结核病诊断延迟及耐药性结核病是对全球结核病疾病控制的巨大威胁，早期发现活动性结核，特别是耐药结核分枝杆菌的检出非常必要。该文着重阐述了分子诊断技术在结核分枝杆菌、耐药结核分枝杆菌的快速检测中的应用现状，并结合结核分枝杆菌的临床检测疑难问题，探讨了现有分子诊断技术的表现能力，以期为未来结核病的诊断提供理论思考。
引用本文： 焦琳, 李靖, 应斌武. 结核分枝杆菌的分子诊断进展. 华西医学, 2019, 34(8): 839-843. doi: 10.7507/1002-0179.201907093 复制
由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的结核病是全世界十大死因之一，也是最大的单一感染性病原体引发致死的疾病。2018 年，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）统计报告显示，全球新发结核病患者 1 000 万例，多集中在非洲国家、印度、印度尼西亚和中国等中等发达国家和欠发达国家[1]。在这些高负担国家，每 10 万人口中新增结核病病例为 150～400 人[1]。更严峻的是，在结核病患者中，还有 55.8 万人对利福平（rifampin，RIF）耐药，其中 82% 为多重耐药结核病例[1]。活动性结核的早期诊断，特别是对多耐药和泛耐药 MTB 的检测是实施有效治疗及公共卫生干预措施的必要前提。目前，实验室诊断主要依赖涂片染色镜检法和 MTB 培养等传统实验室检验方法。涂片染色镜检法存在阳性率低、操作复杂、技术要求高等缺点，MTB 培养亦存在污染率高、检测时间长等不足，致使全球近一半的结核病例不能通过实验室确认，诊断延迟。随着分子生物学的不断发展，快速分子诊断技术在结核病早期诊断方面的应用不断增加，许多国家正在逐步降低对传统痰涂片染色显微镜检验的依赖。本文将围绕 MTB 分子诊断方法的应用现状和前景进行评述。
1 MTB的实验室检查现状
MTB 的常规实验室检查方法为涂片染色镜检、分枝杆菌培养和核酸扩增试验。分枝杆菌涂片染色镜检有 2 种，即 Ziehl-Neelsen 抗酸染色法和荧光染色法。抗酸染色法简单经济、特异性高，但其检测限为每毫升未灭活痰涂片 5 000～10 000 个杆菌[2]，其灵敏度为 20%～80%[3-4]，尤其是对于儿童肺结核、肺外结核、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）共感染等少菌性结核病例的灵敏度低[5]。荧光染色法使 MTB 在显微镜下呈现亮黄色而易于分辨，操作简单且具有检出迅速、阳性率高的优点，在少菌性结核标本中更能够体现出优越性；但该法必须在暗室或远离窗口的位置操作，且维修成本较高昂，限制了其在实验室诊断中的广泛使用。MTB 培养是结核病实验室诊断的金标准。但是 MTB 对营养的要求高，需要使用特定的培养基。基于液体培养的快速培养系统有 BACTEC 460 系统、BACTEC MGIT 960 系统、MB Redox 系统等，分离率高于固体培养 Löwenstein-Jensen 法，报告时间大大缩短，对肺外标本如脑脊液等有明显优势。但 MTB 培养法仍有一些缺点阻碍了其作为结核病实验室诊断的常规检测，例如存在假阳性，需要专门的基础设施、设备和人员，需要维持适当的生物安全等级，需要不间断供电，等等。核酸扩增的引入促进了 MTB 诊断的巨大进步。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增特异性区域碱基序列被认为是鉴定分枝杆菌的金标准，16S 核糖体 RNA（ribosomal RNA，rRNA）是最常见的靶标。第一批商品化 PCR 方法的 MTB 鉴定试剂盒包括 COBAS Amplicor MTB 试剂盒、LCx MTB 试剂盒、BD ProbeTec 能量转移系统等。然而，这些方法不能同时兼具使用方便性和经济实惠性，因此无法完全满足结核病实验室诊断的临床需求。
2 MTB分子诊断技术现状
2.1 分子线性探针技术（molecular line probe assay，LPA）
LPA 是近年来兴起的一种 PCR 技术，用生物素化的引物进行 PCR 扩增，与固定在膜上的特异性 DNA 探针杂交后进行酶联免疫比色检测，可用于 MTB 培养物、痰涂片标本及药物耐药突变检测。
2.1.1 INNO-LiPA
INNO-LiPA 法是最早应用于临床的 LPA，于 1995 年由比利时 Innogenetics 公司提出，可用于 MTB DNA 和 RIF 耐药检测。该技术基于对 16S 和 23S rRNA 片段的扩增，可以识别 MTB 和 16 种非结核分枝杆菌，从采集样本到出结果需要 24～48 h。2008 年，WHO 批准将 INNO-LiPA 作为痰涂片阳性的多耐药结核病患者的快速筛选。INNO-LiPA 检测 RIF 耐药可预测 85%～90% 的多耐药结核[6]，灵敏度和特异度分别为 95% 和 100%[7]。尽管表现如此优异，手动操作、出报告周期长也限制了其在临床的应用。
2.1.2 GenoType
GenoType 是由德国 Hain Lifescience 公司研制的检测 MTB DNA 和一线、二线药物耐药突变的方法。2004 年推出的 GenoType MTBDR 产品（简称 MTBDR），存在 2 个主要不足：一是与表型药敏试验相比，虽然 MTBDR 对 RIF 耐药检测灵敏度较高，但对异烟肼（isoniazid，INH）耐药的灵敏度偏低，灵敏度分别为 99% 和 88.4%[8]。二是 MTBDR 与 INNO-LiPA 是基于同样的原理，同样存在出报告周期长（24～48 h）的问题。GenoType 系列第二类产品 GenoType MTBDRplus 于 2007 年推出。MTBDRplus 除可以检测 MTB DNA 及 RIF 耐药外，还可检测低水平 INH 耐药，增加了耐多药结核病的检出率[9]。有研究统计，MTBDRplus 2.0 对 RIF 耐药检测的灵敏度和特异度分别为 98.1% 和 98.7%，而对 INH 耐药的灵敏度会根据标本类型发生变化，波动范围在 57%～100%[7]。MTBDRplus2.0 在 1.0 基础上作了更新，扩增试剂例如 Taq 聚合酶和引物已经事先混合好，不再需要单独配制，且可直接检测痰涂片阴性标本。但两者在出报告周期上是一样的。GenoType 系列第三类产品 MTBDRsl 的原理与前两类相同，但主要是针对二线药物耐药基因的检测。与 MTBDRsl 1.0 相比，MTBDRsl 2.0 的灵敏度和特异度都有上升，对喹诺酮类药物、氨基糖苷类药物和卡那霉素药物的灵敏度分别为 93%～100%、83.0%～91.3% 和 89.2%～96.0%，特异度分别为 98.4%、91.7%～100.0% 和 92.2%～98.5%[10-12]。WHO 于 2016 年批准 MTBDRsl 可用于检测 MTB 培养物和痰标本，且不区分是来自痰涂片阴性或者阳性、来自肺或肺外组织的患者。然而，由于对痰涂片阴性病例的检测不确定率高、对氟喹诺酮类和二线氨基糖苷类药物检测的准确性不同等原因，MTBDRsl 整体准确性降低。
2.2 Xpert MTB/RIF技术
2009 年一种由美国 Cepheid 公司开发的新型分子生物检测方法 GeneXpert-MTB/RIF（简称 Xpert）开始应用于结核病诊断和药物耐药性检测[13]。Xpert 检测方法依靠全自动 GeneXpert 平台，以巢式实时定量荧光 PCR 为基础，以 rpoB 基因为靶基因，自动提取 DNA 并扩增，实现对 MTB DNA 及 RIF 耐药性的检测。Xpert 系统无需生物安全实验室，结果由系统自动生成，不需要工作人员的处理，报告周期仅为 2 h[14-16]。Xpert 可以直接应用于未灭活或灭活了的呼吸道样品、脑脊液、淋巴结组织、胸膜液、尿液等[17]。2013 年，Xpert 获得美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于结核病的诊断和 RIF 耐药检测，对肺外结核和儿童结核也适用。Cocharane 提供 Xpert 诊断结核的灵敏度和特异度分别为 89% 和 99%，且对 HIV 共感染患者的灵敏度为 79%，低于非共感染患者的 86%[18]。Xpert 诊断肺外结核的灵敏度和特异度分别为 43.7%～84.9% 和 92.5%～99.9%[19]。尽管 Xpert 表现优异，复杂的临床情况也对 Xpert 提出更高要求：在混合样本中提高对 RIF 耐药的检测能力；降低对少菌型样本的假阳性。
Xpert MTB/RIF Ultra（简称 Xpert Ultra）的出现是在 Xpert 的基础上作的进一步改进，两者采用相同的操作和试剂，可以在同一部仪器中运行，而 Xpert Ultra 只需要额外更新一个软件。Xpert Ultra 与 Xpert 相比，假阴性率降低。以培养法为金标准，Xpert Ultra 的灵敏度（87.7%）高于 Xpert（82.9%），特异度（94.8%）低于 Xpert（98%）[20]。Xpert Ultra 还提高了对少菌型样本的灵敏度，研究显示，Xpert Ultra 对少菌型结核的灵敏度（87.8%）较 Xpert 升高（82.9%），但特异度降低（94.8% vs. 98%）[20-21]。不仅如此，Xpert Ultra 还对混合样本中 RIF 耐药的检出率进行了提升，引物对突变的覆盖度也作了修改[22]。对 RIF 耐药突变的检测，Xpert Ultra 和 Xpert 的准确度相似[22-23]。2017 年 WHO 推荐 Xpert Ultra 可取代 Xpert 用于结核病诊断和 RIF 耐药检测。值得注意的是，Xpert Ultra 在儿童结核中并不能取代 MTB 培养作为主要诊断方法[24]。
3 新兴结核分子诊断技术
3.1 恒温扩增检测技术
由日本 Eiken Chemical 公司开发的 Loopamp MTB 检测试剂盒，使用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），仅需要 1～2 h 即可完成对多种分枝杆菌的鉴定。该技术简单快速、携带方便、试剂成本经济实惠、对生物安全等级和基础设施的要求低。但 LAMP 的缺点也明显，如高温、高湿度、试剂体积不足和样品间交叉污染会导致假阳性率升高[25]。LAMP 法有多个扩增位点，对 IS6110 位点的灵敏度和特异度尤其突出，因此，LAMP 法可对未经处理的痰涂片标本进行 IS6110 和 gyrB 基因的检测[26]。2016 年，WHO 推荐将 LAMP 方法作为除了痰涂片染色镜检以外的可选方法，LAMP 法也将成为资源较差地区对肺结核诊断的主要方法。
3.2 FluoroType MTBDR
FluoroType MTBDR 是由德国 Hain Lifescience 公司开发的一种半自动的，对呼吸道和非呼吸道标本进行 MTB 快速诊断和对 RIF、INH 耐药突变检测的方法。该方法将不对称 PCR 扩增与使用光学调控开关技术的特定探针组合在一起[27]，通过一台 FluoroCycler96 仪器就可以完成对 96 个样本的扩增和检测，检测周期只需要 3～4 h。由于全过程在密闭的空间中进行，该方法减少了实验员的操作误差。研究者发现，与表型药敏试验相比，FluoroType MTBDR 对 RIF 和 INH 的灵敏度分别为 91.7% 和 98.9%，特异度均为 100%[28]。
3.3 RealTime MTB RIF/INH耐药性测定
RealTime MTB RIF/INH 耐药性测定是美国 Abbott 公司开发的用于检测呼吸道样本 RIF 和 INH 耐药位点的方法。RealTime MTB RIF/INH 与 RealTime MTB 是相互独立的，但都依赖高通量 m2000 全自动系统。RealTime MTB 单次最多检测 96 个样本，待检测出 MTB 阳性样本后，RealTime MTB RIF/INH 可继续检测耐药位点，单次最多检测 24 个样本。其在痰涂片阳性和阴性的呼吸道样品中均显示出对 RIF 耐药突变检测较高的灵敏度（87.5%～96.3%）和特异度（100%），这与 Xpert 的表现一致，但对 INH 耐药相关突变检测的灵敏度和特异度稍低，分别为 78.8%～87.5% 和 94.4%～100%[29-30]。RealTime MTB RIF/INH 耐药性测定在 HIV 共感染患者中也表现优异，灵敏度达到 70%，特异度为 90% 以上[31]。
3.4 COBAS TaqMan MTB 和RIF/INH耐药性测定
COBAS TaqMan MTB 是由瑞士 Roche 公司开发的第一个基于 TaqMan 的结核诊断检测方法。COBAS TaqMan MTB 的诊断准确性非常适用于呼吸道样本，总体灵敏度和特异度分别为 80.8% 和 99.4%[32]。未来 COBAS TaqMan MTB 和 COBAS TaqMan MTB-RIF/INH 两种方法都将匹配上 COBAS 6800 系统和 COBAS 8800 系统，使用通用的样本准备流程，一次性完成 384 或者 960 个样本的高通量检测[32]。
3.5 全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）
WGS 技术被认为是 MTB DNA 和耐药检测的终极分子诊断法。目前 WGS 技术日益成熟，多种自动化生物信息学平台可以实现临床上对结核耐药的常规快速精准诊断模式，从样本采集到接受治疗仅需要 1～3 d 的时间[33-35]。WGS 技术对 RIF 和 INH 耐药相关突变表现出好的灵敏度和特异度，然而，对其余的一线和二线药物，WGS 准确度存在显著差异[36-37]。WGS 技术在结核病分子诊断领域的发展还面临着挑战：① 对痰液样本进行 WGS 分析缺乏标准化步骤，包括去除非分枝杆菌 DNA 和富集 MTB DNA 的具体步骤；② 缺少共识指南以验证 WGS 用于结核病实验室诊断的价值；③ 将 WGS 纳入结核病诊断和耐药结核治疗对高负担国家的临床和经济影响。
4 分子诊断在MTB检测应用中的不足
MTB 的分子诊断检测在发展阶段采用了一系列新方法，这些技术能够提供准确的结果，并具有快速、可扩展、可重复、灵敏度高、高通量等优点。但是这些技术仍然存在局限性：① 技术难题，例如扩增抑制、交叉污染、便携性差；② 需要昂贵的试剂和较大的劳动力成本；③ 不能对多个药物耐药的相关位点进行检测；④ 相对较长的周期，特别是 DNA 提取；⑤ 对技术人员技能的要求高；⑥ 对专业设施的要求高。
5 分子诊断在结核病诊断中的发展展望
虽然分子诊断在 MTB 检测中取得了重大进展，但仍面临着巨大挑战：① 菌株的突变模式依地理位置不同而变化。宿主与细菌群体遗传和耐药相关突变的变异性也成为单独应用分子技术检测耐药性的主要缺点，因此未来结核病的诊断和耐药检测仍然需要结合实验室方法，特别是针对可疑的耐药病例；② 结核病的分子诊断技术基于特定基因突变与某些药物的抗性表型之间的关联，并快速诊断是否存在耐药性。然而，结核病的临床耐药性是耐药性细菌群体与药物敏感性细菌群体的平衡。未来的分子诊断需要结合实验室证据，以评估和量化群体中耐药细菌的数量，因为单一突变检测虽然能预测耐药的概率，但不能预测临床耐药性的暴发。除此之外还应结合患者自身情况和治疗相关因素，例如合并症、副作用、营养状态，以此实现对耐药性结核治疗的监管。
由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的结核病是全世界十大死因之一，也是最大的单一感染性病原体引发致死的疾病。2018 年，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）统计报告显示，全球新发结核病患者 1 000 万例，多集中在非洲国家、印度、印度尼西亚和中国等中等发达国家和欠发达国家[1]。在这些高负担国家，每 10 万人口中新增结核病病例为 150～400 人[1]。更严峻的是，在结核病患者中，还有 55.8 万人对利福平（rifampin，RIF）耐药，其中 82% 为多重耐药结核病例[1]。活动性结核的早期诊断，特别是对多耐药和泛耐药 MTB 的检测是实施有效治疗及公共卫生干预措施的必要前提。目前，实验室诊断主要依赖涂片染色镜检法和 MTB 培养等传统实验室检验方法。涂片染色镜检法存在阳性率低、操作复杂、技术要求高等缺点，MTB 培养亦存在污染率高、检测时间长等不足，致使全球近一半的结核病例不能通过实验室确认，诊断延迟。随着分子生物学的不断发展，快速分子诊断技术在结核病早期诊断方面的应用不断增加，许多国家正在逐步降低对传统痰涂片染色显微镜检验的依赖。本文将围绕 MTB 分子诊断方法的应用现状和前景进行评述。
1 MTB的实验室检查现状
MTB 的常规实验室检查方法为涂片染色镜检、分枝杆菌培养和核酸扩增试验。分枝杆菌涂片染色镜检有 2 种，即 Ziehl-Neelsen 抗酸染色法和荧光染色法。抗酸染色法简单经济、特异性高，但其检测限为每毫升未灭活痰涂片 5 000～10 000 个杆菌[2]，其灵敏度为 20%～80%[3-4]，尤其是对于儿童肺结核、肺外结核、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）共感染等少菌性结核病例的灵敏度低[5]。荧光染色法使 MTB 在显微镜下呈现亮黄色而易于分辨，操作简单且具有检出迅速、阳性率高的优点，在少菌性结核标本中更能够体现出优越性；但该法必须在暗室或远离窗口的位置操作，且维修成本较高昂，限制了其在实验室诊断中的广泛使用。MTB 培养是结核病实验室诊断的金标准。但是 MTB 对营养的要求高，需要使用特定的培养基。基于液体培养的快速培养系统有 BACTEC 460 系统、BACTEC MGIT 960 系统、MB Redox 系统等，分离率高于固体培养 Löwenstein-Jensen 法，报告时间大大缩短，对肺外标本如脑脊液等有明显优势。但 MTB 培养法仍有一些缺点阻碍了其作为结核病实验室诊断的常规检测，例如存在假阳性，需要专门的基础设施、设备和人员，需要维持适当的生物安全等级，需要不间断供电，等等。核酸扩增的引入促进了 MTB 诊断的巨大进步。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增特异性区域碱基序列被认为是鉴定分枝杆菌的金标准，16S 核糖体 RNA（ribosomal RNA，rRNA）是最常见的靶标。第一批商品化 PCR 方法的 MTB 鉴定试剂盒包括 COBAS Amplicor MTB 试剂盒、LCx MTB 试剂盒、BD ProbeTec 能量转移系统等。然而，这些方法不能同时兼具使用方便性和经济实惠性，因此无法完全满足结核病实验室诊断的临床需求。
2 MTB分子诊断技术现状
2.1 分子线性探针技术（molecular line probe assay，LPA）
LPA 是近年来兴起的一种 PCR 技术，用生物素化的引物进行 PCR 扩增，与固定在膜上的特异性 DNA 探针杂交后进行酶联免疫比色检测，可用于 MTB 培养物、痰涂片标本及药物耐药突变检测。
2.1.1 INNO-LiPA
INNO-LiPA 法是最早应用于临床的 LPA，于 1995 年由比利时 Innogenetics 公司提出，可用于 MTB DNA 和 RIF 耐药检测。该技术基于对 16S 和 23S rRNA 片段的扩增，可以识别 MTB 和 16 种非结核分枝杆菌，从采集样本到出结果需要 24～48 h。2008 年，WHO 批准将 INNO-LiPA 作为痰涂片阳性的多耐药结核病患者的快速筛选。INNO-LiPA 检测 RIF 耐药可预测 85%～90% 的多耐药结核[6]，灵敏度和特异度分别为 95% 和 100%[7]。尽管表现如此优异，手动操作、出报告周期长也限制了其在临床的应用。
2.1.2 GenoType
GenoType 是由德国 Hain Lifescience 公司研制的检测 MTB DNA 和一线、二线药物耐药突变的方法。2004 年推出的 GenoType MTBDR 产品（简称 MTBDR），存在 2 个主要不足：一是与表型药敏试验相比，虽然 MTBDR 对 RIF 耐药检测灵敏度较高，但对异烟肼（isoniazid，INH）耐药的灵敏度偏低，灵敏度分别为 99% 和 88.4%[8]。二是 MTBDR 与 INNO-LiPA 是基于同样的原理，同样存在出报告周期长（24～48 h）的问题。GenoType 系列第二类产品 GenoType MTBDRplus 于 2007 年推出。MTBDRplus 除可以检测 MTB DNA 及 RIF 耐药外，还可检测低水平 INH 耐药，增加了耐多药结核病的检出率[9]。有研究统计，MTBDRplus 2.0 对 RIF 耐药检测的灵敏度和特异度分别为 98.1% 和 98.7%，而对 INH 耐药的灵敏度会根据标本类型发生变化，波动范围在 57%～100%[7]。MTBDRplus2.0 在 1.0 基础上作了更新，扩增试剂例如 Taq 聚合酶和引物已经事先混合好，不再需要单独配制，且可直接检测痰涂片阴性标本。但两者在出报告周期上是一样的。GenoType 系列第三类产品 MTBDRsl 的原理与前两类相同，但主要是针对二线药物耐药基因的检测。与 MTBDRsl 1.0 相比，MTBDRsl 2.0 的灵敏度和特异度都有上升，对喹诺酮类药物、氨基糖苷类药物和卡那霉素药物的灵敏度分别为 93%～100%、83.0%～91.3% 和 89.2%～96.0%，特异度分别为 98.4%、91.7%～100.0% 和 92.2%～98.5%[10-12]。WHO 于 2016 年批准 MTBDRsl 可用于检测 MTB 培养物和痰标本，且不区分是来自痰涂片阴性或者阳性、来自肺或肺外组织的患者。然而，由于对痰涂片阴性病例的检测不确定率高、对氟喹诺酮类和二线氨基糖苷类药物检测的准确性不同等原因，MTBDRsl 整体准确性降低。
2.2 Xpert MTB/RIF技术
2009 年一种由美国 Cepheid 公司开发的新型分子生物检测方法 GeneXpert-MTB/RIF（简称 Xpert）开始应用于结核病诊断和药物耐药性检测[13]。Xpert 检测方法依靠全自动 GeneXpert 平台，以巢式实时定量荧光 PCR 为基础，以 rpoB 基因为靶基因，自动提取 DNA 并扩增，实现对 MTB DNA 及 RIF 耐药性的检测。Xpert 系统无需生物安全实验室，结果由系统自动生成，不需要工作人员的处理，报告周期仅为 2 h[14-16]。Xpert 可以直接应用于未灭活或灭活了的呼吸道样品、脑脊液、淋巴结组织、胸膜液、尿液等[17]。2013 年，Xpert 获得美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于结核病的诊断和 RIF 耐药检测，对肺外结核和儿童结核也适用。Cocharane 提供 Xpert 诊断结核的灵敏度和特异度分别为 89% 和 99%，且对 HIV 共感染患者的灵敏度为 79%，低于非共感染患者的 86%[18]。Xpert 诊断肺外结核的灵敏度和特异度分别为 43.7%～84.9% 和 92.5%～99.9%[19]。尽管 Xpert 表现优异，复杂的临床情况也对 Xpert 提出更高要求：在混合样本中提高对 RIF 耐药的检测能力；降低对少菌型样本的假阳性。
Xpert MTB/RIF Ultra（简称 Xpert Ultra）的出现是在 Xpert 的基础上作的进一步改进，两者采用相同的操作和试剂，可以在同一部仪器中运行，而 Xpert Ultra 只需要额外更新一个软件。Xpert Ultra 与 Xpert 相比，假阴性率降低。以培养法为金标准，Xpert Ultra 的灵敏度（87.7%）高于 Xpert（82.9%），特异度（94.8%）低于 Xpert（98%）[20]。Xpert Ultra 还提高了对少菌型样本的灵敏度，研究显示，Xpert Ultra 对少菌型结核的灵敏度（87.8%）较 Xpert 升高（82.9%），但特异度降低（94.8% vs. 98%）[20-21]。不仅如此，Xpert Ultra 还对混合样本中 RIF 耐药的检出率进行了提升，引物对突变的覆盖度也作了修改[22]。对 RIF 耐药突变的检测，Xpert Ultra 和 Xpert 的准确度相似[22-23]。2017 年 WHO 推荐 Xpert Ultra 可取代 Xpert 用于结核病诊断和 RIF 耐药检测。值得注意的是，Xpert Ultra 在儿童结核中并不能取代 MTB 培养作为主要诊断方法[24]。
3 新兴结核分子诊断技术
3.1 恒温扩增检测技术
由日本 Eiken Chemical 公司开发的 Loopamp MTB 检测试剂盒，使用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），仅需要 1～2 h 即可完成对多种分枝杆菌的鉴定。该技术简单快速、携带方便、试剂成本经济实惠、对生物安全等级和基础设施的要求低。但 LAMP 的缺点也明显，如高温、高湿度、试剂体积不足和样品间交叉污染会导致假阳性率升高[25]。LAMP 法有多个扩增位点，对 IS6110 位点的灵敏度和特异度尤其突出，因此，LAMP 法可对未经处理的痰涂片标本进行 IS6110 和 gyrB 基因的检测[26]。2016 年，WHO 推荐将 LAMP 方法作为除了痰涂片染色镜检以外的可选方法，LAMP 法也将成为资源较差地区对肺结核诊断的主要方法。
3.2 FluoroType MTBDR
FluoroType MTBDR 是由德国 Hain Lifescience 公司开发的一种半自动的，对呼吸道和非呼吸道标本进行 MTB 快速诊断和对 RIF、INH 耐药突变检测的方法。该方法将不对称 PCR 扩增与使用光学调控开关技术的特定探针组合在一起[27]，通过一台 FluoroCycler96 仪器就可以完成对 96 个样本的扩增和检测，检测周期只需要 3～4 h。由于全过程在密闭的空间中进行，该方法减少了实验员的操作误差。研究者发现，与表型药敏试验相比，FluoroType MTBDR 对 RIF 和 INH 的灵敏度分别为 91.7% 和 98.9%，特异度均为 100%[28]。
3.3 RealTime MTB RIF/INH耐药性测定
RealTime MTB RIF/INH 耐药性测定是美国 Abbott 公司开发的用于检测呼吸道样本 RIF 和 INH 耐药位点的方法。RealTime MTB RIF/INH 与 RealTime MTB 是相互独立的，但都依赖高通量 m2000 全自动系统。RealTime MTB 单次最多检测 96 个样本，待检测出 MTB 阳性样本后，RealTime MTB RIF/INH 可继续检测耐药位点，单次最多检测 24 个样本。其在痰涂片阳性和阴性的呼吸道样品中均显示出对 RIF 耐药突变检测较高的灵敏度（87.5%～96.3%）和特异度（100%），这与 Xpert 的表现一致，但对 INH 耐药相关突变检测的灵敏度和特异度稍低，分别为 78.8%～87.5% 和 94.4%～100%[29-30]。RealTime MTB RIF/INH 耐药性测定在 HIV 共感染患者中也表现优异，灵敏度达到 70%，特异度为 90% 以上[31]。
3.4 COBAS TaqMan MTB 和RIF/INH耐药性测定
COBAS TaqMan MTB 是由瑞士 Roche 公司开发的第一个基于 TaqMan 的结核诊断检测方法。COBAS TaqMan MTB 的诊断准确性非常适用于呼吸道样本，总体灵敏度和特异度分别为 80.8% 和 99.4%[32]。未来 COBAS TaqMan MTB 和 COBAS TaqMan MTB-RIF/INH 两种方法都将匹配上 COBAS 6800 系统和 COBAS 8800 系统，使用通用的样本准备流程，一次性完成 384 或者 960 个样本的高通量检测[32]。
3.5 全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）
WGS 技术被认为是 MTB DNA 和耐药检测的终极分子诊断法。目前 WGS 技术日益成熟，多种自动化生物信息学平台可以实现临床上对结核耐药的常规快速精准诊断模式，从样本采集到接受治疗仅需要 1～3 d 的时间[33-35]。WGS 技术对 RIF 和 INH 耐药相关突变表现出好的灵敏度和特异度，然而，对其余的一线和二线药物，WGS 准确度存在显著差异[36-37]。WGS 技术在结核病分子诊断领域的发展还面临着挑战：① 对痰液样本进行 WGS 分析缺乏标准化步骤，包括去除非分枝杆菌 DNA 和富集 MTB DNA 的具体步骤；② 缺少共识指南以验证 WGS 用于结核病实验室诊断的价值；③ 将 WGS 纳入结核病诊断和耐药结核治疗对高负担国家的临床和经济影响。
4 分子诊断在MTB检测应用中的不足
MTB 的分子诊断检测在发展阶段采用了一系列新方法，这些技术能够提供准确的结果，并具有快速、可扩展、可重复、灵敏度高、高通量等优点。但是这些技术仍然存在局限性：① 技术难题，例如扩增抑制、交叉污染、便携性差；② 需要昂贵的试剂和较大的劳动力成本；③ 不能对多个药物耐药的相关位点进行检测；④ 相对较长的周期，特别是 DNA 提取；⑤ 对技术人员技能的要求高；⑥ 对专业设施的要求高。
5 分子诊断在结核病诊断中的发展展望
虽然分子诊断在 MTB 检测中取得了重大进展，但仍面临着巨大挑战：① 菌株的突变模式依地理位置不同而变化。宿主与细菌群体遗传和耐药相关突变的变异性也成为单独应用分子技术检测耐药性的主要缺点，因此未来结核病的诊断和耐药检测仍然需要结合实验室方法，特别是针对可疑的耐药病例；② 结核病的分子诊断技术基于特定基因突变与某些药物的抗性表型之间的关联，并快速诊断是否存在耐药性。然而，结核病的临床耐药性是耐药性细菌群体与药物敏感性细菌群体的平衡。未来的分子诊断需要结合实验室证据，以评估和量化群体中耐药细菌的数量，因为单一突变检测虽然能预测耐药的概率，但不能预测临床耐药性的暴发。除此之外还应结合患者自身情况和治疗相关因素，例如合并症、副作用、营养状态，以此实现对耐药性结核治疗的监管。