引用本文： 胡观丽, 张蓓, 张晶波, 刘建维, 王晴, 董洁, 孟琳. 雌激素受体 α、β 对子宫内膜癌细胞增殖影响的研究. 华西医学, 2019, 34(8): 921-927. doi: 10.7507/1002-0179.201901178 复制
子宫内膜癌是我国乃至全球最常见的女性癌症之一[1-2]。雌激素水平作为子宫内膜癌发生发展的危险因素，通过与雌激素受体（estrogen receptor，ER）结合触发多种癌基因或抑癌基因的异常转录表达，进而促进肿瘤的形成及进展恶化[3]。ER 包括核受体和膜性受体两大类，ERα 和 ERβ 为研究较为广泛的雌激素核受体的两种亚型[4]。研究表明 ERα 和 ERβ 亚型在子宫内膜癌组织中可能具有不同的表达模式，提示 ERα 和 ERβ 在子宫内膜癌中可能具有不同的生物学功能[5]。CyclinD1 和 P21 为细胞周期调控蛋白，其异常表达与子宫内膜癌的发生发展密切相关，相关研究表明，CyclinD1 和 P21 可能作为 ER 在子宫内膜癌中发挥作用的下游靶基因[6]。二甲双胍是一种常用于治疗 2 型糖尿病的降血糖药物，近年来研究发现二甲双胍在许多癌症（包括子宫内膜癌）中具有较好的抗癌作用[7]。本课题组前期研究也证实，二甲双胍可抑制雌激素诱导的子宫内膜癌细胞增殖，并可调节子宫内膜癌中 ERα 和 ERβ 基因的表达[8]。但目前仍不清楚二甲双胍是否通过调节 ERα 和 ERβ 基因的表达，进而对子宫内膜癌具有抑癌的作用。本研究将通过构建 ERα 和 ERβ 干扰细胞模型，研究 ERα 和 ERβ 对雌激素诱导的子宫内膜癌细胞增殖的作用，以及对下游细胞周期调控因子 CyclinD1 和 P21 表达的影响；进而加入二甲双胍处理因素，研究二甲双胍抑制子宫内膜癌细胞增殖的作用机制是否由 ERα 和 ERβ 介导。
1 材料与方法
1.1 主要材料与仪器
人子宫内膜癌细胞系 Ishikawa 细胞购于中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，胎牛血清、RPMI-1640 细胞培养液购自美国 Gibco 公司，17β 雌二醇、二甲双胍购自美国 Sigma 公司，Trizol 裂解液、PrimeScript™ RT reagent Kit 逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒购自日本 Takara 公司，聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白测定试剂盒、四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂、RNA 酶、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液均购自中国碧云天公司，ERα、ERβ、cyclinD1、P21 及 β-actin 蛋白抗体均购于英国 Abcam 公司。荧光定量用 CFX Connect 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、凝胶成像系统、蛋白电泳仪、蛋白转膜仪均购自美国 Bio-Rad 公司。本研究经徐州医科大学伦理委员会审批通过。
1.2 细胞培养及处理
配制胎牛血清浓度为 10% 的 RPMI-1640 细胞培养液用于培养 Ishikawa 细胞。细胞培养环境为 37℃、5% 二氧化碳。
雌激素处理：配制终浓度为 1×10–6 mol/L 的 17β 雌二醇培养液处理细胞 48 h。
二甲双胍处理：配制终浓度为 5 mmol/L 的二甲双胍培养液处理细胞 48 h。
雌二醇联合短发卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）-ERα 干扰处理，分为 4 组：正常培养液对照+shRNA-NC 处理、雌二醇处理+shRNA-NC 处理、正常培养液对照+shRNA-ERα 干扰处理、雌二醇处理+shRNA-ERα 干扰处理。
雌二醇联合 shRNA-ERβ 干扰处理，分为 4 组：正常培养液对照+shRNA-NC 处理、雌二醇处理+shRNA-NC 处理、正常培养液对照+shRNA-ERβ 干扰处理、雌二醇处理+shRNA-ERβ 干扰处理。
二甲双胍联合 shRNA-ERα 干扰处理，分为 4 组：正常培养液对照+shRNA-NC 处理、二甲双胍处理+shRNA-NC 处理、正常培养液对照+shRNA-ERα 干扰处理、二甲双胍处理+shRNA-ERα 干扰处理。
二甲双胍联合 shRNA-ERβ 干扰处理，分为 4 组：正常培养液对照+shRNA-NC 处理、二甲双胍处理+shRNA-NC 处理、正常培养液对照+shRNA-ERβ 干扰处理、二甲双胍处理+shRNA-ERβ 干扰处理。
1.3 ERα、ERβ 干扰慢病毒载体的构建及转染
为了获得干扰 ERα 和 ERβ 的 Ishikawa 细胞，针对 ERα 和 ERβ 基因 mRNA 设计合成干扰序列，并将干扰序列构建到慢病毒载体中形成 shRNA-ERα 慢病毒载体和 shRNA-ERβ 慢病毒载体。干扰序列的合成及慢病毒载体的构建由上海吉玛公司完成。同时在上海吉玛公司购买阴性对照 shRNA-NC 慢病毒载体作为实验对照。对 Ishikawa 细胞分别侵染 shRNA-ERα 慢病毒、shRNA-ERβ 慢病毒或 shRNA-NC 慢病毒。72 h 后验证 Ishikawa 细胞中 ERα 和 ERβ 的干扰效率。
1.4 总 RNA 提取及实时定量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测
利用传统 Trizol 法提取 Ishikawa 细胞总 RNA，采用紫外分光光度计检测提取后总 RNA 的浓度和纯度后，进行逆转录 PCR 合成互补 DNA。逆转录 PCR 采用 PrimeScript™ RT reagent Kit 逆转录试剂盒进行。合成后的互补 DNA 用于后续荧光定量 PCR 检测。按照 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书进行扩增，记录相应的 Ct 值，采用 2–△△Ct 分析法分析基因的相对表达量。ERα 和 ERβ 基因引物如下：ERα 上游引物，5′-AGTGCCTTGTTGGATGCTG-3′，ERα 下游引物，5′-TGCCAGGTTGGTCAGTAAGC-3′；ERβ 上游引物，5′-AGTCCCTGGTGTGAAGCAAG-3′，ERβ 下游引物，5′-TGAGCATCCCTCTTTGAACC-3′。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为本实验中的内参，引物序列如下：GAPDH 上游引物，5′-CAGTCAGCCGCATCTTCTTTT-3′，GAPDH 下游引物，5′-GTGACCAGGCGCCCAATAC-3′。
1.5 蛋白质印迹法
利用放射免疫沉淀裂解液裂解 Ishikawa 细胞总蛋白，并采用 BCA 蛋白测定试剂盒测定各组蛋白浓度。Ishikawa 细胞总蛋白经过高温变性后，用于后续的蛋白电泳及转膜，各组蛋白上样量为 60 μg，采用 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶进行电泳。蛋白转印到聚偏二氟乙烯膜后，采用 5% 脱脂奶粉封闭 1 h，随后在 4℃ 环境中进行一抗抗体过夜孵育。ERα、ERβ、cyclinD1 及 P21 蛋白抗体进行 1∶1 000 稀释，内参 β-actin 抗体进行 1∶10 000 稀释。一抗孵育后进行洗膜并在室温中孵育二抗 1 h，洗膜后进行曝光检测。
1.6 MTT 法检测细胞增殖
取对数生长期 Ishikawa 细胞，按每孔 1×104个细胞接种于 96 孔板，每孔 200 μL，5% 二氧化碳、37℃ 培养箱培养约 24 h 至细胞贴壁。培养 48 h 后，每孔加入浓度为 5 mg/mL 的 MTT 20 μL 继续培养 4 h，吸弃上清液，每孔加入 150 μL 二甲基亚砜，平板摇床摇匀 10 min，置酶标仪于 490 nm 波长处检测每孔的吸光度值（A490 nm），根据各组细胞吸光度值反映细胞增殖状况。实验重复 3 次，每组 6 个复孔。
1.7 流式细胞仪检测细胞周期
将不同组细胞用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化 1～3 min，收集细胞后用磷酸盐缓冲液清洗细胞 2 遍。加入 1 mL –20℃ 预冷的乙醇，轻轻吹散细胞后 4℃ 过夜。磷酸盐缓冲液清洗后加入 100 μL RNA 酶 37℃ 水浴孵育 30 min。随后加入 500 μL PI 染液 4℃ 避光孵育 30 min。最后利用流式细胞仪检测各组细胞中 G1、S、G2 期细胞比例，观察各组细胞周期的变化。实验重复 3 次，每组 3 个复孔。
1.8 统计学方法
采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析。计量资料组间比较采用方差分析，随后采用 LSD 法进行两两比较。检验水准 α=0.05。采用 Graphpad Prism 软件绘制统计图。
2 结果
2.1 Ishikawa 细胞中 ERα、ERβ 干扰慢病毒载体的构建及鉴定
将 ERα、ERβ 干扰慢病毒载体分别感染 Ishikawa 细胞，感染 72 h 后，提取 Ishikawa 细胞总 RNA 及总蛋白检测 ERα、ERβ 基因 mRNA 及蛋白表达水平的变化。qRT-PCR 结果显示，Ishikawa 细胞感染 ERα 干扰慢病毒载体后，ERα 基因 mRNA 表达水平与对照组相比下调 76%，差异有统计学意义（P<0.05）；Ishikawa 细胞感染 ERβ 干扰慢病毒载体后，ERβ 基因 mRNA 表达水平与对照组相比下调 67%，差异也有统计学意义（P<0.05）。此外，蛋白质印迹法结果显示，在 Ishikawa 细胞感染 ERα、ERβ 干扰慢病毒载体后，ERα 和 ERβ 蛋白表达水平均受到明显下调。以上 qRT-PCR 及蛋白质印迹法结果提示，ERα、ERβ 干扰慢病毒载体在 Ishikawa 细胞中均具有较好的干扰效果。见图 1。
图1
ERα、ERβ 慢病毒干扰载体在 Ishikawa 细胞中干扰效果验证
shRNA-NC 表示阴性对照 shRNA，shRNA-ERα 表示针对 ERα 的 shRNA，shRNA-ERβ 表示针对 ERβ 的 shRNA；**表示
2.2 ERα 干扰对雌二醇诱导的 Ishikawa 细胞增殖和周期的影响
利用 MTT 法检测雌二醇联合 shRNA-ERα 干扰处理对 Ishikawa 细胞增殖能力的影响。3 d 内的生存曲线显示，单独雌二醇处理可以促进 Ishikawa 细胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；单独干扰 ERα 抑制 Ishikawa 细胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；干扰 ERα 的同时进行雌二醇处理发现，干扰 ERα 能抵消雌二醇促增殖的作用（P>0.05）。见图 2a。
图2
ERα 干扰对 Ishikawa 细胞增殖和周期的影响
shRNA-NC 表示阴性对照 shRNA，shRNA-ERα 表示针对 ERα 的 shRNA，E2 表示雌二醇处理；*表示
利用流式细胞仪检测以上 4 组处理中的细胞周期，结果发现，单独雌二醇处理导致 Ishikawa 细胞 G1 期细胞比例减少，S 期细胞比例增多（P<0.05），说明细胞周期加快；单独干扰 ERα 基因后，G1 期细胞比例增多，S 期细胞比例减少（P<0.05），说明细胞周期阻滞；干扰 ERα 的同时进行雌二醇处理发现，干扰 ERα 能抵消雌二醇对细胞周期的促进作用（P>0.05）。见图 2b。
此外，我们还检测了雌二醇联合 shRNA-ERα 干扰处理对 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影响。结果显示，单独雌二醇处理可以促进 Ishikawa 细胞 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表达，抑制 P21 基因 mRNA 和蛋白的表达（P<0.05）；单独干扰 ERα 抑制 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表达，促进 P21 基因 mRNA 和蛋白的表达（P<0.05）；干扰 ERα 的同时进行雌二醇处理发现，干扰 ERα 能抵消雌二醇对 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影响（P>0.05）。见图 2c、2d。
2.3 ERβ 干扰对雌二醇诱导的 Ishikawa 细胞增殖和周期的影响
利用 MTT 法检测雌二醇联合 shRNA-ERβ 干扰处理对 Ishikawa 细胞增殖能力的影响。3 d 内的生存曲线显示，单独雌二醇处理可以促进 Ishikawa 细胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；单独干扰 ERβ 也促进 Ishikawa 细胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；干扰 ERβ 的同时进行雌二醇处理发现，干扰 ERβ 能增强雌二醇促增殖的作用（P<0.05）。见图 3a。
图3
ERβ 干扰对 Ishikawa 细胞增殖和周期的影响
shRNA-NC 表示阴性对照 shRNA，shRNA-ERβ 表示针对 ERβ 的 shRNA，E2 表示雌二醇处理；*表示
利用流式细胞仪检测以上 4 组处理中的细胞周期，结果发现，单独雌二醇处理导致 Ishikawa 细胞 G1 期细胞比例减少，S 期细胞比例增多（P<0.05），说明细胞周期加快；单独干扰 ERβ 基因后，也出现 G1 期细胞比例减少，S 期细胞比例增多（P<0.05），说明细胞周期同样得到促进；干扰 ERβ 的同时进行雌二醇处理发现，干扰 ERβ 能增强雌二醇对细胞周期的促进作用（P<0.05）。见图 3b。
此外，我们还检测了雌二醇联合 shRNA-ERβ 干扰处理对 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影响。结果显示，单独雌二醇处理可以促进 Ishikawa 细胞 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表达，抑制 P21 基因 mRNA 和蛋白的表达（P<0.05）；单独干扰 ERβ 促进 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表达，抑制 P21 基因 mRNA 和蛋白的表达（P<0.05）；干扰 ERβ 的同时进行雌二醇处理发现，干扰 ERβ 能增强雌二醇对 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影响（P<0.05）。见图 3c、3d。
2.4 ERα 干扰对二甲双胍抑制 Ishikawa 细胞增殖的影响
在相同雌激素处理的条件下，分别在二甲双胍处理 0 h 和 48 h 两个时相点，利用 MTT 法检测二甲双胍联合 shRNA-ERα 干扰处理条件下 Ishikawa 细胞的增殖情况。结果发现，二甲双胍处理 0 h 各组 Ishikawa 细胞增殖情况一致，说明在二甲双胍处理前各组细胞处于同一增殖水平。二甲双胍处理 48 h 后，在阴性对照 Ishikawa 细胞中，二甲双胍抑制了雌激素诱导的 Ishikawa 细胞增殖（P<0.05）；而在干扰 ERα 基因的 Ishikawa 细胞中，二甲双胍对 Ishikawa 细胞增殖的抑制作用消失（P>0.05）。见图 4a。
图4
ERα、ERβ干扰对二甲双胍抑制雌激素诱导的 Ishikawa 细胞增殖的影响
4 组细胞均在相同的雌激素处理条件下进行；shRNA-NC 表示阴性对照 shRNA，shRNA-ERα 表示针对 ERα 的 shRNA，shRNA-ERβ 表示针对 ERβ 的 shRNA，control 表示空白药物对照，Met 表示二甲双胍药物处理；*表示
2.5 ERβ 对二甲双胍抑制 Ishikawa 细胞增殖的影响
分别在二甲双胍处理 0 h 和 48 h 两个时相点，利用 MTT 法检测二甲双胍联合 shRNA-ERβ 干扰处理条件下 Ishikawa 细胞的增殖情况。结果发现，在相同雌激素处理情况下，二甲双胍处理 0 h 各组 Ishikawa 细胞增殖处于同一基线水平。二甲双胍处理 48 h 后，在阴性对照 Ishikawa 细胞中，二甲双胍抑制了 Ishikawa 细胞的增殖（P<0.05）；而在干扰 ERβ 基因的 Ishikawa 细胞中，二甲双胍对 Ishikawa 细胞增殖的抑制作用消失（P>0.05）。见图 4b。
3 讨论
子宫内膜癌是雌激素依赖性的妇科恶性肿瘤，雌激素水平与子宫内膜癌的发生发展密切相关[9]。雌二醇是生物学效应最强、体内含量最丰富的雌激素；ER 是核受体超家族的成员之一，雌二醇与 ER 的配体结合域结合后，激活 ER 入核，并作用于靶基因上游启动子区域的雌激素反应元件，诱导下游基因转录[10]。ER 具有 2 种亚型（ERα 和 ERβ），分别由不同的基因编码，尽管 ERα 和 ERβ 具有相似的蛋白结构，但最近的研究发现，ERα 和 ERβ 具有不同的信号转导途径，发挥不同甚至相反的生物学活性[11]。在细胞功能上，ERα 和 ERβ 也可能介导不同的生物学效应，ERα 主要介导上皮细胞的分化和增殖，ERβ 则主要介导细胞的凋亡反应[12]。在表达模式上，在 ERα 和 ERβ 共存的乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜肿瘤发展恶化过程中，ERβ 表达逐渐降低而 ERα 表达则增加[13-14]。由此可见，ERα 和 ERβ 两种亚型表达失衡可能是激素依赖性肿瘤如子宫内膜癌发生的一个关键步骤，提示 ERα 和 ERβ 可能在子宫内膜癌发生发展过程中具有不同的生物学功能，因此有必要深入研究 ERα 和 ERβ 在雌激素诱导的子宫内膜癌细胞增殖中的作用。
本研究利用慢病毒载体分别构建了 ERα 干扰 Ishikawa 细胞模型和 ERβ 干扰 Ishikawa 细胞模型。在无雌激素刺激的情况下，通过 MTT 实验发现干扰 ERα 的表达可以抑制 Ishikawa 细胞的增殖，与之相反干扰 ERβ 的表达则可以促进 Ishikawa 细胞的增殖。此外，通过流式细胞术检测发现，干扰 ERα 的表达可以阻滞 Ishikawa 细胞周期，干扰 ERβ 的表达则可以促进 Ishikawa 细胞周期从 G1 期进入 S 期。CyclinD1 为目前公认的癌基因，可以驱动细胞由 G1 期进入 S 期进而促进细胞增殖[15]。P21 蛋白功能与之相反，通过抑制 cyclinD1-CDK4 和 cyclinE-CDK2 的活性，使细胞周期停滞在 G1 期，从而抑制肿瘤的发生发展[16]。我们针对性地研究了 cyclinD1 和 P21 的表达变化，发现两种蛋白 mRNA 和蛋白水平的变化趋势与细胞增殖、周期结果一致。我们的研究结果也证实了 ERα 和 ERβ 可能通过调控细胞周期调节相关的蛋白 cyclinD1 和 P21 的表达，进而在子宫内膜癌细胞的增殖过程中发挥着不同的调节作用。
已有的研究表明，雌激素可以诱导子宫内膜癌细胞的增殖，因此我们利用雌二醇对子宫内膜癌细胞株进行刺激，观察在雌激素刺激的条件下 ERα 和 ERβ 对子宫内膜癌细胞增殖的影响。通过 MTT 和流式细胞术检测发现，单独雌激素处理可以显著促进 Ishikawa 细胞的增殖；在 ERα 干扰的 Ishikawa 细胞中，雌激素的促增殖作用消失；在 ERβ 干扰的 Ishikawa 细胞中，雌激素的促增殖作用则得到一定程度的增强。以上结果说明，在子宫内膜癌细胞的增殖过程中，ERα 和雌二醇可能具有协同促进的作用，而 ERβ 和雌二醇则可能具有一定的拮抗作用。此外，细胞周期调节相关的蛋白 cyclinD1 和 P21 的表达变化也与细胞周期结果一致。
二甲双胍为 2 型糖尿病的首选治疗药物[17]。近期流行病学与临床观察显示，二甲双胍可降低多种肿瘤的发病率，有望成为新的肿瘤治疗药物或辅助抗肿瘤药物[18]。相关机制研究表明，二甲双胍一方面可以调节肿瘤细胞的葡萄糖代谢和胰岛素敏感性，通过磷脂酰肌醇-3-羟激酶相关信号通路对肿瘤产生抑制作用，另一方面二甲双胍也可以进入肿瘤细胞内，直接活化腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）信号通路，抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡[19]。此外，二甲双胍也可能作用于免疫系统进行肿瘤抑制[20]。在子宫内膜癌中，二甲双胍可以抑制子宫内膜癌细胞的增殖并诱导其凋亡[21]。本课题组前期初步研究也发现，二甲双胍可以显著下调子宫内膜癌细胞 ERα 的表达而上调 ERβ 的表达，并且可能与 AMPK 信号通路的激活以及雷帕霉素受体蛋白信号通路的抑制有关[8]。然而，目前仍不清楚二甲双胍对子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用是否与 ERα 和 ERβ 直接相关。因此在本研究中，我们进一步研究了二甲双胍与 ER 两种因素对子宫内膜癌细胞增殖的综合影响。我们分别针对 ERα 干扰 Ishikawa 细胞模型和 ERβ 干扰 Ishikawa 细胞模型进行二甲双胍处理，结果发现单独二甲双胍处理可以显著抑制 Ishikawa 细胞的增殖能力；在 ERα 干扰的 Ishikawa 细胞中，二甲双胍抑制增殖的作用消失；在 ERβ 干扰的 Ishikawa 细胞中，二甲双胍抑制增殖的作用也消失。以上结果说明，二甲双胍对子宫内膜癌细胞的抑制作用可能通过 ERα 和 ERβ 介导。
综上，本研究结果显示 ERα 和 ERβ 在子宫内膜癌增殖过程中具有不同的生物学功能。ERα 可能促进雌激素诱导的子宫内膜癌细胞增殖，ERβ 则可能抑制雌激素诱导的子宫内膜癌细胞增殖，因此 ERα 和 ERβ 在子宫内膜癌中表达的比例可能对雌激素诱导细胞增殖具有重要的作用。此外，ERα 和 ERβ 可能通过调节细胞周期调控因子 cyclinD1 和 P21 的表达发挥生物学功能，并且可能介导了二甲双胍对子宫内膜癌细胞的抑制作用，为二甲双胍治疗子宫内膜癌的临床应用研究提供了新的理论依据。
子宫内膜癌是我国乃至全球最常见的女性癌症之一[1-2]。雌激素水平作为子宫内膜癌发生发展的危险因素，通过与雌激素受体（estrogen receptor，ER）结合触发多种癌基因或抑癌基因的异常转录表达，进而促进肿瘤的形成及进展恶化[3]。ER 包括核受体和膜性受体两大类，ERα 和 ERβ 为研究较为广泛的雌激素核受体的两种亚型[4]。研究表明 ERα 和 ERβ 亚型在子宫内膜癌组织中可能具有不同的表达模式，提示 ERα 和 ERβ 在子宫内膜癌中可能具有不同的生物学功能[5]。CyclinD1 和 P21 为细胞周期调控蛋白，其异常表达与子宫内膜癌的发生发展密切相关，相关研究表明，CyclinD1 和 P21 可能作为 ER 在子宫内膜癌中发挥作用的下游靶基因[6]。二甲双胍是一种常用于治疗 2 型糖尿病的降血糖药物，近年来研究发现二甲双胍在许多癌症（包括子宫内膜癌）中具有较好的抗癌作用[7]。本课题组前期研究也证实，二甲双胍可抑制雌激素诱导的子宫内膜癌细胞增殖，并可调节子宫内膜癌中 ERα 和 ERβ 基因的表达[8]。但目前仍不清楚二甲双胍是否通过调节 ERα 和 ERβ 基因的表达，进而对子宫内膜癌具有抑癌的作用。本研究将通过构建 ERα 和 ERβ 干扰细胞模型，研究 ERα 和 ERβ 对雌激素诱导的子宫内膜癌细胞增殖的作用，以及对下游细胞周期调控因子 CyclinD1 和 P21 表达的影响；进而加入二甲双胍处理因素，研究二甲双胍抑制子宫内膜癌细胞增殖的作用机制是否由 ERα 和 ERβ 介导。
1 材料与方法
1.1 主要材料与仪器
人子宫内膜癌细胞系 Ishikawa 细胞购于中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库，胎牛血清、RPMI-1640 细胞培养液购自美国 Gibco 公司，17β 雌二醇、二甲双胍购自美国 Sigma 公司，Trizol 裂解液、PrimeScript™ RT reagent Kit 逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒购自日本 Takara 公司，聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白测定试剂盒、四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂、RNA 酶、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液均购自中国碧云天公司，ERα、ERβ、cyclinD1、P21 及 β-actin 蛋白抗体均购于英国 Abcam 公司。荧光定量用 CFX Connect 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、凝胶成像系统、蛋白电泳仪、蛋白转膜仪均购自美国 Bio-Rad 公司。本研究经徐州医科大学伦理委员会审批通过。
1.2 细胞培养及处理
配制胎牛血清浓度为 10% 的 RPMI-1640 细胞培养液用于培养 Ishikawa 细胞。细胞培养环境为 37℃、5% 二氧化碳。
雌激素处理：配制终浓度为 1×10–6 mol/L 的 17β 雌二醇培养液处理细胞 48 h。
二甲双胍处理：配制终浓度为 5 mmol/L 的二甲双胍培养液处理细胞 48 h。
雌二醇联合短发卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）-ERα 干扰处理，分为 4 组：正常培养液对照+shRNA-NC 处理、雌二醇处理+shRNA-NC 处理、正常培养液对照+shRNA-ERα 干扰处理、雌二醇处理+shRNA-ERα 干扰处理。
雌二醇联合 shRNA-ERβ 干扰处理，分为 4 组：正常培养液对照+shRNA-NC 处理、雌二醇处理+shRNA-NC 处理、正常培养液对照+shRNA-ERβ 干扰处理、雌二醇处理+shRNA-ERβ 干扰处理。
二甲双胍联合 shRNA-ERα 干扰处理，分为 4 组：正常培养液对照+shRNA-NC 处理、二甲双胍处理+shRNA-NC 处理、正常培养液对照+shRNA-ERα 干扰处理、二甲双胍处理+shRNA-ERα 干扰处理。
二甲双胍联合 shRNA-ERβ 干扰处理，分为 4 组：正常培养液对照+shRNA-NC 处理、二甲双胍处理+shRNA-NC 处理、正常培养液对照+shRNA-ERβ 干扰处理、二甲双胍处理+shRNA-ERβ 干扰处理。
1.3 ERα、ERβ 干扰慢病毒载体的构建及转染
为了获得干扰 ERα 和 ERβ 的 Ishikawa 细胞，针对 ERα 和 ERβ 基因 mRNA 设计合成干扰序列，并将干扰序列构建到慢病毒载体中形成 shRNA-ERα 慢病毒载体和 shRNA-ERβ 慢病毒载体。干扰序列的合成及慢病毒载体的构建由上海吉玛公司完成。同时在上海吉玛公司购买阴性对照 shRNA-NC 慢病毒载体作为实验对照。对 Ishikawa 细胞分别侵染 shRNA-ERα 慢病毒、shRNA-ERβ 慢病毒或 shRNA-NC 慢病毒。72 h 后验证 Ishikawa 细胞中 ERα 和 ERβ 的干扰效率。
1.4 总 RNA 提取及实时定量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测
利用传统 Trizol 法提取 Ishikawa 细胞总 RNA，采用紫外分光光度计检测提取后总 RNA 的浓度和纯度后，进行逆转录 PCR 合成互补 DNA。逆转录 PCR 采用 PrimeScript™ RT reagent Kit 逆转录试剂盒进行。合成后的互补 DNA 用于后续荧光定量 PCR 检测。按照 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明书进行扩增，记录相应的 Ct 值，采用 2–△△Ct 分析法分析基因的相对表达量。ERα 和 ERβ 基因引物如下：ERα 上游引物，5′-AGTGCCTTGTTGGATGCTG-3′，ERα 下游引物，5′-TGCCAGGTTGGTCAGTAAGC-3′；ERβ 上游引物，5′-AGTCCCTGGTGTGAAGCAAG-3′，ERβ 下游引物，5′-TGAGCATCCCTCTTTGAACC-3′。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为本实验中的内参，引物序列如下：GAPDH 上游引物，5′-CAGTCAGCCGCATCTTCTTTT-3′，GAPDH 下游引物，5′-GTGACCAGGCGCCCAATAC-3′。
1.5 蛋白质印迹法
利用放射免疫沉淀裂解液裂解 Ishikawa 细胞总蛋白，并采用 BCA 蛋白测定试剂盒测定各组蛋白浓度。Ishikawa 细胞总蛋白经过高温变性后，用于后续的蛋白电泳及转膜，各组蛋白上样量为 60 μg，采用 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶进行电泳。蛋白转印到聚偏二氟乙烯膜后，采用 5% 脱脂奶粉封闭 1 h，随后在 4℃ 环境中进行一抗抗体过夜孵育。ERα、ERβ、cyclinD1 及 P21 蛋白抗体进行 1∶1 000 稀释，内参 β-actin 抗体进行 1∶10 000 稀释。一抗孵育后进行洗膜并在室温中孵育二抗 1 h，洗膜后进行曝光检测。
1.6 MTT 法检测细胞增殖
取对数生长期 Ishikawa 细胞，按每孔 1×104个细胞接种于 96 孔板，每孔 200 μL，5% 二氧化碳、37℃ 培养箱培养约 24 h 至细胞贴壁。培养 48 h 后，每孔加入浓度为 5 mg/mL 的 MTT 20 μL 继续培养 4 h，吸弃上清液，每孔加入 150 μL 二甲基亚砜，平板摇床摇匀 10 min，置酶标仪于 490 nm 波长处检测每孔的吸光度值（A490 nm），根据各组细胞吸光度值反映细胞增殖状况。实验重复 3 次，每组 6 个复孔。
1.7 流式细胞仪检测细胞周期
将不同组细胞用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化 1～3 min，收集细胞后用磷酸盐缓冲液清洗细胞 2 遍。加入 1 mL –20℃ 预冷的乙醇，轻轻吹散细胞后 4℃ 过夜。磷酸盐缓冲液清洗后加入 100 μL RNA 酶 37℃ 水浴孵育 30 min。随后加入 500 μL PI 染液 4℃ 避光孵育 30 min。最后利用流式细胞仪检测各组细胞中 G1、S、G2 期细胞比例，观察各组细胞周期的变化。实验重复 3 次，每组 3 个复孔。
1.8 统计学方法
采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析。计量资料组间比较采用方差分析，随后采用 LSD 法进行两两比较。检验水准 α=0.05。采用 Graphpad Prism 软件绘制统计图。
2 结果
2.1 Ishikawa 细胞中 ERα、ERβ 干扰慢病毒载体的构建及鉴定
将 ERα、ERβ 干扰慢病毒载体分别感染 Ishikawa 细胞，感染 72 h 后，提取 Ishikawa 细胞总 RNA 及总蛋白检测 ERα、ERβ 基因 mRNA 及蛋白表达水平的变化。qRT-PCR 结果显示，Ishikawa 细胞感染 ERα 干扰慢病毒载体后，ERα 基因 mRNA 表达水平与对照组相比下调 76%，差异有统计学意义（P<0.05）；Ishikawa 细胞感染 ERβ 干扰慢病毒载体后，ERβ 基因 mRNA 表达水平与对照组相比下调 67%，差异也有统计学意义（P<0.05）。此外，蛋白质印迹法结果显示，在 Ishikawa 细胞感染 ERα、ERβ 干扰慢病毒载体后，ERα 和 ERβ 蛋白表达水平均受到明显下调。以上 qRT-PCR 及蛋白质印迹法结果提示，ERα、ERβ 干扰慢病毒载体在 Ishikawa 细胞中均具有较好的干扰效果。见图 1。
图1
ERα、ERβ 慢病毒干扰载体在 Ishikawa 细胞中干扰效果验证
shRNA-NC 表示阴性对照 shRNA，shRNA-ERα 表示针对 ERα 的 shRNA，shRNA-ERβ 表示针对 ERβ 的 shRNA；**表示
2.2 ERα 干扰对雌二醇诱导的 Ishikawa 细胞增殖和周期的影响
利用 MTT 法检测雌二醇联合 shRNA-ERα 干扰处理对 Ishikawa 细胞增殖能力的影响。3 d 内的生存曲线显示，单独雌二醇处理可以促进 Ishikawa 细胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；单独干扰 ERα 抑制 Ishikawa 细胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；干扰 ERα 的同时进行雌二醇处理发现，干扰 ERα 能抵消雌二醇促增殖的作用（P>0.05）。见图 2a。
图2
ERα 干扰对 Ishikawa 细胞增殖和周期的影响
shRNA-NC 表示阴性对照 shRNA，shRNA-ERα 表示针对 ERα 的 shRNA，E2 表示雌二醇处理；*表示
利用流式细胞仪检测以上 4 组处理中的细胞周期，结果发现，单独雌二醇处理导致 Ishikawa 细胞 G1 期细胞比例减少，S 期细胞比例增多（P<0.05），说明细胞周期加快；单独干扰 ERα 基因后，G1 期细胞比例增多，S 期细胞比例减少（P<0.05），说明细胞周期阻滞；干扰 ERα 的同时进行雌二醇处理发现，干扰 ERα 能抵消雌二醇对细胞周期的促进作用（P>0.05）。见图 2b。
此外，我们还检测了雌二醇联合 shRNA-ERα 干扰处理对 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影响。结果显示，单独雌二醇处理可以促进 Ishikawa 细胞 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表达，抑制 P21 基因 mRNA 和蛋白的表达（P<0.05）；单独干扰 ERα 抑制 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表达，促进 P21 基因 mRNA 和蛋白的表达（P<0.05）；干扰 ERα 的同时进行雌二醇处理发现，干扰 ERα 能抵消雌二醇对 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影响（P>0.05）。见图 2c、2d。
2.3 ERβ 干扰对雌二醇诱导的 Ishikawa 细胞增殖和周期的影响
利用 MTT 法检测雌二醇联合 shRNA-ERβ 干扰处理对 Ishikawa 细胞增殖能力的影响。3 d 内的生存曲线显示，单独雌二醇处理可以促进 Ishikawa 细胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；单独干扰 ERβ 也促进 Ishikawa 细胞在 48 h 的增殖（P<0.05）；干扰 ERβ 的同时进行雌二醇处理发现，干扰 ERβ 能增强雌二醇促增殖的作用（P<0.05）。见图 3a。
图3
ERβ 干扰对 Ishikawa 细胞增殖和周期的影响
shRNA-NC 表示阴性对照 shRNA，shRNA-ERβ 表示针对 ERβ 的 shRNA，E2 表示雌二醇处理；*表示
利用流式细胞仪检测以上 4 组处理中的细胞周期，结果发现，单独雌二醇处理导致 Ishikawa 细胞 G1 期细胞比例减少，S 期细胞比例增多（P<0.05），说明细胞周期加快；单独干扰 ERβ 基因后，也出现 G1 期细胞比例减少，S 期细胞比例增多（P<0.05），说明细胞周期同样得到促进；干扰 ERβ 的同时进行雌二醇处理发现，干扰 ERβ 能增强雌二醇对细胞周期的促进作用（P<0.05）。见图 3b。
此外，我们还检测了雌二醇联合 shRNA-ERβ 干扰处理对 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影响。结果显示，单独雌二醇处理可以促进 Ishikawa 细胞 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表达，抑制 P21 基因 mRNA 和蛋白的表达（P<0.05）；单独干扰 ERβ 促进 cyclinD1 基因 mRNA 和蛋白的表达，抑制 P21 基因 mRNA 和蛋白的表达（P<0.05）；干扰 ERβ 的同时进行雌二醇处理发现，干扰 ERβ 能增强雌二醇对 cyclinD1、P21 基因 mRNA 和蛋白水平的影响（P<0.05）。见图 3c、3d。
2.4 ERα 干扰对二甲双胍抑制 Ishikawa 细胞增殖的影响
在相同雌激素处理的条件下，分别在二甲双胍处理 0 h 和 48 h 两个时相点，利用 MTT 法检测二甲双胍联合 shRNA-ERα 干扰处理条件下 Ishikawa 细胞的增殖情况。结果发现，二甲双胍处理 0 h 各组 Ishikawa 细胞增殖情况一致，说明在二甲双胍处理前各组细胞处于同一增殖水平。二甲双胍处理 48 h 后，在阴性对照 Ishikawa 细胞中，二甲双胍抑制了雌激素诱导的 Ishikawa 细胞增殖（P<0.05）；而在干扰 ERα 基因的 Ishikawa 细胞中，二甲双胍对 Ishikawa 细胞增殖的抑制作用消失（P>0.05）。见图 4a。
图4
ERα、ERβ干扰对二甲双胍抑制雌激素诱导的 Ishikawa 细胞增殖的影响
4 组细胞均在相同的雌激素处理条件下进行；shRNA-NC 表示阴性对照 shRNA，shRNA-ERα 表示针对 ERα 的 shRNA，shRNA-ERβ 表示针对 ERβ 的 shRNA，control 表示空白药物对照，Met 表示二甲双胍药物处理；*表示
2.5 ERβ 对二甲双胍抑制 Ishikawa 细胞增殖的影响
分别在二甲双胍处理 0 h 和 48 h 两个时相点，利用 MTT 法检测二甲双胍联合 shRNA-ERβ 干扰处理条件下 Ishikawa 细胞的增殖情况。结果发现，在相同雌激素处理情况下，二甲双胍处理 0 h 各组 Ishikawa 细胞增殖处于同一基线水平。二甲双胍处理 48 h 后，在阴性对照 Ishikawa 细胞中，二甲双胍抑制了 Ishikawa 细胞的增殖（P<0.05）；而在干扰 ERβ 基因的 Ishikawa 细胞中，二甲双胍对 Ishikawa 细胞增殖的抑制作用消失（P>0.05）。见图 4b。
3 讨论
子宫内膜癌是雌激素依赖性的妇科恶性肿瘤，雌激素水平与子宫内膜癌的发生发展密切相关[9]。雌二醇是生物学效应最强、体内含量最丰富的雌激素；ER 是核受体超家族的成员之一，雌二醇与 ER 的配体结合域结合后，激活 ER 入核，并作用于靶基因上游启动子区域的雌激素反应元件，诱导下游基因转录[10]。ER 具有 2 种亚型（ERα 和 ERβ），分别由不同的基因编码，尽管 ERα 和 ERβ 具有相似的蛋白结构，但最近的研究发现，ERα 和 ERβ 具有不同的信号转导途径，发挥不同甚至相反的生物学活性[11]。在细胞功能上，ERα 和 ERβ 也可能介导不同的生物学效应，ERα 主要介导上皮细胞的分化和增殖，ERβ 则主要介导细胞的凋亡反应[12]。在表达模式上，在 ERα 和 ERβ 共存的乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜肿瘤发展恶化过程中，ERβ 表达逐渐降低而 ERα 表达则增加[13-14]。由此可见，ERα 和 ERβ 两种亚型表达失衡可能是激素依赖性肿瘤如子宫内膜癌发生的一个关键步骤，提示 ERα 和 ERβ 可能在子宫内膜癌发生发展过程中具有不同的生物学功能，因此有必要深入研究 ERα 和 ERβ 在雌激素诱导的子宫内膜癌细胞增殖中的作用。
本研究利用慢病毒载体分别构建了 ERα 干扰 Ishikawa 细胞模型和 ERβ 干扰 Ishikawa 细胞模型。在无雌激素刺激的情况下，通过 MTT 实验发现干扰 ERα 的表达可以抑制 Ishikawa 细胞的增殖，与之相反干扰 ERβ 的表达则可以促进 Ishikawa 细胞的增殖。此外，通过流式细胞术检测发现，干扰 ERα 的表达可以阻滞 Ishikawa 细胞周期，干扰 ERβ 的表达则可以促进 Ishikawa 细胞周期从 G1 期进入 S 期。CyclinD1 为目前公认的癌基因，可以驱动细胞由 G1 期进入 S 期进而促进细胞增殖[15]。P21 蛋白功能与之相反，通过抑制 cyclinD1-CDK4 和 cyclinE-CDK2 的活性，使细胞周期停滞在 G1 期，从而抑制肿瘤的发生发展[16]。我们针对性地研究了 cyclinD1 和 P21 的表达变化，发现两种蛋白 mRNA 和蛋白水平的变化趋势与细胞增殖、周期结果一致。我们的研究结果也证实了 ERα 和 ERβ 可能通过调控细胞周期调节相关的蛋白 cyclinD1 和 P21 的表达，进而在子宫内膜癌细胞的增殖过程中发挥着不同的调节作用。
已有的研究表明，雌激素可以诱导子宫内膜癌细胞的增殖，因此我们利用雌二醇对子宫内膜癌细胞株进行刺激，观察在雌激素刺激的条件下 ERα 和 ERβ 对子宫内膜癌细胞增殖的影响。通过 MTT 和流式细胞术检测发现，单独雌激素处理可以显著促进 Ishikawa 细胞的增殖；在 ERα 干扰的 Ishikawa 细胞中，雌激素的促增殖作用消失；在 ERβ 干扰的 Ishikawa 细胞中，雌激素的促增殖作用则得到一定程度的增强。以上结果说明，在子宫内膜癌细胞的增殖过程中，ERα 和雌二醇可能具有协同促进的作用，而 ERβ 和雌二醇则可能具有一定的拮抗作用。此外，细胞周期调节相关的蛋白 cyclinD1 和 P21 的表达变化也与细胞周期结果一致。
二甲双胍为 2 型糖尿病的首选治疗药物[17]。近期流行病学与临床观察显示，二甲双胍可降低多种肿瘤的发病率，有望成为新的肿瘤治疗药物或辅助抗肿瘤药物[18]。相关机制研究表明，二甲双胍一方面可以调节肿瘤细胞的葡萄糖代谢和胰岛素敏感性，通过磷脂酰肌醇-3-羟激酶相关信号通路对肿瘤产生抑制作用，另一方面二甲双胍也可以进入肿瘤细胞内，直接活化腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）信号通路，抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡[19]。此外，二甲双胍也可能作用于免疫系统进行肿瘤抑制[20]。在子宫内膜癌中，二甲双胍可以抑制子宫内膜癌细胞的增殖并诱导其凋亡[21]。本课题组前期初步研究也发现，二甲双胍可以显著下调子宫内膜癌细胞 ERα 的表达而上调 ERβ 的表达，并且可能与 AMPK 信号通路的激活以及雷帕霉素受体蛋白信号通路的抑制有关[8]。然而，目前仍不清楚二甲双胍对子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用是否与 ERα 和 ERβ 直接相关。因此在本研究中，我们进一步研究了二甲双胍与 ER 两种因素对子宫内膜癌细胞增殖的综合影响。我们分别针对 ERα 干扰 Ishikawa 细胞模型和 ERβ 干扰 Ishikawa 细胞模型进行二甲双胍处理，结果发现单独二甲双胍处理可以显著抑制 Ishikawa 细胞的增殖能力；在 ERα 干扰的 Ishikawa 细胞中，二甲双胍抑制增殖的作用消失；在 ERβ 干扰的 Ishikawa 细胞中，二甲双胍抑制增殖的作用也消失。以上结果说明，二甲双胍对子宫内膜癌细胞的抑制作用可能通过 ERα 和 ERβ 介导。
综上，本研究结果显示 ERα 和 ERβ 在子宫内膜癌增殖过程中具有不同的生物学功能。ERα 可能促进雌激素诱导的子宫内膜癌细胞增殖，ERβ 则可能抑制雌激素诱导的子宫内膜癌细胞增殖，因此 ERα 和 ERβ 在子宫内膜癌中表达的比例可能对雌激素诱导细胞增殖具有重要的作用。此外，ERα 和 ERβ 可能通过调节细胞周期调控因子 cyclinD1 和 P21 的表达发挥生物学功能，并且可能介导了二甲双胍对子宫内膜癌细胞的抑制作用，为二甲双胍治疗子宫内膜癌的临床应用研究提供了新的理论依据。
