤维染色浅且断断续续，或是呈点状分布。因此我们在肝穿组织网状纤维染色时宜选用最佳银染时间以保证染色的质量[15-16]。
3.3 影响手工法网状纤维染色效果的因素
手工法染色易受干扰，常见因素如下：① 试剂：手工法需多种试剂，大部分均需手工配制，难以标准化，质量难以保证；并且手工法部分试剂需回收使用，回收次数受标本量及操作者主观因素影响，均会影响染色效果。② 人员素质：手工染色易受操作者的染色经验、人员能力、操作手法等多因素的干扰。③ 染色程序标准化：操作过程难以完全标准化，并且易受外界因素干扰。
因此，肝穿组织的网状纤维染色需要我们从组织的前期处理开始，切片以及染色的每一步骤都要严格按照染色要求来完成，任何一个环节出现问题都会导致染色失败。BenchMark 全自动特殊染色机的染色稳定性及染色效果明显优于手工染色法，并且节约了实验室人力资源，提高了工作效率；但其对仪器的依赖程度高，试剂成本稍高于手工方法，限制了其在中小型病理科室的推广。无论何种方法，一张制备精良的肝穿纤维染色玻片才是临床肝穿准确诊断的重要依据，实验室可根据各自的实际情况，选择适合的方法。
