引用本文： 李伟, 王红莉, 李虹, 陈甦, 余美英, 周秋媛, 徐艳华, 曲延刚. 甲胎蛋白阴性与阳性穿刺活检人肝细胞癌中 CD34 及多克隆癌胚抗原的表达及其病理诊断意义. 华西医学, 2017, 32(8): 1195-1198. doi: 10.7507/1002-0179.201606041 复制
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前恶性肿瘤中比较常见的一种疾病[1]，其病程进展迅速，往往发现时已到了中晚期，失去了最佳治疗时机，且手术切除率低，其恶性程度、治疗效果及预后都比较差。近年来，超声引导下肝脏穿刺活检已成为肝脏疾病诊断的重要辅助手段[2-3]，且是安全简单的方法[4]，尤其是对于肝癌的诊断，但同时由于穿刺活检所取得组织块小，比较局限，增加了病理诊断的难度和风险。鉴于此，本研究旨在通过免疫组织化学（免疫组化）检测甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、多克隆癌胚抗原（polyclone carcinoembryonic antigen，pCEA）和 CD34 在HCC中的表达情况，探讨其在肝穿刺活检标本中辅助诊断 HCC 的病理诊断价值。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
共收集 2013 年—2015 年恩施土家族苗族自治州中心医院穿刺活检的 HCC 标本 54 例，所有病例均经过病理诊断证实，且为真实反映肿瘤细胞蛋白的表达水平，患者穿刺前未经任何针对肿瘤的化学治疗及放射治疗。其中男 43 例，女 11 例；年龄 27～70 岁，中位年龄 53 岁。依据血清学及免疫组化法检查 AFP 结果，血清 AFP≥400 ng/mL 及 AFP 免疫组化染色示HCC组织中癌细胞细胞质中见棕黄色着色视为阳性，将患者按其分为 2 组，AFP 阳性组 33 例，AFP 阴性组 21 例。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 鼠抗人癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）多克隆抗体、鼠抗人 CD34 单克隆抗体、兔抗人 AFP 多克隆抗体及即用型链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（streptavidin-perosidase，SP）试剂盒及二氨基联苯胺（diaminobenzine，DAB）显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2.2 免疫组化染色 所有标本均经过 4% 中性甲醛固定，常规石蜡包埋，制成 4 μm 厚连续切片。免疫组化染色采用 SP 法，鼠抗人 CEA 多克隆抗体标记 CEA 蛋白，鼠抗人 CD34 单克隆抗体标记血管内皮细胞，兔抗人 AFP 多克隆抗体标记 AFP 蛋白，CEA、 CD34 和 AFP共同进行高压锅热修复（120℃，3 min 30 s）及 DAB 显色、苏木素复染、中性树胶封片。实验步骤按试剂盒说明书进行，严格控制实验条件，每组实验均设阳性对照和用磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照，每组均作常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。
1.2.3 结果判断 pCEA 阳性者免疫组化染色示毛细胆管内可见棕黄色颗粒，CD34 阳性者对 HCC 组织染色以呈现弥漫和均匀分布的新生微血管内皮细胞质或细胞膜着色为特征[5]，每张切片随机计数 10 个视野（×200），每个视野计数 100 个肿瘤细胞或非肿瘤肝细胞内免疫染色阳性细胞数，计算出每张切片的阳性细胞百分数，以阳性细胞百分数高于 5% 以上为阳性表达。由 2 名病理医生采用双盲法独立检测[6]。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 16. 0 软件对研究数据进行统计学分析。计数资料用例数和百分比表示，率的比较采用 χ2 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 HCC 中 pCEA 的表达情况
AFP 阳性组及 AFP 阴性组中 pCEA 表达阳性率分别为 69.7%（23/33）、38.1%（8/21）。阳性表达染色呈淡黄色或棕黄色，定位于毛细胆管上（图 1）；AFP 阳性组的阳性表达率显著高于 AFP 阴性组，差异有统计学意义（P<0.05），见表 1。
表1
pCEA 在 HCC 组织中的表达情况[例（%）]
图1
pCEA 在 HCC 中的表达（SP ×200）
阳性染色表达定位在毛细胆管上，呈棕黄色或淡黄色
2.2 CD34 在 HCC 中的表达情况
AFP 阳性组及 AFP 阴性组中 CD34 表达阳性率分别为 90.91%（30/33）、85.71%（18/21），阳性表达染色为淡黄色或棕黄色的单个或成簇血管内皮细胞，定位于微血管内皮细胞细胞膜和细胞质中，呈现出线状型、环状型等形态（图 2）；AFP 阳性组的 CD34 阳性表达率与 AFP 阴性组的阳性表达率相比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表 2。
表2
HCC 组织中 CD34 的表达情况[例（%）]
图2
CD34 在 HCC 中的表达（SP ×200）
a. 阳性染色表达定位在单个或者成簇的血管内皮细胞，呈棕黄色的环状型；b. 阳性染色表达定位在单个或者成簇的血管内皮细胞，呈棕黄色的线状型
3 讨论
原发性肝癌是一种常见且严重危害人类生命健康的恶性肿瘤，近年在我国发病率呈上升趋势[7]，其特点主要是发病隐匿，早期缺乏典型症状，恶性程度高，危害大，大多数患者就诊时已经属于中晚期，很多患者也因此失去手术根治机会，导致其病死率很高，在世界范围内已逐年升高位居第 2 位[8]。因此对原发性肝癌的早期诊断显得尤为重要。其病因和发病机制尚不十分明了，目前认为与病毒性肝炎、肝硬化、黄曲霉菌等致癌物质和环境因素有关[9-10]。而原发性肝癌在病理组织学上分为 HCC、胆管细胞癌和混合细胞型肝癌 3 型，其中 HCC 是最多见的组织学类型，我国 90% 以上病例属原发性 HCC。因肝癌症状不典型，早期诊断有一定困难。而随着现代科技的发展进步，微创穿刺术的应用，使原发性肝癌的诊断水平较以前有所提高，然而在肝脏穿刺活检标本中，由于取材的局限性，对 HCC 的病理诊断，增加了病理工作者的诊断难度。
AFP 是一种由胚胎卵黄囊细胞、胚胎肝细胞和胎儿肠道细胞合成的一种糖蛋白，随着胎儿生长发育，AFP 浓度逐渐降低，至出生 2 年后可降至正常成人水平（<0.02 mg/L）；AFP 作为原发性肝癌较为特异的生化指标[11]，被公认为目前临床上 HCC 患者血清学诊断的“金标准”，对肝癌有相对的专一性，但至目前为止，在临床的原发性肝癌患者中，约 60%～85% 的患者其 AFP 阳性，约 30% 的肝癌患者 AFP 为阴性[12]，表明其为一种特异性强，但敏感性较低的肿瘤标志物，故 AFP 阴性绝不能排除肝癌的诊断，否则容易造成漏诊或误诊；在我们的研究中也证实了这一点，并不是所有的 HCC 都表达 AFP。
CEA 为癌胚抗原，是血清中的一种糖蛋白，主要产生于消化道及胰腺等器官，在内胚叶消化系统恶性肿瘤中存在广泛，是一种广谱的肿瘤标志物，虽然不能作为诊断某种恶性肿瘤的特异性指标，但在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、病情进展、疗效评价等方面仍有重要作用，除了在 HCC 中表达，还可在转移性肝癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等有不同程度的阳性率。作为 HCC 的一种免疫组化标志物，有单克隆与多克隆之分，可以识别不同的抗原决定簇。单克隆 CEA（mCEA）呈胞浆型染色，在胆管细胞癌或转移性腺癌的阳性表达率分别为 60%～75%，而在 HCC 中的阳性表达率为 0%～11%，且不显示毛细胆管[13]。pCEA 对于 HCC 是以特异性的小管染色模式，而在转移性腺癌或胆管细胞癌中一般不染色或者仅是细胞质染色，但其在腺样肝癌中一般染色于腺的腔侧缘，pCEA 在转移性腺癌或胆管细胞癌中有时可见弱或管腔染色，所以有时其染色模式很难识别，特别是在分化差的 HCC 中，因此 pCEA 的使用价值受到了一定的限制。本研究发现，在 HCC 患者中，AFP 阳性患者的 pCEA 的阳性表达率明显高于 AFP 阴性患者，两者具有一定的相关性，在平时工作中对 HCC 的病理诊断中可以联合检测 AFP 和 pCEA，提高对 HCC 的诊断及其鉴别诊断。
CD34 是一种高度甲基化的 Ⅰ 型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白，其相对分子质量为 11.5×104，最早发现于骨髓淋巴及粒系早期细胞膜上，参与造血干/祖细胞的黏附、分化等过程，但很快人们就发现小血管内皮细胞及部分原始的间质细胞上也存在 CD34 抗原，目前被认为是血管源性肿瘤的特异性标志物之一，HCC 是一种富含血管的实质性肿瘤，HCC 中的 CD34 阳性表达的微血管呈长条状或分枝状，管壁纤细，管腔狭窄，分布均匀弥漫；而胆管细胞癌和转移性腺癌组织中微血管呈干枝状，稀疏杂乱[14]。尽管 CD34 本身不直接显示 HCC 的癌细胞，但 HCC 组织中 CD34 阳性表达的微血管分布形式比较特异，可将其分为点状型、线状型、环状型、条索型，将其特称为“HCC 型染色”[5, 13, 15-17]，故 CD34 可被视为有用的 HCC 诊断标志物[5]。在本次检测中发现 CD34 的阳性表达与 AFP 并无相关性，但其在 HCC 中阳性表达率达到了 90.90% 和 85.71%，再一次证实了 CD34 特征性的微血管表达特点同 HCC 的相关性，故在 HCC 的病理诊断工作中，可将 AFP、CD34 与 pCEA 联合应用，可提高穿刺活检中 HCC 的诊断率，降低误诊率。
本次研究旨在通过免疫组化检测 CD34 和 pCEA 在穿刺活检人 HCC 中的表达情况以及二者与 AFP 的相关性进行研究，结果显示在 HCC 患者中，AFP 阳性患者的 pCEA 的阳性表达率明显高于 AFP 阴性患者，两者具有一定的相关性。然而 CD34 的阳性表达与 AFP 并无明显相关性，但其在 HCC 中特征性的微血管着色方式对于 HCC 的病理诊断具有较大的指导意义。鉴于此，在实际工作中，可将 AFP、CD34 与 pCEA 合并运用于 HCC 的病理诊断中。
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前恶性肿瘤中比较常见的一种疾病[1]，其病程进展迅速，往往发现时已到了中晚期，失去了最佳治疗时机，且手术切除率低，其恶性程度、治疗效果及预后都比较差。近年来，超声引导下肝脏穿刺活检已成为肝脏疾病诊断的重要辅助手段[2-3]，且是安全简单的方法[4]，尤其是对于肝癌的诊断，但同时由于穿刺活检所取得组织块小，比较局限，增加了病理诊断的难度和风险。鉴于此，本研究旨在通过免疫组织化学（免疫组化）检测甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、多克隆癌胚抗原（polyclone carcinoembryonic antigen，pCEA）和 CD34 在HCC中的表达情况，探讨其在肝穿刺活检标本中辅助诊断 HCC 的病理诊断价值。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
共收集 2013 年—2015 年恩施土家族苗族自治州中心医院穿刺活检的 HCC 标本 54 例，所有病例均经过病理诊断证实，且为真实反映肿瘤细胞蛋白的表达水平，患者穿刺前未经任何针对肿瘤的化学治疗及放射治疗。其中男 43 例，女 11 例；年龄 27～70 岁，中位年龄 53 岁。依据血清学及免疫组化法检查 AFP 结果，血清 AFP≥400 ng/mL 及 AFP 免疫组化染色示HCC组织中癌细胞细胞质中见棕黄色着色视为阳性，将患者按其分为 2 组，AFP 阳性组 33 例，AFP 阴性组 21 例。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 鼠抗人癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）多克隆抗体、鼠抗人 CD34 单克隆抗体、兔抗人 AFP 多克隆抗体及即用型链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（streptavidin-perosidase，SP）试剂盒及二氨基联苯胺（diaminobenzine，DAB）显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2.2 免疫组化染色 所有标本均经过 4% 中性甲醛固定，常规石蜡包埋，制成 4 μm 厚连续切片。免疫组化染色采用 SP 法，鼠抗人 CEA 多克隆抗体标记 CEA 蛋白，鼠抗人 CD34 单克隆抗体标记血管内皮细胞，兔抗人 AFP 多克隆抗体标记 AFP 蛋白，CEA、 CD34 和 AFP共同进行高压锅热修复（120℃，3 min 30 s）及 DAB 显色、苏木素复染、中性树胶封片。实验步骤按试剂盒说明书进行，严格控制实验条件，每组实验均设阳性对照和用磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照，每组均作常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。
1.2.3 结果判断 pCEA 阳性者免疫组化染色示毛细胆管内可见棕黄色颗粒，CD34 阳性者对 HCC 组织染色以呈现弥漫和均匀分布的新生微血管内皮细胞质或细胞膜着色为特征[5]，每张切片随机计数 10 个视野（×200），每个视野计数 100 个肿瘤细胞或非肿瘤肝细胞内免疫染色阳性细胞数，计算出每张切片的阳性细胞百分数，以阳性细胞百分数高于 5% 以上为阳性表达。由 2 名病理医生采用双盲法独立检测[6]。
1.3 统计学方法
采用 SPSS 16. 0 软件对研究数据进行统计学分析。计数资料用例数和百分比表示，率的比较采用 χ2 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 HCC 中 pCEA 的表达情况
AFP 阳性组及 AFP 阴性组中 pCEA 表达阳性率分别为 69.7%（23/33）、38.1%（8/21）。阳性表达染色呈淡黄色或棕黄色，定位于毛细胆管上（图 1）；AFP 阳性组的阳性表达率显著高于 AFP 阴性组，差异有统计学意义（P<0.05），见表 1。
表1
pCEA 在 HCC 组织中的表达情况[例（%）]
图1
pCEA 在 HCC 中的表达（SP ×200）
阳性染色表达定位在毛细胆管上，呈棕黄色或淡黄色
2.2 CD34 在 HCC 中的表达情况
AFP 阳性组及 AFP 阴性组中 CD34 表达阳性率分别为 90.91%（30/33）、85.71%（18/21），阳性表达染色为淡黄色或棕黄色的单个或成簇血管内皮细胞，定位于微血管内皮细胞细胞膜和细胞质中，呈现出线状型、环状型等形态（图 2）；AFP 阳性组的 CD34 阳性表达率与 AFP 阴性组的阳性表达率相比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表 2。
表2
HCC 组织中 CD34 的表达情况[例（%）]
图2
CD34 在 HCC 中的表达（SP ×200）
a. 阳性染色表达定位在单个或者成簇的血管内皮细胞，呈棕黄色的环状型；b. 阳性染色表达定位在单个或者成簇的血管内皮细胞，呈棕黄色的线状型
3 讨论
原发性肝癌是一种常见且严重危害人类生命健康的恶性肿瘤，近年在我国发病率呈上升趋势[7]，其特点主要是发病隐匿，早期缺乏典型症状，恶性程度高，危害大，大多数患者就诊时已经属于中晚期，很多患者也因此失去手术根治机会，导致其病死率很高，在世界范围内已逐年升高位居第 2 位[8]。因此对原发性肝癌的早期诊断显得尤为重要。其病因和发病机制尚不十分明了，目前认为与病毒性肝炎、肝硬化、黄曲霉菌等致癌物质和环境因素有关[9-10]。而原发性肝癌在病理组织学上分为 HCC、胆管细胞癌和混合细胞型肝癌 3 型，其中 HCC 是最多见的组织学类型，我国 90% 以上病例属原发性 HCC。因肝癌症状不典型，早期诊断有一定困难。而随着现代科技的发展进步，微创穿刺术的应用，使原发性肝癌的诊断水平较以前有所提高，然而在肝脏穿刺活检标本中，由于取材的局限性，对 HCC 的病理诊断，增加了病理工作者的诊断难度。
AFP 是一种由胚胎卵黄囊细胞、胚胎肝细胞和胎儿肠道细胞合成的一种糖蛋白，随着胎儿生长发育，AFP 浓度逐渐降低，至出生 2 年后可降至正常成人水平（<0.02 mg/L）；AFP 作为原发性肝癌较为特异的生化指标[11]，被公认为目前临床上 HCC 患者血清学诊断的“金标准”，对肝癌有相对的专一性，但至目前为止，在临床的原发性肝癌患者中，约 60%～85% 的患者其 AFP 阳性，约 30% 的肝癌患者 AFP 为阴性[12]，表明其为一种特异性强，但敏感性较低的肿瘤标志物，故 AFP 阴性绝不能排除肝癌的诊断，否则容易造成漏诊或误诊；在我们的研究中也证实了这一点，并不是所有的 HCC 都表达 AFP。
CEA 为癌胚抗原，是血清中的一种糖蛋白，主要产生于消化道及胰腺等器官，在内胚叶消化系统恶性肿瘤中存在广泛，是一种广谱的肿瘤标志物，虽然不能作为诊断某种恶性肿瘤的特异性指标，但在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、病情进展、疗效评价等方面仍有重要作用，除了在 HCC 中表达，还可在转移性肝癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等有不同程度的阳性率。作为 HCC 的一种免疫组化标志物，有单克隆与多克隆之分，可以识别不同的抗原决定簇。单克隆 CEA（mCEA）呈胞浆型染色，在胆管细胞癌或转移性腺癌的阳性表达率分别为 60%～75%，而在 HCC 中的阳性表达率为 0%～11%，且不显示毛细胆管[13]。pCEA 对于 HCC 是以特异性的小管染色模式，而在转移性腺癌或胆管细胞癌中一般不染色或者仅是细胞质染色，但其在腺样肝癌中一般染色于腺的腔侧缘，pCEA 在转移性腺癌或胆管细胞癌中有时可见弱或管腔染色，所以有时其染色模式很难识别，特别是在分化差的 HCC 中，因此 pCEA 的使用价值受到了一定的限制。本研究发现，在 HCC 患者中，AFP 阳性患者的 pCEA 的阳性表达率明显高于 AFP 阴性患者，两者具有一定的相关性，在平时工作中对 HCC 的病理诊断中可以联合检测 AFP 和 pCEA，提高对 HCC 的诊断及其鉴别诊断。
CD34 是一种高度甲基化的 Ⅰ 型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白，其相对分子质量为 11.5×104，最早发现于骨髓淋巴及粒系早期细胞膜上，参与造血干/祖细胞的黏附、分化等过程，但很快人们就发现小血管内皮细胞及部分原始的间质细胞上也存在 CD34 抗原，目前被认为是血管源性肿瘤的特异性标志物之一，HCC 是一种富含血管的实质性肿瘤，HCC 中的 CD34 阳性表达的微血管呈长条状或分枝状，管壁纤细，管腔狭窄，分布均匀弥漫；而胆管细胞癌和转移性腺癌组织中微血管呈干枝状，稀疏杂乱[14]。尽管 CD34 本身不直接显示 HCC 的癌细胞，但 HCC 组织中 CD34 阳性表达的微血管分布形式比较特异，可将其分为点状型、线状型、环状型、条索型，将其特称为“HCC 型染色”[5, 13, 15-17]，故 CD34 可被视为有用的 HCC 诊断标志物[5]。在本次检测中发现 CD34 的阳性表达与 AFP 并无相关性，但其在 HCC 中阳性表达率达到了 90.90% 和 85.71%，再一次证实了 CD34 特征性的微血管表达特点同 HCC 的相关性，故在 HCC 的病理诊断工作中，可将 AFP、CD34 与 pCEA 联合应用，可提高穿刺活检中 HCC 的诊断率，降低误诊率。
本次研究旨在通过免疫组化检测 CD34 和 pCEA 在穿刺活检人 HCC 中的表达情况以及二者与 AFP 的相关性进行研究，结果显示在 HCC 患者中，AFP 阳性患者的 pCEA 的阳性表达率明显高于 AFP 阴性患者，两者具有一定的相关性。然而 CD34 的阳性表达与 AFP 并无明显相关性，但其在 HCC 中特征性的微血管着色方式对于 HCC 的病理诊断具有较大的指导意义。鉴于此，在实际工作中，可将 AFP、CD34 与 pCEA 合并运用于 HCC 的病理诊断中。
