引用本文： 甘奇, 张晗媚, 马卫朝, 刘翼. 芬戈莫德对大鼠丘脑-脑室出血后继发性神经损伤的保护作用. 华西医学, 2018, 33(6): 736-743. doi: 10.7507/1002-0179.201805035 复制
原发性脑出血占脑血管病总体发病的 20%～30%，急性期内的病死率为 30%～40%[1]。过去 10 年，全球因脑出血而入院治疗的患者并未减少，其中约有 15% 为丘脑出血[2]。针对中等量丘脑出血破入脑室的患者，尚未能明确有效地改善预后的治疗方法。到目前为止，因血肿对丘脑造成结构上的破坏损伤，这类原发性损伤无论通过手术治疗还是内科治疗都无法修复。因此，对脑出血导致的各种继发性损伤的机制和干预的探究已经成为目前的研究热点。
芬戈莫德（FTY720）是近年来合成出的一种新型免疫抑制剂，其在体内具有双向免疫调节作用，在体内抑制免疫反应的同时，不产生机体对病毒免疫应答和免疫记忆的干扰[3-6]。FTY720 目前已被美国食品药品监督管理局批准成为治疗复发性多发性硬化的口服药物[7]。近年来关于 FTY720 的研究越来越多，除本身强大的免疫抑制作用外，FTY720 还被发现其通过对肿瘤细胞的凋亡、坏死、自噬的调控发挥抗肿瘤作用[8-10]。目前只有极少量文献报道 FTY720 在脑出血中可发挥一定的神经保护作用，其机制尚不明确[11-14]。本研究将基于丘脑-脑室出血（thalamic-ventricle hemorrhage，TH-IVH）动物模型构建基础上，探讨 FTY720 对大鼠 TH-IVH 后继发性神经损伤中的保护作用。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 实验动物
清洁级成年雄性 Sprague Dawley 大鼠 60 只，鼠龄 5～6 个月，体质量 400～500 g，由成都达硕实验动物公司提供。
1.1.2 饲养条件
四川大学华西医院神经外科研究室动物房内分笼喂养。动物房恒温：20～24℃；湿度环境：45%～55%；光照：12 h 明暗昼夜交替；自由进食及饮水。每只大鼠至少在动物房饲养 1 周后进行实验，实验大鼠术前 6 h 禁食、禁饮。
1.2 研究方法
1.2.1 实验动物分组
将实验动物随机分为 3 组，即假手术组（Sham 组）、TH-IVH 组和干预组（FTY720 组），每组 6 只大鼠。TH-IVH 组和 FTY720 组所有大鼠均建立 TH-IVH 模型，注入自体血 60 μL。FTY720 组大鼠在建模后的 0～7 d 均采用 FTY720（25 mg/支，冻干粉，美国 Sigma 公司）进行干预，腹腔注射量为 1 mg/kg，1 次/d。
1.2.2 大鼠 TH-IVH 模型建立
① 消毒相关手术器械及立体定向仪；实验人员佩戴口罩、洗手、带无菌手套；严格按照无菌要求，恒温载物台保持动物体温在（37.0±0.5）℃。② 大鼠术前 6 h 禁食、禁水，过电子天平称重后，记录体质量，采用 10% 水合氯醛，按 3.5 mL/kg 行腹腔注射麻醉，麻醉生效为触须反射及角膜反射消失，额顶部备皮。③ 将麻醉成功的大鼠，取俯卧位，将其门齿及双侧外耳道固定于脑立体定向仪上，保持前后囟门位于同一水平高度，左右对称。备皮处消毒，沿矢状线切开头皮约 1 cm，钝性分离肌肉及骨膜，暴露前囟及冠状缝。④ 用动物颅骨钻在距中线向右旁开 3 mm，前囟向后 3.6 mm 处钻孔，孔径 1 mm。⑤ 使用动脉穿刺针取足量自体股动脉血，并固定于微量注射器固定杆上。调整立体定向仪将针头对准颅骨钻孔位置。垂直缓慢进针，进针深度为皮质下 7.0 mm。⑥ 将自体动脉血通过旋转推进器匀速缓慢注入右侧丘脑区域，注射速度：10 μL/min。先以 10 μL/min 的速度通过微泵注入 10 μL，等待 10 min 后，以相同速度注入剩余自体全血量 50 μL，定位点：前囟后 3.5 mm，右侧中线旁开 3.0 mm，深度 7.0 mm。留针 15 min 后缓慢退针，医用骨蜡封闭骨孔，消毒缝合各个切口，置于 37℃温箱内保温复苏。⑦ 在 Sham 组中，只进针，不采血，不注血，针头留置相同时间。
1.3 观察指标
观察时间点选取建模后 1、3、7 d，主要观察指标为各组神经功能评分、连续体质量变化、脑组织含水量测定、免疫组织化学法测量炎症细胞活化程度、免疫荧光法测定神经元变性及凋亡水平、蛋白质印迹法测量蛋白表达水平。
1.3.1 体质量变化测量
大鼠建模后分别连续测量体质量，采用百分比法观察建模后实验动物模型的体质量变化。绘制体质量变化曲线。选取各组建模后 1、3、7 d 时间点的体质量变化作比较。体质量变化计算公式：体质量变化（%）=（观察时间点体质量–初始体质量）/初始体质量×100%。
1.3.2 神经功能检测评分
采用大鼠改良 Voetsch 评分量表[15]。建模后的大鼠连续测量神经功能评分，评估各组大鼠建模后的神经功能损伤变化。选取各组建模后 1、3、7 d 时间点的分值作比较。
1.3.3 脑组织含水量的测定
采用干湿重差值测定大鼠建模后 1、3、7 d 建模侧丘脑的脑组织含水量，比较各组大鼠脑组织水肿程度。脑组织含水量计算公式：含水量（%）=（湿重–干重）/湿重×100%。
1.3.4 免疫荧光法测定神经元变性
采用免疫荧光探针（Fluoro-Jade C，FJC）观察测定各组模型神经元变性情况。FJC 阳性细胞为绿色荧光显示，提示变性神经元。
1.3.5 细胞凋亡检测
凋亡神经元中双链 DNA 损伤断裂，采用 TUNEL 法可以原位标记出这些断裂的 DNA，借助荧光素从而能够评估细胞凋亡水平。凋亡神经元细胞核显示为绿色荧光，呈绿色点状。有核细胞的细胞核通过 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）复染，其细胞核呈蓝色点状。
1.3.6 免疫组织化学检测炎症细胞活化程度
脑出血等病理条件下，脑组织中处于静息状态下的小胶质细胞可迅速活化、增殖。其在清除来自损伤部位的死亡细胞的同时，参与形成继发性脑损伤，通过小胶质细胞标志物 IBA-1 检测其活化程度，采用 IBA-1 抗体标示出模型鼠脑组织中的活化小胶质细胞。IBA-1 阳性提示小胶质细胞活化。阳性细胞呈现为绿色荧光，有核细胞的细胞核通过 DAPI 复染，其细胞核呈蓝色点状。
1.3.7 蛋白质印迹法
采用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达水平。检测自噬体标记蛋白（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）的表达。采用 LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ比值作为神经元自噬水平高低的反应。检测Bcl-2与Bax两种基因表达。采用Bcl-2/Bax比值作为神经元凋亡水平的反应。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 18.0 软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示。组间比较采用重复测量资料的方差分析，并采用 Multivariate 过程实现 TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组之间比较。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 体质量变化测量
连续检测各组大鼠建模后的体质量变化。Sham 组建模后 1 d 体质量下降，此后连续回升，7 d 后超过建模前；FTY720 组与 TH-IVH 组体质量总体呈连续下降趋势，7 d 时体质量下降趋于稳定。在建模后 1、3、7 d，TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组体质量变化差异有统计学意义（P<0.01）。见表 1。
表1
建模后各组相关指标比较（n=6，
）
2.2 神经功能检测评分
Sham 组建模后 1 d 神经功能评分下降，此后逐渐缓慢回升；FTY720 组与 TH-IVH 组均出现明显神经功能障碍，评分明显大幅下降，此后逐步回升。在建模后 1、3、7 d，TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组的神经功能评分差异有统计学意义（P<0.01）。见表 1。
2.3 脑组织含水量的测定
Sham 组的脑组织含水量在建模后 1、3、7 d 无明显变化趋势；FTY720 组与 TH-IVH 组从建模后 1 d 开始脑组织水肿程度增加，3 d 左右达到水肿高峰，7 d 水肿程度有所回落，TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组脑组织含水量差异有统计学意义（P<0.01）。见表 1。
2.4 免疫荧光法测定神经元变性
Sham 组于建模后 1、3、7 d，阳性细胞数均极少，无明显变化趋势；FTY720 组与 TH-IVH 组建模 1 d 后，阳性细胞数明显升高，3 d 后阳性细胞数减少，7 d 后阳性细胞进一步减少但两组数量仍明显多于 Sham 组（图 1）。建模后 1、3 d，TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组比较，FJC 阳性细胞数的差异均有统计学意义（P<0.05）；7 d 时，TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组差异均无统计学意义。见表 1。
图1
各组大鼠 FJC 阳性细胞数/视野
2.5 神经元细胞凋亡检测
建模后 1 d，TH-IVH 组与 FTY720 组血肿周围 TUNEL 阳性细胞明显增加，Sham 组数量稀少；建模 3、7 d 后，Sham 组数量缓慢减少，TH-IVH 组与 FTY720 组血肿周围阳性细胞持续减少（图 2）。TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组比较，建模后 1、3 d 阳性细胞数差异有统计学意义（P<0.05），建模后 7 d 时差异无统计学意义。见表 1。
图2
各组大鼠 TUNEL 阳性细胞数/视野
2.6 免疫组织化学检测炎症细胞活化程度
Sham 组在建模后 1、3、7 d 阳性细胞数均很少，无明显变化趋势。FTY720 组和 TH-IVH 组在建模 1 d 后，血肿周围区域发现少量阳性细胞聚集，建模 3 d 后两组阳性细胞数量增加，建模 7 d 后两组进一步增加，明显高于 Sham 组（图 3）。TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组比较， 1、3、7 d 阳性细胞数的差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
图3
各组大鼠 IBA-1 阳性细胞数/视野
2.7 蛋白质印迹法
FTY720 组与 TH-IVH 组的 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达比值中，建模后 1、3 d 时差异均有统计学意义（1.40±0.15vs.0.31±0.08，1.13±0.17 vs. 0.22±0.02，P<0.05），7 d 时差异无统计学意义（0.17±0.06vs. 0.11±0.03，P=0.31）。FTY720 组与 TH-IVH 组建模后 1、3 d 时 Bcl-2/Bax表达比值差异均有统计学意义（1.16±0.11vs. 0.32±0.07，1.80±0.12vs. 0.73±0.05，P<0.05），7 d 时差异无统计学意义（0.49±0.04vs. 0.45±0.05，P=0.95）。见图 4。
图4
蛋白质印迹法检测 TH-IVH 组与 FTY720 组中 LC3、Bcl-2、Bax的表达
a. LC3 的表达；b. Bcl-2、Bax 的表达
3 讨论
FTY720 是从冬虫夏草的培养液中提取后，经人工化学结构修饰合成的一种免疫抑制剂。在体内可被鞘氨醇激酶 2 磷酸化后与 S1PR 受体结合，发挥生物学作用。S1P 受体分为 S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5 共 5 个亚型，属于 G 偶联蛋白受体家族，在体内作为第二信使，其中脑组织中主要表达除 S1PR4 以外的 S1P 受体。FTY720 具有脂溶性，可以直接透过血脑屏障，作用于脑组织内的 S1P 受体，产生不同生物学效应[16-17]。
3.1 FTY720 在 TH-IVH 模型中发挥神经保护功能
在建模后，分别对 3 组大鼠进行了连续 7 d 体质量变化测量，结果发现 Sham 组建模后 1 d 体质量降低，之后体质量逐渐增高。FTY720 组体质量于建模 5 d 内呈持续下降趋势，建模 5 d 后体质量停止下降，TH-IVH 组体质量持续迅速下降，两组差异有统计学意义（P<0.05）。说明 FTY720 减缓了大鼠丘脑出血后体质量丢失程度。
神经功能评分方面，Sham 组在建模后各时间点的神经功能评分没有表现出明显差别。FTY720 组在各时间点的神经功能评分均明显好于 TH-IVH 组，差异有统计学意义（P<0.05）。表明 FTY720 改善了丘脑出血大鼠的神经功能损伤程度，产生神经功能保护作用。
脑组织含水量的测定方面，Sham 组在建模后 1、3、7 d 时间点的脑组织含水量无明显变化。FTY720 组与 TH-IVH 组在建模 1 d 后开始出现脑水肿，建模后 3 d 达到水肿高峰，建模 7 d 时水肿程度有所缓解，两组相比，FTY720 组水肿程度相对较轻，差异有统计学意义（P<0.05）。提示 FTY720 减轻了丘脑出血大鼠脑组织水肿程度。
以上结果说明，FTY720 在发生丘脑出血的早期，可减轻大鼠体质量丢失、减轻脑水肿程度，改善恶化的神经功能，表现出神经保护作用，这与已有研究[14, 18]结果一致。
3.2 FTY720 减轻 TH-IVH 模型的炎性反应
通过免疫组织化学法荧光双染，用 IBA-1 标记活化的小胶质细胞，Sham 组建模后针道周围见少量阳性细胞；TH-IVH 组建模 1 d 后，可见血肿周围出现少量阳性细胞，建模 3、7 d 后，阳性细胞大量聚集于血肿四周；FTY720 组建模 1 d 局部可见分散的阳性细胞，建模后 3、7 d 时，阳性细胞出现聚集，但数量明显少于 TH-IVH 组，差异有统计学意义（P<0.05）。提示 FTY720 对小胶质细胞的活化有抑制作用，减少了血肿周围的炎症反应。早前的研究表明，FTY720 可以促进外周血液淋巴细胞归巢，改善血管通透性，减少炎症介质释放进入脑组织内的数量，抑制脑组织内炎性细胞的聚集，减轻炎症反应[13，19-20]。
3.3 FTY720 降低 TH-IVH 模型早期神经元变性与凋亡水平
Sham 组观察到极个别的变性和凋亡的阳性神经元。在 TH-IVH 组中，变性神经元和凋亡神经元在建模后 1 d 达到高峰，建模后 3、7 d 逐渐减少，FTY720 显著降低了 FTY720 组阳性细胞的数量，提示 FTY720 可以减少神经元细胞变性死亡数量，对丘脑出血后继发性脑损伤有潜在改善能力。
为了进一步确定 FTY720 在脑出血中是否诱导神经元凋亡作用，后续筛查了凋亡指标Bcl-2、Bax。凋亡作为一种细胞程序性死亡的方式，分为外源性途径和内源性途径，Bcl-2与Bax在细胞凋亡的两种途径中，都发挥调控作用。一般认为，Bcl-2具有抑制凋亡作用，而Bax在促进凋亡发生的同时可以拮抗Bcl-2[21-22]。通常以Bcl-2/Bax表达比值来说明凋亡水平，比值升高，凋亡水平降低，比值降低，凋亡水平增加。结果发现，FTY720 组Bcl-2表达在建模后 1、3 d 明显增加，FTY720 组与 TH-IVH 组Bcl-2/Bax表达比值在 1、3 d 差异有统计学意义，7 d 时差异无统计学意义。提示在建模后 3 d，FTY720 通过上调Bcl-2，提高Bcl-2/Bax比值抑制神经元凋亡水平。
TH-IVH 组与 Sham 组、FTY720 组与 TH-IVH 组建模后 7 d 的神经元变性水平和神经元凋亡数量的差异无统计学意义。既往的研究显示，神经元凋亡一般在脑损伤后 24～72 h 达到高峰，72 h 后凋亡水平降低[23-24]。本研究中建模后 7 d 观察到的变化趋势与先前的研究一致。
3.4 FTY720 提高 TH-IVH 模型自噬水平
自噬是一种细胞自我代谢的现象，由 Ashford 等[25]在 1962 年首先于肝细胞中发现，是对细胞中衰老或错位的细胞器和细胞质成分的降解与重复利用活动。真核细胞中自噬非常普遍，一方面其参与细胞的正常生命活动，是细胞对缺氧、饥饿、炎症、损失等不良环境的防御机制；另一方面，自噬在多种疾病的病理生理过程中也扮演着不同角色。因此自噬在细胞生命周期具有两面性[26]。
LC3 为检测自噬水平的常规标志物，分为 LC3Ⅰ型和 LC3Ⅱ型。自噬发生时，由处于胞浆中的 LC3Ⅰ型转化为 LC3Ⅱ型，结合在自噬体膜上启动自噬发生。常用 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值作为监测自噬水平的指标，比值升高提示自噬水平增加。
为确定 FTY720 的神经保护作用是否涉及到自噬途径，本研究检测了 LC3 蛋白的表达。结果发现，FTY720 组与 TH-IVH 组在建模后 1、3 d 的 LC3Ⅱ型蛋白表达增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，差异有统计学意义（P<0.05）；7 d 时两组 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值相仿，差异无统计学意义（P>0.05）。因此，可推测 FTY720 通过提高神经元自噬水平，达到神经保护作用。
自噬和凋亡的联系十分紧密。细胞可以通过自噬来清除衰老细胞器和变性蛋白质，从而维持细胞内环境稳态，使细胞避免发生凋亡；当细胞内自噬水平增高，可促进细胞凋亡，进而加快细胞死亡；两者关系错综复杂，有各自不同的信号通路，也有共同的信号途径相互作用[27-28]。
本研究利用大鼠 TH-IVH 模型，验证了 FTY720 具有神经保护作用，并从神经元凋亡和自噬水平的改变，推测其神经保护作用可能通过以下 2 个方面发挥：① 在丘脑出血早期，通过提高血肿周围神经元自噬水平，降低神经元凋亡水平，减少了神经元死亡，从而发挥神经保护作用；② 在丘脑出血恢复期，通过免疫抑制作用，减少血肿周围的炎性细胞聚集，减轻炎症反应带来的继发性神经损伤。
本研究也存在一些不足。FTY720 有多种不同功能，在多种不同细胞中，具有细胞特异性。本实验没有单独设立自噬抑制剂和自噬诱导剂的对照组，因此，只能从现有结果中单方面推测 FTY720 的神经保护机制与促进自噬、抑制凋亡和免疫抑制有关。然而，FTY720 是否同时通过其他通路和机制产生了神经保护作用，还不得而知，后期可进一步深入研究。
综上所述，FTY720 能改善大鼠 TH-IVH 模型急性期的神经功能，减轻体质量丢失，减轻脑水肿，减轻炎症反应，具有一定神经保护作用；FTY720 的神经保护作用机制可能与出血后早期促进神经元自噬水平提高，抑制神经元凋亡有关；另外，FTY720 具有免疫抑制作用，能减少血肿周围的炎性细胞聚集，减轻炎症反应带来的继发性神经损伤，可能是其神经保护作用的另一机制。
原发性脑出血占脑血管病总体发病的 20%～30%，急性期内的病死率为 30%～40%[1]。过去 10 年，全球因脑出血而入院治疗的患者并未减少，其中约有 15% 为丘脑出血[2]。针对中等量丘脑出血破入脑室的患者，尚未能明确有效地改善预后的治疗方法。到目前为止，因血肿对丘脑造成结构上的破坏损伤，这类原发性损伤无论通过手术治疗还是内科治疗都无法修复。因此，对脑出血导致的各种继发性损伤的机制和干预的探究已经成为目前的研究热点。
芬戈莫德（FTY720）是近年来合成出的一种新型免疫抑制剂，其在体内具有双向免疫调节作用，在体内抑制免疫反应的同时，不产生机体对病毒免疫应答和免疫记忆的干扰[3-6]。FTY720 目前已被美国食品药品监督管理局批准成为治疗复发性多发性硬化的口服药物[7]。近年来关于 FTY720 的研究越来越多，除本身强大的免疫抑制作用外，FTY720 还被发现其通过对肿瘤细胞的凋亡、坏死、自噬的调控发挥抗肿瘤作用[8-10]。目前只有极少量文献报道 FTY720 在脑出血中可发挥一定的神经保护作用，其机制尚不明确[11-14]。本研究将基于丘脑-脑室出血（thalamic-ventricle hemorrhage，TH-IVH）动物模型构建基础上，探讨 FTY720 对大鼠 TH-IVH 后继发性神经损伤中的保护作用。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 实验动物
清洁级成年雄性 Sprague Dawley 大鼠 60 只，鼠龄 5～6 个月，体质量 400～500 g，由成都达硕实验动物公司提供。
1.1.2 饲养条件
四川大学华西医院神经外科研究室动物房内分笼喂养。动物房恒温：20～24℃；湿度环境：45%～55%；光照：12 h 明暗昼夜交替；自由进食及饮水。每只大鼠至少在动物房饲养 1 周后进行实验，实验大鼠术前 6 h 禁食、禁饮。
1.2 研究方法
1.2.1 实验动物分组
将实验动物随机分为 3 组，即假手术组（Sham 组）、TH-IVH 组和干预组（FTY720 组），每组 6 只大鼠。TH-IVH 组和 FTY720 组所有大鼠均建立 TH-IVH 模型，注入自体血 60 μL。FTY720 组大鼠在建模后的 0～7 d 均采用 FTY720（25 mg/支，冻干粉，美国 Sigma 公司）进行干预，腹腔注射量为 1 mg/kg，1 次/d。
1.2.2 大鼠 TH-IVH 模型建立
① 消毒相关手术器械及立体定向仪；实验人员佩戴口罩、洗手、带无菌手套；严格按照无菌要求，恒温载物台保持动物体温在（37.0±0.5）℃。② 大鼠术前 6 h 禁食、禁水，过电子天平称重后，记录体质量，采用 10% 水合氯醛，按 3.5 mL/kg 行腹腔注射麻醉，麻醉生效为触须反射及角膜反射消失，额顶部备皮。③ 将麻醉成功的大鼠，取俯卧位，将其门齿及双侧外耳道固定于脑立体定向仪上，保持前后囟门位于同一水平高度，左右对称。备皮处消毒，沿矢状线切开头皮约 1 cm，钝性分离肌肉及骨膜，暴露前囟及冠状缝。④ 用动物颅骨钻在距中线向右旁开 3 mm，前囟向后 3.6 mm 处钻孔，孔径 1 mm。⑤ 使用动脉穿刺针取足量自体股动脉血，并固定于微量注射器固定杆上。调整立体定向仪将针头对准颅骨钻孔位置。垂直缓慢进针，进针深度为皮质下 7.0 mm。⑥ 将自体动脉血通过旋转推进器匀速缓慢注入右侧丘脑区域，注射速度：10 μL/min。先以 10 μL/min 的速度通过微泵注入 10 μL，等待 10 min 后，以相同速度注入剩余自体全血量 50 μL，定位点：前囟后 3.5 mm，右侧中线旁开 3.0 mm，深度 7.0 mm。留针 15 min 后缓慢退针，医用骨蜡封闭骨孔，消毒缝合各个切口，置于 37℃温箱内保温复苏。⑦ 在 Sham 组中，只进针，不采血，不注血，针头留置相同时间。
1.3 观察指标
观察时间点选取建模后 1、3、7 d，主要观察指标为各组神经功能评分、连续体质量变化、脑组织含水量测定、免疫组织化学法测量炎症细胞活化程度、免疫荧光法测定神经元变性及凋亡水平、蛋白质印迹法测量蛋白表达水平。
1.3.1 体质量变化测量
大鼠建模后分别连续测量体质量，采用百分比法观察建模后实验动物模型的体质量变化。绘制体质量变化曲线。选取各组建模后 1、3、7 d 时间点的体质量变化作比较。体质量变化计算公式：体质量变化（%）=（观察时间点体质量–初始体质量）/初始体质量×100%。
1.3.2 神经功能检测评分
采用大鼠改良 Voetsch 评分量表[15]。建模后的大鼠连续测量神经功能评分，评估各组大鼠建模后的神经功能损伤变化。选取各组建模后 1、3、7 d 时间点的分值作比较。
1.3.3 脑组织含水量的测定
采用干湿重差值测定大鼠建模后 1、3、7 d 建模侧丘脑的脑组织含水量，比较各组大鼠脑组织水肿程度。脑组织含水量计算公式：含水量（%）=（湿重–干重）/湿重×100%。
1.3.4 免疫荧光法测定神经元变性
采用免疫荧光探针（Fluoro-Jade C，FJC）观察测定各组模型神经元变性情况。FJC 阳性细胞为绿色荧光显示，提示变性神经元。
1.3.5 细胞凋亡检测
凋亡神经元中双链 DNA 损伤断裂，采用 TUNEL 法可以原位标记出这些断裂的 DNA，借助荧光素从而能够评估细胞凋亡水平。凋亡神经元细胞核显示为绿色荧光，呈绿色点状。有核细胞的细胞核通过 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）复染，其细胞核呈蓝色点状。
1.3.6 免疫组织化学检测炎症细胞活化程度
脑出血等病理条件下，脑组织中处于静息状态下的小胶质细胞可迅速活化、增殖。其在清除来自损伤部位的死亡细胞的同时，参与形成继发性脑损伤，通过小胶质细胞标志物 IBA-1 检测其活化程度，采用 IBA-1 抗体标示出模型鼠脑组织中的活化小胶质细胞。IBA-1 阳性提示小胶质细胞活化。阳性细胞呈现为绿色荧光，有核细胞的细胞核通过 DAPI 复染，其细胞核呈蓝色点状。
1.3.7 蛋白质印迹法
采用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达水平。检测自噬体标记蛋白（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）的表达。采用 LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ比值作为神经元自噬水平高低的反应。检测Bcl-2与Bax两种基因表达。采用Bcl-2/Bax比值作为神经元凋亡水平的反应。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 18.0 软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示。组间比较采用重复测量资料的方差分析，并采用 Multivariate 过程实现 TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组之间比较。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 体质量变化测量
连续检测各组大鼠建模后的体质量变化。Sham 组建模后 1 d 体质量下降，此后连续回升，7 d 后超过建模前；FTY720 组与 TH-IVH 组体质量总体呈连续下降趋势，7 d 时体质量下降趋于稳定。在建模后 1、3、7 d，TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组体质量变化差异有统计学意义（P<0.01）。见表 1。
表1
建模后各组相关指标比较（n=6，
）
2.2 神经功能检测评分
Sham 组建模后 1 d 神经功能评分下降，此后逐渐缓慢回升；FTY720 组与 TH-IVH 组均出现明显神经功能障碍，评分明显大幅下降，此后逐步回升。在建模后 1、3、7 d，TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组的神经功能评分差异有统计学意义（P<0.01）。见表 1。
2.3 脑组织含水量的测定
Sham 组的脑组织含水量在建模后 1、3、7 d 无明显变化趋势；FTY720 组与 TH-IVH 组从建模后 1 d 开始脑组织水肿程度增加，3 d 左右达到水肿高峰，7 d 水肿程度有所回落，TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组脑组织含水量差异有统计学意义（P<0.01）。见表 1。
2.4 免疫荧光法测定神经元变性
Sham 组于建模后 1、3、7 d，阳性细胞数均极少，无明显变化趋势；FTY720 组与 TH-IVH 组建模 1 d 后，阳性细胞数明显升高，3 d 后阳性细胞数减少，7 d 后阳性细胞进一步减少但两组数量仍明显多于 Sham 组（图 1）。建模后 1、3 d，TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组比较，FJC 阳性细胞数的差异均有统计学意义（P<0.05）；7 d 时，TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组差异均无统计学意义。见表 1。
图1
各组大鼠 FJC 阳性细胞数/视野
2.5 神经元细胞凋亡检测
建模后 1 d，TH-IVH 组与 FTY720 组血肿周围 TUNEL 阳性细胞明显增加，Sham 组数量稀少；建模 3、7 d 后，Sham 组数量缓慢减少，TH-IVH 组与 FTY720 组血肿周围阳性细胞持续减少（图 2）。TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组比较，建模后 1、3 d 阳性细胞数差异有统计学意义（P<0.05），建模后 7 d 时差异无统计学意义。见表 1。
图2
各组大鼠 TUNEL 阳性细胞数/视野
2.6 免疫组织化学检测炎症细胞活化程度
Sham 组在建模后 1、3、7 d 阳性细胞数均很少，无明显变化趋势。FTY720 组和 TH-IVH 组在建模 1 d 后，血肿周围区域发现少量阳性细胞聚集，建模 3 d 后两组阳性细胞数量增加，建模 7 d 后两组进一步增加，明显高于 Sham 组（图 3）。TH-IVH 组与 Sham 组、TH-IVH 组与 FTY720 组比较， 1、3、7 d 阳性细胞数的差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
图3
各组大鼠 IBA-1 阳性细胞数/视野
2.7 蛋白质印迹法
FTY720 组与 TH-IVH 组的 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达比值中，建模后 1、3 d 时差异均有统计学意义（1.40±0.15vs.0.31±0.08，1.13±0.17 vs. 0.22±0.02，P<0.05），7 d 时差异无统计学意义（0.17±0.06vs. 0.11±0.03，P=0.31）。FTY720 组与 TH-IVH 组建模后 1、3 d 时 Bcl-2/Bax表达比值差异均有统计学意义（1.16±0.11vs. 0.32±0.07，1.80±0.12vs. 0.73±0.05，P<0.05），7 d 时差异无统计学意义（0.49±0.04vs. 0.45±0.05，P=0.95）。见图 4。
图4
蛋白质印迹法检测 TH-IVH 组与 FTY720 组中 LC3、Bcl-2、Bax的表达
a. LC3 的表达；b. Bcl-2、Bax 的表达
3 讨论
FTY720 是从冬虫夏草的培养液中提取后，经人工化学结构修饰合成的一种免疫抑制剂。在体内可被鞘氨醇激酶 2 磷酸化后与 S1PR 受体结合，发挥生物学作用。S1P 受体分为 S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5 共 5 个亚型，属于 G 偶联蛋白受体家族，在体内作为第二信使，其中脑组织中主要表达除 S1PR4 以外的 S1P 受体。FTY720 具有脂溶性，可以直接透过血脑屏障，作用于脑组织内的 S1P 受体，产生不同生物学效应[16-17]。
3.1 FTY720 在 TH-IVH 模型中发挥神经保护功能
在建模后，分别对 3 组大鼠进行了连续 7 d 体质量变化测量，结果发现 Sham 组建模后 1 d 体质量降低，之后体质量逐渐增高。FTY720 组体质量于建模 5 d 内呈持续下降趋势，建模 5 d 后体质量停止下降，TH-IVH 组体质量持续迅速下降，两组差异有统计学意义（P<0.05）。说明 FTY720 减缓了大鼠丘脑出血后体质量丢失程度。
神经功能评分方面，Sham 组在建模后各时间点的神经功能评分没有表现出明显差别。FTY720 组在各时间点的神经功能评分均明显好于 TH-IVH 组，差异有统计学意义（P<0.05）。表明 FTY720 改善了丘脑出血大鼠的神经功能损伤程度，产生神经功能保护作用。
脑组织含水量的测定方面，Sham 组在建模后 1、3、7 d 时间点的脑组织含水量无明显变化。FTY720 组与 TH-IVH 组在建模 1 d 后开始出现脑水肿，建模后 3 d 达到水肿高峰，建模 7 d 时水肿程度有所缓解，两组相比，FTY720 组水肿程度相对较轻，差异有统计学意义（P<0.05）。提示 FTY720 减轻了丘脑出血大鼠脑组织水肿程度。
以上结果说明，FTY720 在发生丘脑出血的早期，可减轻大鼠体质量丢失、减轻脑水肿程度，改善恶化的神经功能，表现出神经保护作用，这与已有研究[14, 18]结果一致。
3.2 FTY720 减轻 TH-IVH 模型的炎性反应
通过免疫组织化学法荧光双染，用 IBA-1 标记活化的小胶质细胞，Sham 组建模后针道周围见少量阳性细胞；TH-IVH 组建模 1 d 后，可见血肿周围出现少量阳性细胞，建模 3、7 d 后，阳性细胞大量聚集于血肿四周；FTY720 组建模 1 d 局部可见分散的阳性细胞，建模后 3、7 d 时，阳性细胞出现聚集，但数量明显少于 TH-IVH 组，差异有统计学意义（P<0.05）。提示 FTY720 对小胶质细胞的活化有抑制作用，减少了血肿周围的炎症反应。早前的研究表明，FTY720 可以促进外周血液淋巴细胞归巢，改善血管通透性，减少炎症介质释放进入脑组织内的数量，抑制脑组织内炎性细胞的聚集，减轻炎症反应[13，19-20]。
3.3 FTY720 降低 TH-IVH 模型早期神经元变性与凋亡水平
Sham 组观察到极个别的变性和凋亡的阳性神经元。在 TH-IVH 组中，变性神经元和凋亡神经元在建模后 1 d 达到高峰，建模后 3、7 d 逐渐减少，FTY720 显著降低了 FTY720 组阳性细胞的数量，提示 FTY720 可以减少神经元细胞变性死亡数量，对丘脑出血后继发性脑损伤有潜在改善能力。
为了进一步确定 FTY720 在脑出血中是否诱导神经元凋亡作用，后续筛查了凋亡指标Bcl-2、Bax。凋亡作为一种细胞程序性死亡的方式，分为外源性途径和内源性途径，Bcl-2与Bax在细胞凋亡的两种途径中，都发挥调控作用。一般认为，Bcl-2具有抑制凋亡作用，而Bax在促进凋亡发生的同时可以拮抗Bcl-2[21-22]。通常以Bcl-2/Bax表达比值来说明凋亡水平，比值升高，凋亡水平降低，比值降低，凋亡水平增加。结果发现，FTY720 组Bcl-2表达在建模后 1、3 d 明显增加，FTY720 组与 TH-IVH 组Bcl-2/Bax表达比值在 1、3 d 差异有统计学意义，7 d 时差异无统计学意义。提示在建模后 3 d，FTY720 通过上调Bcl-2，提高Bcl-2/Bax比值抑制神经元凋亡水平。
TH-IVH 组与 Sham 组、FTY720 组与 TH-IVH 组建模后 7 d 的神经元变性水平和神经元凋亡数量的差异无统计学意义。既往的研究显示，神经元凋亡一般在脑损伤后 24～72 h 达到高峰，72 h 后凋亡水平降低[23-24]。本研究中建模后 7 d 观察到的变化趋势与先前的研究一致。
3.4 FTY720 提高 TH-IVH 模型自噬水平
自噬是一种细胞自我代谢的现象，由 Ashford 等[25]在 1962 年首先于肝细胞中发现，是对细胞中衰老或错位的细胞器和细胞质成分的降解与重复利用活动。真核细胞中自噬非常普遍，一方面其参与细胞的正常生命活动，是细胞对缺氧、饥饿、炎症、损失等不良环境的防御机制；另一方面，自噬在多种疾病的病理生理过程中也扮演着不同角色。因此自噬在细胞生命周期具有两面性[26]。
LC3 为检测自噬水平的常规标志物，分为 LC3Ⅰ型和 LC3Ⅱ型。自噬发生时，由处于胞浆中的 LC3Ⅰ型转化为 LC3Ⅱ型，结合在自噬体膜上启动自噬发生。常用 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值作为监测自噬水平的指标，比值升高提示自噬水平增加。
为确定 FTY720 的神经保护作用是否涉及到自噬途径，本研究检测了 LC3 蛋白的表达。结果发现，FTY720 组与 TH-IVH 组在建模后 1、3 d 的 LC3Ⅱ型蛋白表达增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，差异有统计学意义（P<0.05）；7 d 时两组 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值相仿，差异无统计学意义（P>0.05）。因此，可推测 FTY720 通过提高神经元自噬水平，达到神经保护作用。
自噬和凋亡的联系十分紧密。细胞可以通过自噬来清除衰老细胞器和变性蛋白质，从而维持细胞内环境稳态，使细胞避免发生凋亡；当细胞内自噬水平增高，可促进细胞凋亡，进而加快细胞死亡；两者关系错综复杂，有各自不同的信号通路，也有共同的信号途径相互作用[27-28]。
本研究利用大鼠 TH-IVH 模型，验证了 FTY720 具有神经保护作用，并从神经元凋亡和自噬水平的改变，推测其神经保护作用可能通过以下 2 个方面发挥：① 在丘脑出血早期，通过提高血肿周围神经元自噬水平，降低神经元凋亡水平，减少了神经元死亡，从而发挥神经保护作用；② 在丘脑出血恢复期，通过免疫抑制作用，减少血肿周围的炎性细胞聚集，减轻炎症反应带来的继发性神经损伤。
本研究也存在一些不足。FTY720 有多种不同功能，在多种不同细胞中，具有细胞特异性。本实验没有单独设立自噬抑制剂和自噬诱导剂的对照组，因此，只能从现有结果中单方面推测 FTY720 的神经保护机制与促进自噬、抑制凋亡和免疫抑制有关。然而，FTY720 是否同时通过其他通路和机制产生了神经保护作用，还不得而知，后期可进一步深入研究。
综上所述，FTY720 能改善大鼠 TH-IVH 模型急性期的神经功能，减轻体质量丢失，减轻脑水肿，减轻炎症反应，具有一定神经保护作用；FTY720 的神经保护作用机制可能与出血后早期促进神经元自噬水平提高，抑制神经元凋亡有关；另外，FTY720 具有免疫抑制作用，能减少血肿周围的炎性细胞聚集，减轻炎症反应带来的继发性神经损伤，可能是其神经保护作用的另一机制。
