临床上，骨折不愈合常导致患者遭受疼痛的困扰甚至残疾，而且往往需要额外的手术治疗来恢复骨骼肌肉功能，因此骨折不愈合的治疗一直是骨科领域的难点。近些年，随着基因工程的发展，利用基因治疗骨折不愈合的技术得以广泛研究。大量实验证实，将编码骨折愈合相关生长因子的目的基因通过体内或体外不同的传递方式导入至靶细胞，从而表达出特定的生长因子，可以促进骨折修复，这为治疗骨折不愈合提供了新途径。该文将讨论成骨基因不同传递方式的研究现状，以及各自的优缺点，旨在为目的基因治疗骨折不愈合提供理论基础。
引用本文： 王宁, 陈俊毅, 朱伦井, 段江涛, 彭称飞, 贝朝涌. 目的基因治疗骨折不愈合的研究进展. 华西医学, 2020, 35(1): 89-92. doi: 10.7507/1002-0179.201910049 复制
骨折不愈合即骨折超过预期时间没有愈合，其发生率目前估计为 4.9%[1]。骨折不愈合常与患者多发性骨折、使用非甾体抗炎药、使用阿片类药物、开放性骨折、骨关节炎合并类风湿关节炎等有关[2]。临床上，骨折不愈合常使患者经历更多疼痛，导致残疾、医疗费用增加以及劳动力恢复缓慢[3]，所以其治疗一直是国内外骨科领域的热点。自体松质骨移植目前被认为是治疗骨折不愈合的最佳选择[4]，但存在疼痛、出血、感染和取材方面的限制；而异体骨移植替代物可能导致移植失败、感染、免疫反应以及成本增加等问题[5]，这些风险提示需要新的骨折愈合策略。近些年来，生长因子促进骨折修复一直是研究热点，但外源性生长因子制备困难、存在副反应等限制了其应用[6]。而通过将编码生长因子的相关基因经体内或体外的方式导入靶细胞，从而表达出生长因子蛋白治疗骨折不愈合的方法得到了广泛的研究，包括病毒传递、非病毒传递、基因活化基质（gene-activated matrix，GAM）与基因工程疗法。在这篇综述中，我们将讨论成骨基因不同传递方式的研究现状，以及各自的优缺点，旨在为目的基因治疗骨折不愈合提供理论基础。
1 体内导入
1.1 病毒基因传递
病毒自身 DNA 片段可以被目的基因所取代，病毒具有将基因转移至靶细胞的能力。目前使用病毒载体进行的实验已经超过 1 200 项[7]，使用的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒载体等[8]，这些载体通过传递不同的目的基因来诱导体内成骨[9-12]。目前的实验研究中，腺病毒载体由于其毒性低、制备简单、瞬时高表达的特点而被广泛应用在基因治疗中[8]。Liu 等[13]用携带绵羊骨骼肌骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2 基因的腺病毒载体转染在大鼠的颅骨缺损中，得到了良好的新生骨组织，说明了腺病毒转染治疗骨缺损能够获得长期稳定表达。腺病毒载体介导的转染已用于研究多种生长因子的联合疗法，其中就包括 Seamon 等[14]的研究将血管内皮生长因子基因和 BMP-6 基因传递至大鼠骨髓间充质干细胞促进成骨。目前腺病毒转染成骨也运用在大型动物上，同样获得了良好的成骨效应[15]。除此之外，腺相关病毒载体具有无致病性、能长期表达、能感染多种细胞等优点，被广泛用于基因载体[8]。甚至有学者将其拓展到成骨两阶段的研究[16]。但是，在病毒介导的成骨研究方面，转染基因的大小与数目是否受到病毒本身携带能力的限制却鲜有报道。逆转录病毒在用于成骨研究时，其安全性饱受诟病，免疫反应、潜在的致癌性被激活等都大大限制了其广泛应用[17]。为了提高安全性，Alaee 等[18]应用自杀基因的方法提高了 BMP-2 的安全性，基于该研究，使用自杀基因的方法使治疗后有害物质残留减少是很有前景的。
1.2 非病毒基因传递
非病毒载体包括化学和物理传递方法。化学方法主要依赖于与 DNA 络合的阳离子聚合物或脂质体、质粒等，以减少其细胞膜的电化学排斥。脂质体介导的基因转染技术日趋成熟，例如陈宁等[19]应用双基因（神经生长因子基因和 BMP-2 基因）真核质粒脂质体介导转染大鼠骨髓间充质干细胞促进了成骨细胞分化。最近一项双基因对比转染的研究显示，脂质体介导的基因转染操作相对简便，成本相对低廉，比病毒更容易构建，但转染效率明显低于慢病毒且转染后稳定表达能力较弱[20]。物理方法则包括电穿孔和超声波穿孔，它们分别使用电能和机械能在细胞膜上形成允许外源 DNA 导入的透明孔。如 Kimelman-Bleich 等[21]等首次表明成骨基因电穿孔可以治疗骨缺损。而对于基于超声技术的基因传递，Shapiro 等[22]等成功用超声介导的转基因募集到骨损伤部位。这些研究都表明超声波传递基因安全性高，但效率却不太显著。近年来，有关超声造影剂靶向运载药物日益增多，该方法通过调整微泡本身的特性，可将治疗性基因整合于微泡中。如 Bez 等[23]使用微泡增强超声波转染内源性间充质干细胞以表达 BMP-6，使猪的骨折愈合，暴露出来的问题是操作较为麻烦。这些方法虽然被认为相比病毒方法具有低免疫原性，却目前只是停留在大型动物的基础研究上，面对其效率低、表达时间不足、保存困难等问题仍需进一步寻找理想的解决办法。
1.3 GAM
与 DNA 被细胞外 DNA 酶快速降解的大多数物理基因递送方法不同，GAM 是一种负载细胞因子的细胞支架或者细胞外支架，允许基因可控制地、缓慢地释放到周围细胞。GAM 的优势在于当种子细胞（包括成骨细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等）自分泌或者旁分泌、增殖与分化作用时，其可提供骨传导作用，甚至骨诱导三维环境，也能够在再生过程中提供机械支持，使种子细胞与 GAM 形成细胞支架复合体，从而高效地修复骨组织损伤；缺点则是这种机械支持既没有神经也没有血管。Fang 等[24]首次将 GAM 用于体内骨再生，使用胶原支架和两种不同的成骨质粒刺激新骨形成。为了提高转染率，D’Mello 等[25]用双基因进行研究，即编码血管内皮生长因子基因和血小板衍生生长因子基因的聚乙烯亚胺-质粒 DNA 复合物的组合同时递送用于颅骨缺损骨再生的初步研究，结果表明其目的成骨基因能够在体内稳定、高效、持续表达。关于 GAM 的第 1 个临床应用于 2016 年发表，Bozo 等[26]将胶原羟基磷灰石支架和编码血管内皮生长因子的质粒 DNA 植入患有自体骨移植重建下颌骨骨不连的患者体内，在 1 年的随访中，发现了骨组织再生，且没有观察到不良事件。这项研究随访时间并不长，对于 GAM 在临床患者中应用是否能达到预期的高效持久、稳定安全，则需要更长时间的随访来确定这种持续的表达随时间跨度是否可变，同时应该考虑是否具有临床适用性（如治疗胫骨下端缺损以提供负重作用）。随着越来越多的治疗基因、载体、支架及其组合的发掘[27-29]，现阶段需要更多试验来研究揭示它们在复杂、高度调节中协同促进骨愈合的安全性及有效性。
2 基因工程细胞
物理基因传递、GAM 和病毒载体传递基因是体内传递的形式，而基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞（包括自体或同种异体细胞）内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物（生长因子和转录因子等）。基因工程细胞虽然更为复杂，但被认为更安全，因为它能更好地控制转染过程，并且可直接引入参与修复缺损的细胞。Turgeman 等[30]早期的研究以人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cell，hMSC）在培养基中扩增，并用编码成骨因子人 BMP-2 的重组腺病毒载体转染，在体外和体内评估基因工程 hMSC 的成骨潜力，结果基因工程 hMSC 在培养中显示出持久增殖和成骨分化的能力。在体内，移植的基因工程 hMSC 能够在异位部位移植并形成骨和软骨，重要的是，从患有骨质疏松症的患者中分离出的 hMSC 获得了相同的结果[31]，这代表了骨骼基因治疗的新平台。为了提高骨髓间充质干细胞移植的治疗效果，Yanagihara 等[32]将三维球形培养系统与基因转染技术结合，研究以编码 Runt 相关转录因子 2 的质粒 DNA 转染骨髓间充质干细胞球体移植治疗骨缺损，观察到了持久稳定的骨再生。从这些研究来看，基因工程细胞治疗骨缺损目的性更强，也同样需要复杂的操作。目前，基因工程也已经用于研究大型动物模型的骨折愈合[33]。
3 问题与展望
骨再生的基因治疗在过去突飞猛进，研究人员也在不断推动及发现新的治疗基因、载体、支架等，目前已经在体内和体外进行了严格的研究。一方面，虽然已发布了很多方法，但哪些可以转化为临床试验却难以确定。另一方面，这些丰富的研究信息使得需要对比性研究，但目前这样的研究甚少。若要克服这些棘手的问题，研究人员不仅要面对科学挑战，而且要面对像外源基因能否在体内稳定而持续地表达、是否会产生免疫反应等一系列问题。
迄今为止，通过不同的基因传递，大量基因和细胞已被研究和证明能用于骨再生，但仍没有一种单一的方式能够作为治疗骨缺损的最佳方法。目前越来越多关于基因治疗骨缺损的研究已发布，但大都仍处于对不同动物模型的基础研究阶段，且部分研究者并未严格控制动物模型中动物的年龄、性别、食物等混杂因素。在临床前研究中需应用更严格的标准，并推动有前景的方法转化为临床应用，这将有利于患者和整个社会。
骨折不愈合即骨折超过预期时间没有愈合，其发生率目前估计为 4.9%[1]。骨折不愈合常与患者多发性骨折、使用非甾体抗炎药、使用阿片类药物、开放性骨折、骨关节炎合并类风湿关节炎等有关[2]。临床上，骨折不愈合常使患者经历更多疼痛，导致残疾、医疗费用增加以及劳动力恢复缓慢[3]，所以其治疗一直是国内外骨科领域的热点。自体松质骨移植目前被认为是治疗骨折不愈合的最佳选择[4]，但存在疼痛、出血、感染和取材方面的限制；而异体骨移植替代物可能导致移植失败、感染、免疫反应以及成本增加等问题[5]，这些风险提示需要新的骨折愈合策略。近些年来，生长因子促进骨折修复一直是研究热点，但外源性生长因子制备困难、存在副反应等限制了其应用[6]。而通过将编码生长因子的相关基因经体内或体外的方式导入靶细胞，从而表达出生长因子蛋白治疗骨折不愈合的方法得到了广泛的研究，包括病毒传递、非病毒传递、基因活化基质（gene-activated matrix，GAM）与基因工程疗法。在这篇综述中，我们将讨论成骨基因不同传递方式的研究现状，以及各自的优缺点，旨在为目的基因治疗骨折不愈合提供理论基础。
1 体内导入
1.1 病毒基因传递
病毒自身 DNA 片段可以被目的基因所取代，病毒具有将基因转移至靶细胞的能力。目前使用病毒载体进行的实验已经超过 1 200 项[7]，使用的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒载体等[8]，这些载体通过传递不同的目的基因来诱导体内成骨[9-12]。目前的实验研究中，腺病毒载体由于其毒性低、制备简单、瞬时高表达的特点而被广泛应用在基因治疗中[8]。Liu 等[13]用携带绵羊骨骼肌骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2 基因的腺病毒载体转染在大鼠的颅骨缺损中，得到了良好的新生骨组织，说明了腺病毒转染治疗骨缺损能够获得长期稳定表达。腺病毒载体介导的转染已用于研究多种生长因子的联合疗法，其中就包括 Seamon 等[14]的研究将血管内皮生长因子基因和 BMP-6 基因传递至大鼠骨髓间充质干细胞促进成骨。目前腺病毒转染成骨也运用在大型动物上，同样获得了良好的成骨效应[15]。除此之外，腺相关病毒载体具有无致病性、能长期表达、能感染多种细胞等优点，被广泛用于基因载体[8]。甚至有学者将其拓展到成骨两阶段的研究[16]。但是，在病毒介导的成骨研究方面，转染基因的大小与数目是否受到病毒本身携带能力的限制却鲜有报道。逆转录病毒在用于成骨研究时，其安全性饱受诟病，免疫反应、潜在的致癌性被激活等都大大限制了其广泛应用[17]。为了提高安全性，Alaee 等[18]应用自杀基因的方法提高了 BMP-2 的安全性，基于该研究，使用自杀基因的方法使治疗后有害物质残留减少是很有前景的。
1.2 非病毒基因传递
非病毒载体包括化学和物理传递方法。化学方法主要依赖于与 DNA 络合的阳离子聚合物或脂质体、质粒等，以减少其细胞膜的电化学排斥。脂质体介导的基因转染技术日趋成熟，例如陈宁等[19]应用双基因（神经生长因子基因和 BMP-2 基因）真核质粒脂质体介导转染大鼠骨髓间充质干细胞促进了成骨细胞分化。最近一项双基因对比转染的研究显示，脂质体介导的基因转染操作相对简便，成本相对低廉，比病毒更容易构建，但转染效率明显低于慢病毒且转染后稳定表达能力较弱[20]。物理方法则包括电穿孔和超声波穿孔，它们分别使用电能和机械能在细胞膜上形成允许外源 DNA 导入的透明孔。如 Kimelman-Bleich 等[21]等首次表明成骨基因电穿孔可以治疗骨缺损。而对于基于超声技术的基因传递，Shapiro 等[22]等成功用超声介导的转基因募集到骨损伤部位。这些研究都表明超声波传递基因安全性高，但效率却不太显著。近年来，有关超声造影剂靶向运载药物日益增多，该方法通过调整微泡本身的特性，可将治疗性基因整合于微泡中。如 Bez 等[23]使用微泡增强超声波转染内源性间充质干细胞以表达 BMP-6，使猪的骨折愈合，暴露出来的问题是操作较为麻烦。这些方法虽然被认为相比病毒方法具有低免疫原性，却目前只是停留在大型动物的基础研究上，面对其效率低、表达时间不足、保存困难等问题仍需进一步寻找理想的解决办法。
1.3 GAM
与 DNA 被细胞外 DNA 酶快速降解的大多数物理基因递送方法不同，GAM 是一种负载细胞因子的细胞支架或者细胞外支架，允许基因可控制地、缓慢地释放到周围细胞。GAM 的优势在于当种子细胞（包括成骨细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等）自分泌或者旁分泌、增殖与分化作用时，其可提供骨传导作用，甚至骨诱导三维环境，也能够在再生过程中提供机械支持，使种子细胞与 GAM 形成细胞支架复合体，从而高效地修复骨组织损伤；缺点则是这种机械支持既没有神经也没有血管。Fang 等[24]首次将 GAM 用于体内骨再生，使用胶原支架和两种不同的成骨质粒刺激新骨形成。为了提高转染率，D’Mello 等[25]用双基因进行研究，即编码血管内皮生长因子基因和血小板衍生生长因子基因的聚乙烯亚胺-质粒 DNA 复合物的组合同时递送用于颅骨缺损骨再生的初步研究，结果表明其目的成骨基因能够在体内稳定、高效、持续表达。关于 GAM 的第 1 个临床应用于 2016 年发表，Bozo 等[26]将胶原羟基磷灰石支架和编码血管内皮生长因子的质粒 DNA 植入患有自体骨移植重建下颌骨骨不连的患者体内，在 1 年的随访中，发现了骨组织再生，且没有观察到不良事件。这项研究随访时间并不长，对于 GAM 在临床患者中应用是否能达到预期的高效持久、稳定安全，则需要更长时间的随访来确定这种持续的表达随时间跨度是否可变，同时应该考虑是否具有临床适用性（如治疗胫骨下端缺损以提供负重作用）。随着越来越多的治疗基因、载体、支架及其组合的发掘[27-29]，现阶段需要更多试验来研究揭示它们在复杂、高度调节中协同促进骨愈合的安全性及有效性。
2 基因工程细胞
物理基因传递、GAM 和病毒载体传递基因是体内传递的形式，而基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞（包括自体或同种异体细胞）内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物（生长因子和转录因子等）。基因工程细胞虽然更为复杂，但被认为更安全，因为它能更好地控制转染过程，并且可直接引入参与修复缺损的细胞。Turgeman 等[30]早期的研究以人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cell，hMSC）在培养基中扩增，并用编码成骨因子人 BMP-2 的重组腺病毒载体转染，在体外和体内评估基因工程 hMSC 的成骨潜力，结果基因工程 hMSC 在培养中显示出持久增殖和成骨分化的能力。在体内，移植的基因工程 hMSC 能够在异位部位移植并形成骨和软骨，重要的是，从患有骨质疏松症的患者中分离出的 hMSC 获得了相同的结果[31]，这代表了骨骼基因治疗的新平台。为了提高骨髓间充质干细胞移植的治疗效果，Yanagihara 等[32]将三维球形培养系统与基因转染技术结合，研究以编码 Runt 相关转录因子 2 的质粒 DNA 转染骨髓间充质干细胞球体移植治疗骨缺损，观察到了持久稳定的骨再生。从这些研究来看，基因工程细胞治疗骨缺损目的性更强，也同样需要复杂的操作。目前，基因工程也已经用于研究大型动物模型的骨折愈合[33]。
3 问题与展望
骨再生的基因治疗在过去突飞猛进，研究人员也在不断推动及发现新的治疗基因、载体、支架等，目前已经在体内和体外进行了严格的研究。一方面，虽然已发布了很多方法，但哪些可以转化为临床试验却难以确定。另一方面，这些丰富的研究信息使得需要对比性研究，但目前这样的研究甚少。若要克服这些棘手的问题，研究人员不仅要面对科学挑战，而且要面对像外源基因能否在体内稳定而持续地表达、是否会产生免疫反应等一系列问题。
迄今为止，通过不同的基因传递，大量基因和细胞已被研究和证明能用于骨再生，但仍没有一种单一的方式能够作为治疗骨缺损的最佳方法。目前越来越多关于基因治疗骨缺损的研究已发布，但大都仍处于对不同动物模型的基础研究阶段，且部分研究者并未严格控制动物模型中动物的年龄、性别、食物等混杂因素。在临床前研究中需应用更严格的标准，并推动有前景的方法转化为临床应用，这将有利于患者和整个社会。