引用本文： 杨菁玉, 王晓辉, 黄亮, 俞汝佳, 宗志勇. 复发的炎症性肠病患者中艰难梭菌的临床实验室检测. 华西医学, 2017, 32(3): 324-328. doi: 10.7507/1002-0179.201701036 复制
艰难梭菌是革兰阳性（ G+） 厌氧芽孢杆菌，分为产毒的艰难梭菌和不产毒的艰难梭菌 2 种类型，能通过接触传播在人群中尤其是疾病宿主集中的医院内广泛播散。它几乎无侵袭性，但产毒株可分泌毒素 A、B 和二元毒素（binary toxin，CDT）致病。由于细菌毒株生物学特性和宿主的免疫状态不同，产毒的艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）对宿主造成的影响可以是无症状携带、轻度腹泻、致死性肠炎，后者会显著延长住院时间，增加医疗花费，甚至威胁患者生命[1]。
艰难梭菌的芽孢在医院环境中可存活 5 个月以上，不易被常用的物理和化学消毒法杀灭，故一旦感染暴发会造成持续感染。要做好艰难梭菌医院感染防控，早期识别和隔离感染者是关键。与其他人群相比，炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）患者中 CDI 的发病率较高，复发率可以高达 1/3[2-3]。因此，美国胃肠病协会《CDI 的诊治与预防指南》强烈建议对复发的 IBD 患者进行艰难梭菌的检测[4]。
目前用于艰难梭菌实验室检测的方法较多，主要分为厌氧培养、核酸检测和酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）检测 3 种方式[4-5]。由于厌氧培养耗时耗力，对临床实验室的人力资源和设备物资要求较高，核酸检测和 EIA 检测的应用越来越受到重视。本研究探索了核酸粪便直接检测和 EIA 粪便直接检测在识别复发的 IBD 患者合并 CDI 中的临床应用，旨在帮助早期识别和隔离 CDI 患者，为医院感染防控提供更好的技术支持。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
本研究标本来源为四川大学华西医院 2014 年 11 月—2015 年 4 月入院复发的 IBD 患者。以 2010 年英国胃肠病学会《成人 IBD 诊治指南》为参照，纳入标准：① 年龄>16 岁；② 既往消化专科医生诊断为 IBD；③ 影像学资料、消化内镜及组织学检查结果符合 IBD 诊断；④ 此次入院有腹痛、腹泻、血便等 IBD 复发的症状，消化专科医生认为符合 IBD 疾病的临床表现。排除标准：① 上消化道疾病；② 合并其他已知病原体感染的疾病（如细菌性痢疾、结核病、真菌性肠炎等）；③ 此次入院为症状首次发作。收集患者入院 48 h 内自然解出的 1 份大便，在 30 min 内送到实验室进行下列艰难梭菌检测。
1.2 研究方法
1.2.1 粪便厌氧培养和鉴定 所有粪便样本经过乙醇处理后均接种至少 3 个含 10% 的羊血艰难梭菌 CCFA 培养平板（英国 Oxoid 公司），37℃ 厌氧培养 72 h。对所有生长出的菌落进行革兰染色，挑取显微镜下菌落形态符合艰难梭菌的菌落在脑心浸出液肉汤中增菌。使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒（美国 Omega 公司）提取细菌DNA，参照既往发表的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物和反应条件，扩增艰难梭菌的看家基因tpi、A 毒素基因tcdA 和 B 毒素基因tcdB[6]。看家基因tpi 阳性的菌株，使用艰难梭菌快速检测试剂盒（美国 Alere TECHLAB 公司，型号 C.DIFF QUIK CHEK COMPLETE）进行 EIA 检测的毒素确认。其中，tpi 和tcdB 均扩增阳性，且 EIA 毒素检测阳性的细菌认定为产毒的艰难梭菌；仅tpi 扩增阳性，且 EIA 毒素检测阴性的细菌认定为非产毒的艰难梭菌。tcdA 和tcdB 均阳性的菌株，参照既往发表的 PCR 引物和反应条件，扩增 CDT 基因cdtA 和cdtB[7]。
1.2.2 核酸粪便直接检测 所有粪便样本均使用粪便 DNA 提取试剂盒（美国 Omega 公司）提取 DNA 供直接检测。参照既往发表的 PCR 引物和反应条件，扩增艰难梭菌的看家基因tpi、A 毒素基因tcdA 和 B 毒素基因tcdB[6]。其中，tpi 和tcdB 均扩增阳性的粪便样本认定为含产毒艰难梭菌的样本；仅tpi 扩增阳性的粪便样本认定为含非产毒艰难梭菌的样本。
1.2.3 EIA 粪便直接检测 所有粪便样本均使用艰难梭菌快速检测试剂盒（美国 Alere TECHLAB 公司，型号 C.DIFF QUIK CHEK COMPLETE）进行 EIA 直接检测。该试剂能检测的谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）抗原下限为 0.80 ng/mL，A 毒素下限为 0.63 ng/mL，B 毒素下限为 0.16 ng/mL。根据产品说明书操作，在测试管中依次加入稀释剂、结合剂，待其充分混匀后加入检测板的样品窗，室温下静置 15 min。在反应窗中加入缓冲液，待其完全吸收后加入底物，室温等待 10 min 后判读结果。根据反应窗显色带判读结果为下列 3 种类型：GDH 抗原阳性且毒素阳性的含产毒艰难梭菌的样本、仅 GDH 抗原阳性的含非产毒艰难梭菌的样本、GDH 抗原和毒素均阴性的不含艰难梭菌的样本。
1.2.4 PCR 扩增产物纯化、测序和比对 PCR 产物送华大基因用 ABI 3730xl DNA Analyzer（美国应用生物系统公司）双向测序。测序结果经 BLAST（）比对分析。PCR 测序引物即扩增引物。
1.3 统计学方法
使用 Stata 12.0 软件进行数据分析。以粪便厌氧培养和鉴定为参照，对 EIA 粪便直接检测和核酸粪便直接检测这 2 种检测方式，通过 Κappa 一致性检验进行比较。Κappa=1，表示 2 种方法完全一致；0.81<Κappa<1.00，表示 2 种方法非常一致；0.61<Κappa<0.80，表示两种方法基本一致；Κappa<0.60，表示 2 种方法一致性差。同时检验 Κappa 系数，P<0.05 表明结论可靠。
2 结果
2.1 样本基本资料
剔除重复送检的样本，本项目共纳入 48 份复发的 IBD 患者的非重复大便样本。其中男 32 份，女 16 份；年龄 14～68 岁，平均（40.46±17.85）岁。
2.2 方法比较
以粪便厌氧培养和鉴定的方法为基础，核酸粪便直接检测的结果与其完全一致（Κappa=1.00，P<0.05)。共检出了 11 份有艰难梭菌的样本，其中有 2 份样本检出了产毒的艰难梭菌。另外 37 份粪便未检出艰难梭菌。产毒艰难梭菌的样本占全体样本的 4.2%。与粪便培养和鉴定的方法相比，EIA 粪便直接检测的结果在抗原检测方面相似，在毒素检测方面有差异。EIA 粪便直接检测共检出了 13 份有艰难梭菌的样本，其中有 2 份样本是另外两种方法未检测出的，考虑为假阳性。在未检出艰难梭菌的样本和检出艰难梭菌的样本中，EIA 粪便直接检测结果与粪便厌氧培养和鉴定结果的一致性很高（Κappa=0.89，P<0.05)。在抗原检测方面，EIA 粪便直接检测和粪便厌氧培养和鉴定结果相似。EIA 粪便直接检测未检出毒素阳性的样本，即是未含产毒艰难梭菌的样本。但有 2 份样本，EIA 粪便直接检测的结果显示抗原检测阳性，毒素检测阴性；而核酸检测和厌氧培养鉴定这两种方法检测出的结果都是阳性。因此这 2 份样本的毒素检测结果考虑为假阴性。由于样本量小，在产毒艰难梭菌样本的检测及毒素检测方面，未做统计学分析。见图 1。
图1
粪便样本艰难梭菌检测结果比较 * Κappa 检验显示与厌氧培养和鉴定法相比，检验结果一致。未检出艰难梭菌样本组：该粪便样本 EIA 粪便直接检测 GDH 抗原和毒素检测均阴性，tpi 核酸粪便直接检测阴性，粪便厌氧培养未培养到艰难梭菌；检出艰难梭菌样本组：该粪便样本 EIA 粪便直接检测抗原检测阳性，tpi 核酸粪便直接检测阳性，粪便厌氧培养到了包括产毒株和非产毒株在内的艰难梭菌；检出产毒的艰难梭菌样本组：该粪便样本 EIA 粪便直接检测毒素检测阳性，tpi 和tcdB 核酸粪便直接检测阳性，粪便厌氧培养到了产毒的艰难梭菌
2.3 产毒艰难梭菌及其感染患者情况
2 份样本厌氧培养分离到的艰难梭菌，纯菌经 EIA 试剂盒检测 GDH 检测线和毒素检测线均阳性，显示均为产毒的艰难梭菌。PCR 扩增证实 B 毒素基因阳性，A 毒素基因完整无缺失，均无 CDT 基因，毒素类型为 A+B+。这 2 份样本来源于 2 个 IBD 合并 CDI 的患者，患者情况见表 1。其中患者 1 为反复 CDI 发作的患者，此次为第 3 次发作，曾使用利福昔明抗 CDI 感染治疗无效。
表1
IBD 合并 CDI 患者的临床情况
3 讨论
近年来，CDI 的发病率和疾病严重程度在全球范围内呈上升趋势，北美、澳大利亚及欧洲的医院均相继出现了高毒力菌株以及地区播散性医院内暴发流行[8]，已经对社会公共卫生安全构成了严重威胁。美国国家疾病控制中心发布的数据显示，CDI 每年导致超过 250 000 人住院，至少 14 000 人死亡，美国为此每年遭受 10 亿美元经济损失。因此在耐药细菌威胁等级中，艰难梭菌被列入最高的“紧急”级别[9]。美国的研究表明，CDI 在 IBD 患者中的发病率较普通人群高，发病率可增加至 6%[10]。其中，克隆恩病患者发生 CDI 的风险增加了 2 倍，溃疡性结肠炎患者发生 CDI 的风险增加了 3 倍[10]。欧洲的一项研究发现，IBD 患者即便处于缓解期，也大约有 8.2% 的人携带产毒的艰难梭菌[11]。因此，对 IBD 患者进行积极的艰难梭菌实验室检测十分必要。早期识别艰难梭菌携带者和患者能为后续 CDI 的治疗和医院感染防控提供帮助。
与欧美国家不同的是，既往研究显示我国目前尚不是艰难梭菌的高流行区，反复发生 CDI 的患者报道较少[12]，只是在一些重点病房或重点人群中 CDI 的发病率较高，如重症监护病房、神经内科[13-15]。本研究结果显示，有产毒 CDI 的患者在复发的 IBD 患者中占 4.2%，较国外的研究结果[10]略低。鉴于这个较低的发生率，在该类人群中无必要针对 CDI 使用预防性用药，也无必要扩大 CDI 临床诊断的可能性并盲目给予经验性治疗。在 IBD 患者中，仅凭临床表现来鉴别 CDI 和 IBD 复发非常困难，鉴于 CDI 造成的不良后果和其可治可控性，临床医生和临床实验室对这类患者入院时就进行主动筛查是非常有意义的。
可用于艰难梭菌检测的实验室方法较多，主要分为厌氧培养、核酸检测和 EIA 检测 3 种方式[4-5]。厌氧培养是传统的艰难梭菌检测方法，但其需要专门的厌氧培养设备、耗材和技术人员，检测报告周期长，耗时、耗力。培养分纯的过程有时还需要反复多次传代继而再耗费数日。此外，在培养分纯细菌后，还需要使用核酸检测法、EIA 检测法或者细胞毒实验才能进一步确定分离到的菌株是不是产毒的艰难梭菌。为了提高阳性率，通常需要增加接种平板数量以增加接种样本量，正如本研究所做的这样。因而临床实验室需要使用快速、方便、敏感性和特异性都较高的方法以实现快速准确的检测目标，但受资源的限制，目前开展此检测的医院较少，且各家医院的检验方法和检验流程并不完全一样。
核酸检测和 EIA 检测都可以直接应用于粪便，显著缩短了检测报告时间，是临床实验室用于替代培养方法的主要的 2 种选择。本研究结果显示在已经诊断 IBD 的患者中，核酸检测与厌氧培养和鉴定的一致性强，可以作为替代培养的临床检测方法。但核酸检测需要专门的设备和专门的技术人员，对于资源紧缺的基层医院或者艰难梭菌非流行区的医院来说略有不便。如若使用全自动 DNA 提取仪提取粪便 DNA 和使用 RT-PCR 方法进行核酸检测，检测速度更快，对资源的要求也更高。
本研究结果还显示，与厌氧培养和鉴定相比，EIA 检测在抗原检测方面显示出的一致性较好，虽然有仍有少量的假阳性，但是没有发现假阴性。因此我们认为在复发的 IBD 患者中，EIA 的抗原检测敏感性也很好，可以用于替代厌氧培养和鉴定的方法，尤其是识别有无 CDI 的患者。由于 EIA 检测时间短，可在 30 min 以内得到结果，不需要特殊的操作技能培训和专门的技术人员，因此特别适合资源不足的医院。本研究显示 EIA 检测在毒素检测方面与厌氧培养和鉴定的方法相比，结果不完全相符，显示出了假阴性。由于样本量小，这部分比较不宜进行统计学评价。我们知道，患者感染艰难梭菌后，毒素的排泌量和机体对病原菌的清除有关，症状的轻重也和机体对毒素的免疫反应相关，可能存在毒素量少而炎症反应重的情况[16]。同时，IBD 患者由于排便次数增加，其单次排便中的艰难梭菌毒素量可能会降低，也会造成 EIA 检测的假阴性。因此我们建议，在复发的 IBD 患者中，可以使用 EIA 粪便直接检测来替代厌氧培养进行快速检测，但是对于临床高度怀疑 CDI 而 EIA 抗原检测阳性但毒素检测阴性的样本，则应联合其他检测方式，以免漏诊。对于在专科病房如消化科设立的床旁 POC 检测点，也可以推荐使用 EIA 粪便直接检测。
本研究方法的不足之处在于样本量不够大，产毒艰难梭菌的检出由于发病率较低而较少，因此对结果的解释需要保持谨慎，并需进一步扩大样本量来验证该研究结果。
综上所述，我院入院的 IBD 复发患者中产毒 CDI 较低，为 4.2%，建议在无实验室结果支持下进行临床诊断需谨慎。除了厌氧培养和鉴定以外，核酸粪便直接检测和 EIA 粪便直接检测都可以用于 IBD 患者合并 CDI 的筛查，前者较后者略好。临床上高度怀疑 IBD 合并 CDI 的患者，若粪便的 EIA 抗原检测阳性但毒素检测阴性，建议加用核酸检测等其他方法进行确认。
艰难梭菌是革兰阳性（ G+） 厌氧芽孢杆菌，分为产毒的艰难梭菌和不产毒的艰难梭菌 2 种类型，能通过接触传播在人群中尤其是疾病宿主集中的医院内广泛播散。它几乎无侵袭性，但产毒株可分泌毒素 A、B 和二元毒素（binary toxin，CDT）致病。由于细菌毒株生物学特性和宿主的免疫状态不同，产毒的艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）对宿主造成的影响可以是无症状携带、轻度腹泻、致死性肠炎，后者会显著延长住院时间，增加医疗花费，甚至威胁患者生命[1]。
艰难梭菌的芽孢在医院环境中可存活 5 个月以上，不易被常用的物理和化学消毒法杀灭，故一旦感染暴发会造成持续感染。要做好艰难梭菌医院感染防控，早期识别和隔离感染者是关键。与其他人群相比，炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）患者中 CDI 的发病率较高，复发率可以高达 1/3[2-3]。因此，美国胃肠病协会《CDI 的诊治与预防指南》强烈建议对复发的 IBD 患者进行艰难梭菌的检测[4]。
目前用于艰难梭菌实验室检测的方法较多，主要分为厌氧培养、核酸检测和酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）检测 3 种方式[4-5]。由于厌氧培养耗时耗力，对临床实验室的人力资源和设备物资要求较高，核酸检测和 EIA 检测的应用越来越受到重视。本研究探索了核酸粪便直接检测和 EIA 粪便直接检测在识别复发的 IBD 患者合并 CDI 中的临床应用，旨在帮助早期识别和隔离 CDI 患者，为医院感染防控提供更好的技术支持。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
本研究标本来源为四川大学华西医院 2014 年 11 月—2015 年 4 月入院复发的 IBD 患者。以 2010 年英国胃肠病学会《成人 IBD 诊治指南》为参照，纳入标准：① 年龄>16 岁；② 既往消化专科医生诊断为 IBD；③ 影像学资料、消化内镜及组织学检查结果符合 IBD 诊断；④ 此次入院有腹痛、腹泻、血便等 IBD 复发的症状，消化专科医生认为符合 IBD 疾病的临床表现。排除标准：① 上消化道疾病；② 合并其他已知病原体感染的疾病（如细菌性痢疾、结核病、真菌性肠炎等）；③ 此次入院为症状首次发作。收集患者入院 48 h 内自然解出的 1 份大便，在 30 min 内送到实验室进行下列艰难梭菌检测。
1.2 研究方法
1.2.1 粪便厌氧培养和鉴定 所有粪便样本经过乙醇处理后均接种至少 3 个含 10% 的羊血艰难梭菌 CCFA 培养平板（英国 Oxoid 公司），37℃ 厌氧培养 72 h。对所有生长出的菌落进行革兰染色，挑取显微镜下菌落形态符合艰难梭菌的菌落在脑心浸出液肉汤中增菌。使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒（美国 Omega 公司）提取细菌DNA，参照既往发表的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物和反应条件，扩增艰难梭菌的看家基因tpi、A 毒素基因tcdA 和 B 毒素基因tcdB[6]。看家基因tpi 阳性的菌株，使用艰难梭菌快速检测试剂盒（美国 Alere TECHLAB 公司，型号 C.DIFF QUIK CHEK COMPLETE）进行 EIA 检测的毒素确认。其中，tpi 和tcdB 均扩增阳性，且 EIA 毒素检测阳性的细菌认定为产毒的艰难梭菌；仅tpi 扩增阳性，且 EIA 毒素检测阴性的细菌认定为非产毒的艰难梭菌。tcdA 和tcdB 均阳性的菌株，参照既往发表的 PCR 引物和反应条件，扩增 CDT 基因cdtA 和cdtB[7]。
1.2.2 核酸粪便直接检测 所有粪便样本均使用粪便 DNA 提取试剂盒（美国 Omega 公司）提取 DNA 供直接检测。参照既往发表的 PCR 引物和反应条件，扩增艰难梭菌的看家基因tpi、A 毒素基因tcdA 和 B 毒素基因tcdB[6]。其中，tpi 和tcdB 均扩增阳性的粪便样本认定为含产毒艰难梭菌的样本；仅tpi 扩增阳性的粪便样本认定为含非产毒艰难梭菌的样本。
1.2.3 EIA 粪便直接检测 所有粪便样本均使用艰难梭菌快速检测试剂盒（美国 Alere TECHLAB 公司，型号 C.DIFF QUIK CHEK COMPLETE）进行 EIA 直接检测。该试剂能检测的谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）抗原下限为 0.80 ng/mL，A 毒素下限为 0.63 ng/mL，B 毒素下限为 0.16 ng/mL。根据产品说明书操作，在测试管中依次加入稀释剂、结合剂，待其充分混匀后加入检测板的样品窗，室温下静置 15 min。在反应窗中加入缓冲液，待其完全吸收后加入底物，室温等待 10 min 后判读结果。根据反应窗显色带判读结果为下列 3 种类型：GDH 抗原阳性且毒素阳性的含产毒艰难梭菌的样本、仅 GDH 抗原阳性的含非产毒艰难梭菌的样本、GDH 抗原和毒素均阴性的不含艰难梭菌的样本。
1.2.4 PCR 扩增产物纯化、测序和比对 PCR 产物送华大基因用 ABI 3730xl DNA Analyzer（美国应用生物系统公司）双向测序。测序结果经 BLAST（）比对分析。PCR 测序引物即扩增引物。
1.3 统计学方法
使用 Stata 12.0 软件进行数据分析。以粪便厌氧培养和鉴定为参照，对 EIA 粪便直接检测和核酸粪便直接检测这 2 种检测方式，通过 Κappa 一致性检验进行比较。Κappa=1，表示 2 种方法完全一致；0.81<Κappa<1.00，表示 2 种方法非常一致；0.61<Κappa<0.80，表示两种方法基本一致；Κappa<0.60，表示 2 种方法一致性差。同时检验 Κappa 系数，P<0.05 表明结论可靠。
2 结果
2.1 样本基本资料
剔除重复送检的样本，本项目共纳入 48 份复发的 IBD 患者的非重复大便样本。其中男 32 份，女 16 份；年龄 14～68 岁，平均（40.46±17.85）岁。
2.2 方法比较
以粪便厌氧培养和鉴定的方法为基础，核酸粪便直接检测的结果与其完全一致（Κappa=1.00，P<0.05)。共检出了 11 份有艰难梭菌的样本，其中有 2 份样本检出了产毒的艰难梭菌。另外 37 份粪便未检出艰难梭菌。产毒艰难梭菌的样本占全体样本的 4.2%。与粪便培养和鉴定的方法相比，EIA 粪便直接检测的结果在抗原检测方面相似，在毒素检测方面有差异。EIA 粪便直接检测共检出了 13 份有艰难梭菌的样本，其中有 2 份样本是另外两种方法未检测出的，考虑为假阳性。在未检出艰难梭菌的样本和检出艰难梭菌的样本中，EIA 粪便直接检测结果与粪便厌氧培养和鉴定结果的一致性很高（Κappa=0.89，P<0.05)。在抗原检测方面，EIA 粪便直接检测和粪便厌氧培养和鉴定结果相似。EIA 粪便直接检测未检出毒素阳性的样本，即是未含产毒艰难梭菌的样本。但有 2 份样本，EIA 粪便直接检测的结果显示抗原检测阳性，毒素检测阴性；而核酸检测和厌氧培养鉴定这两种方法检测出的结果都是阳性。因此这 2 份样本的毒素检测结果考虑为假阴性。由于样本量小，在产毒艰难梭菌样本的检测及毒素检测方面，未做统计学分析。见图 1。
图1
粪便样本艰难梭菌检测结果比较 * Κappa 检验显示与厌氧培养和鉴定法相比，检验结果一致。未检出艰难梭菌样本组：该粪便样本 EIA 粪便直接检测 GDH 抗原和毒素检测均阴性，tpi 核酸粪便直接检测阴性，粪便厌氧培养未培养到艰难梭菌；检出艰难梭菌样本组：该粪便样本 EIA 粪便直接检测抗原检测阳性，tpi 核酸粪便直接检测阳性，粪便厌氧培养到了包括产毒株和非产毒株在内的艰难梭菌；检出产毒的艰难梭菌样本组：该粪便样本 EIA 粪便直接检测毒素检测阳性，tpi 和tcdB 核酸粪便直接检测阳性，粪便厌氧培养到了产毒的艰难梭菌
2.3 产毒艰难梭菌及其感染患者情况
2 份样本厌氧培养分离到的艰难梭菌，纯菌经 EIA 试剂盒检测 GDH 检测线和毒素检测线均阳性，显示均为产毒的艰难梭菌。PCR 扩增证实 B 毒素基因阳性，A 毒素基因完整无缺失，均无 CDT 基因，毒素类型为 A+B+。这 2 份样本来源于 2 个 IBD 合并 CDI 的患者，患者情况见表 1。其中患者 1 为反复 CDI 发作的患者，此次为第 3 次发作，曾使用利福昔明抗 CDI 感染治疗无效。
表1
IBD 合并 CDI 患者的临床情况
3 讨论
近年来，CDI 的发病率和疾病严重程度在全球范围内呈上升趋势，北美、澳大利亚及欧洲的医院均相继出现了高毒力菌株以及地区播散性医院内暴发流行[8]，已经对社会公共卫生安全构成了严重威胁。美国国家疾病控制中心发布的数据显示，CDI 每年导致超过 250 000 人住院，至少 14 000 人死亡，美国为此每年遭受 10 亿美元经济损失。因此在耐药细菌威胁等级中，艰难梭菌被列入最高的“紧急”级别[9]。美国的研究表明，CDI 在 IBD 患者中的发病率较普通人群高，发病率可增加至 6%[10]。其中，克隆恩病患者发生 CDI 的风险增加了 2 倍，溃疡性结肠炎患者发生 CDI 的风险增加了 3 倍[10]。欧洲的一项研究发现，IBD 患者即便处于缓解期，也大约有 8.2% 的人携带产毒的艰难梭菌[11]。因此，对 IBD 患者进行积极的艰难梭菌实验室检测十分必要。早期识别艰难梭菌携带者和患者能为后续 CDI 的治疗和医院感染防控提供帮助。
与欧美国家不同的是，既往研究显示我国目前尚不是艰难梭菌的高流行区，反复发生 CDI 的患者报道较少[12]，只是在一些重点病房或重点人群中 CDI 的发病率较高，如重症监护病房、神经内科[13-15]。本研究结果显示，有产毒 CDI 的患者在复发的 IBD 患者中占 4.2%，较国外的研究结果[10]略低。鉴于这个较低的发生率，在该类人群中无必要针对 CDI 使用预防性用药，也无必要扩大 CDI 临床诊断的可能性并盲目给予经验性治疗。在 IBD 患者中，仅凭临床表现来鉴别 CDI 和 IBD 复发非常困难，鉴于 CDI 造成的不良后果和其可治可控性，临床医生和临床实验室对这类患者入院时就进行主动筛查是非常有意义的。
可用于艰难梭菌检测的实验室方法较多，主要分为厌氧培养、核酸检测和 EIA 检测 3 种方式[4-5]。厌氧培养是传统的艰难梭菌检测方法，但其需要专门的厌氧培养设备、耗材和技术人员，检测报告周期长，耗时、耗力。培养分纯的过程有时还需要反复多次传代继而再耗费数日。此外，在培养分纯细菌后，还需要使用核酸检测法、EIA 检测法或者细胞毒实验才能进一步确定分离到的菌株是不是产毒的艰难梭菌。为了提高阳性率，通常需要增加接种平板数量以增加接种样本量，正如本研究所做的这样。因而临床实验室需要使用快速、方便、敏感性和特异性都较高的方法以实现快速准确的检测目标，但受资源的限制，目前开展此检测的医院较少，且各家医院的检验方法和检验流程并不完全一样。
核酸检测和 EIA 检测都可以直接应用于粪便，显著缩短了检测报告时间，是临床实验室用于替代培养方法的主要的 2 种选择。本研究结果显示在已经诊断 IBD 的患者中，核酸检测与厌氧培养和鉴定的一致性强，可以作为替代培养的临床检测方法。但核酸检测需要专门的设备和专门的技术人员，对于资源紧缺的基层医院或者艰难梭菌非流行区的医院来说略有不便。如若使用全自动 DNA 提取仪提取粪便 DNA 和使用 RT-PCR 方法进行核酸检测，检测速度更快，对资源的要求也更高。
本研究结果还显示，与厌氧培养和鉴定相比，EIA 检测在抗原检测方面显示出的一致性较好，虽然有仍有少量的假阳性，但是没有发现假阴性。因此我们认为在复发的 IBD 患者中，EIA 的抗原检测敏感性也很好，可以用于替代厌氧培养和鉴定的方法，尤其是识别有无 CDI 的患者。由于 EIA 检测时间短，可在 30 min 以内得到结果，不需要特殊的操作技能培训和专门的技术人员，因此特别适合资源不足的医院。本研究显示 EIA 检测在毒素检测方面与厌氧培养和鉴定的方法相比，结果不完全相符，显示出了假阴性。由于样本量小，这部分比较不宜进行统计学评价。我们知道，患者感染艰难梭菌后，毒素的排泌量和机体对病原菌的清除有关，症状的轻重也和机体对毒素的免疫反应相关，可能存在毒素量少而炎症反应重的情况[16]。同时，IBD 患者由于排便次数增加，其单次排便中的艰难梭菌毒素量可能会降低，也会造成 EIA 检测的假阴性。因此我们建议，在复发的 IBD 患者中，可以使用 EIA 粪便直接检测来替代厌氧培养进行快速检测，但是对于临床高度怀疑 CDI 而 EIA 抗原检测阳性但毒素检测阴性的样本，则应联合其他检测方式，以免漏诊。对于在专科病房如消化科设立的床旁 POC 检测点，也可以推荐使用 EIA 粪便直接检测。
本研究方法的不足之处在于样本量不够大，产毒艰难梭菌的检出由于发病率较低而较少，因此对结果的解释需要保持谨慎，并需进一步扩大样本量来验证该研究结果。
综上所述，我院入院的 IBD 复发患者中产毒 CDI 较低，为 4.2%，建议在无实验室结果支持下进行临床诊断需谨慎。除了厌氧培养和鉴定以外，核酸粪便直接检测和 EIA 粪便直接检测都可以用于 IBD 患者合并 CDI 的筛查，前者较后者略好。临床上高度怀疑 IBD 合并 CDI 的患者，若粪便的 EIA 抗原检测阳性但毒素检测阴性，建议加用核酸检测等其他方法进行确认。
