不孕不育发病率在世界范围内逐年增加，其中女性不孕患者50%～60%，其可能与生活环境及生活方式的改变有关。由于妇科恶性肿瘤发生率有逐年增加及年轻化趋势，卵巢功能缺陷或卵巢结构缺如导致生殖细胞缺陷的患者可能终身不孕，但干细胞移植治疗为这类患者带来了新的希望。干细胞是具有自我更新及多向分化潜能的未分化细胞，存在于胚胎、胎儿或成年各阶段，这些特点使其成为细胞治疗及再生医学领域的研究热点。理论上，在适宜条件下，干细胞能分化为包括雌性生殖细胞在内的三胚层不同类型细胞，进而形成机体不同组织及器官。现今，多能干细胞诱导分化为雌性生殖细胞的实验研究取得了一定的成果，因此，干细胞转分化为雌性生殖细胞从而进行细胞移植治疗及卵巢组织再生可能作为未来治疗不孕不育的新方法。此综述旨在总结干细胞向雌性生殖细胞转分化的研究进展及其应用于生殖医学所面临的挑战。
引用本文： 郭清民, 王慧, 郑艾. 干细胞治疗卵巢功能低下性不孕的研究进展和挑战. 华西医学, 2016, 31(11): 1949-1952. doi: 10.7507/1002-0179.201600535 复制
据统计，全球近72 400 000人或15%夫妻遭受不孕不育的困扰，其中女性不孕因素占50% ～ 60%[1]。虽然辅助生殖技术能够使80%以上的不孕不育夫妇怀孕，但无法从根本上解决卵巢功能衰竭或卵巢结构缺如所致的不孕[2]。2003年Hübner等[3]在体外首次成功将胚胎干细胞（ESC）诱导分化为卵母细胞样细胞（OLC），为卵巢功能低下或结构缺如致不孕患者带来希望。现细胞治疗已逐渐成为治疗退行性疾病的一种新兴方法。
1 干细胞：细胞治疗的新希望
干细胞的特性：① 自我更新能力；② 克隆性，即子细胞来源于同一个干细胞；③ 分化性，干细胞能分化为机体的不同类型细胞，所以又称“万能细胞”[4]。
干细胞分为ESC、成体干细胞、胚外组织干细胞和诱导多能干细胞（iPSC）与核转移胚胎干细胞（NT-ESC）。其中，ESC在多能阶段时期具有无限增殖能力，能稳定地分化为三胚层衍生细胞、组织及器官。成体干细胞有助于器官损伤后的修复[5]。胚外组织干细胞最大的优点在于其取材方便、资源充足、无伦理学争议、无致瘤风险及无免疫原性等。
Takahashi等[6]获得iPSC，并检出其表达ESC标志物和具有端粒酶活性，具有分化为三胚层能力。Deuse等[7]发现卵细胞过早退出减数分裂过程以及不适宜的生长环境为NT-ESC胚胎发育停止的关键因素。
可见，干细胞在体外能分化为雌性生殖细胞以及卵细胞。干细胞的分化潜能使其在生殖医学领域具有广阔的应用前景，为卵巢功能衰竭或卵巢结构缺失致生殖细胞缺如不孕患者带来希望。
2 雌性生殖细胞的体内发育及体外研究
原始生殖细胞（PGC）源于胚胎第4周卵黄囊顶近尿囊处的内胚层。PGC历经临近卵黄囊的胚外区域及内胚层的后肠，称为迁移后PGC[8]。胚胎第6周时，PGC迁入生殖腺内的初级性索，进行有丝分裂产生卵原细胞。若核型为46.XX，胚胎第10周时初级性索退化，未分化性腺的表面上皮增生再次向间充质伸入次级性索形成即皮质索，次级性索与上皮细胞分离后发育为卵巢皮质，未分化性腺的表面上皮下的间充质分化为白膜。胚胎第4个月时，皮质索断裂形成多个细胞团，其中央的卵原细胞继续增殖达高峰，约600万 ～ 700万个称为始基卵泡。妊娠中后期卵泡不断闭锁，至胎儿出生时卵巢中有100万～ 200万原始卵泡。经过儿童期至青春期，只剩下约30万个。经过原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡4个阶段卵泡成熟并排卵，至排卵前完成，形成次级卵母细胞，其迅速进入第2次减数分裂并停滞于中期，若与精子结合则完成第2次减数分裂形成受精卵，若未受精则在排卵后12 ～ 24 h退化。女性一生约排400个卵，其余均退化。
Clark等[9]对胎儿或成年不同阶段生殖细胞基因表达谱进行了总结，认为生殖细胞各阶段标志物有重叠，从而增加了各阶段生殖细胞的鉴定难度。Tada等[10]认为PGC与ESC均源于多向分化潜能的内细胞群，都能分化为原始三胚层及生殖系，并通过与体细胞融合可重组体细胞为胚胎样细胞。人胚胎干细胞（hESC）具有特异的集落形态学以及不能表达早期生殖细胞标志物，但能表达无精症缺失基因（DAZL）、nanos蛋白和Pumilio基因等[11]。1988年Thomson等[12]首次建立体外hESC系，为建立体外早期胚胎发育模型以及研究生殖细胞复杂的发育机制奠定了基础。Takahashi等[6]通过重组体细胞遗传物质而获得iPSC以及Deuse等[7]通过核移植技术获得的NT-ESC均提供了胚胎发育和疾病研究的细胞模型，为生殖医学的未来发展提供新途径。
人们一直认为女性一生中仅有400 ～ 500个卵泡发育成熟并排卵，从而女性生殖功能走向衰竭。近年来，多个研究表明成年卵巢中存在多能细胞，这种多能细胞被称为雌性生殖系干细胞（FGSC）[13-14]。Zou等[15]从新生和成年小鼠卵巢中成功获得这类干细胞系，并将绿色荧光蛋白表达阳性的FGSC移植入绝育小鼠，FGSC可分化为成熟的卵母细胞，产生绿色荧光蛋白阳性的后代。使通过植入卵母细胞和卵泡结构以重建卵巢组织不再是一个遥不可及的目标，为生殖细胞缺如患者带来希望。
3 各种干细胞分化为雌性生殖细胞的研究
3.1 ESC分化为雌性生殖细胞
Hübner等[3]在体外首次成功将鼠胚胎干细胞（mESC）诱导分化为OLC，并在其培养基中检测到有雌激素产生。Clark等[9]从形态学、基因表达等多方面表明hESC在体外也能分化为雌性生殖细胞，其能表达生殖细胞特异性基因DAZL及生长分化因子9、联会复合体蛋白1、联会复合体蛋白3等生殖细胞特异性标志物。但其未观察到完整的联合复合体的产生，可推测减数分裂需在体内必需的细胞因子和（或）体细胞的直接接触下才能有效准确地完成[10]。可见，ESC具有向雌性生殖细胞分化的潜力，但体外诱导分化获得的OLC存在成熟障碍。体外卵母细胞成熟障碍可能与卵母细胞生长发育的微环境有关。
3.2 成体干细胞分化为雌性生殖细胞
Dyce等[16]从胎猪皮肤分离出干细胞，并诱导其分化成OLC，有个别OLC自然形成孤雌胚胎样结构。随后，Dyce等[17]研究显示新生胎鼠皮肤干细胞也可在体外分化为OLC。皮肤干细胞在体外能分化为OLC，可推测其培养基中可能含有促进卵母细胞生长发育的必需生长因子。后来，Virant-Klun等[18]研究显示在卵巢早衰妇女的卵巢上皮细胞中存在多能性干细胞，并在体外、卵泡液诱导下此干细胞能产生OLC结构，并表达多能干细胞及卵细胞相关基因。卵巢生殖干细胞的提出为不同原因所致的卵巢功能衰竭或卵巢结构缺如的患者提供新的生殖细胞来源。
3.3 iPSC分化为雌性生殖细胞
Anchan等[19]研究表明源于鼠或人卵巢颗粒细胞的iPSC能分化为产生类固醇激素及生殖细胞样细胞，表达卵巢标志物以及早期配子形成标志物，并且源于卵巢颗粒细胞的iPSC比源于胚体细胞的iPSC在分化过程中表达量更高。由此表明从卵巢组织获得的iPSC更易向卵巢组织分化。
4 干细胞分化为雌性生殖细胞的应用前景及挑战
干细胞在一定条件下具有分化为雌性生殖细胞的潜力。然而，ESC因源于早期胚胎组织而存在伦理学争议；ESC高表达端粒酶活性，将其移植入受体组织后有产生致瘤性和免疫排斥等风险。这些不利因素严重限制了ESC应用于细胞治疗、再生医学及临床治疗。成体干细胞取材方便，无免疫排斥及致瘤性等弊端，是一种较ESC理想的干细胞。
生殖细胞的体内起源、迁移、发育及性别分化等过程需特定微环境及生殖细胞特定基因等共同调控。但生殖细胞体外培养模型建立较困难，以致人类对生殖细胞生长发育的调控机制至今仍不清楚。幸运的是，在体外成功将干细胞诱导为雌性生殖细胞的研究为建立哺乳动物雌性生殖细胞体外培养模型带来希望，为研究生殖细胞生长发育等过程中的复杂调控机制及不孕不育的发生机制奠定了基础，并有望为细胞治疗及再生医学提供一种新型理想的种子细胞。以后将为因卵巢功能衰竭或卵巢结构缺如致不孕患者提供卵巢再生的机会。
多能干细胞分化为雌性生殖细胞所面临的挑战：① 卵母细胞获得率低且具有随机性。由于对生殖细胞分化过程和启动性别定向分化的机制及其所需的微环境不明确，目前尚无提高其分化效率以实现规模化生产的有效、稳定、统一的诱导方案。② 体外卵母细胞成熟障碍。有研究报道人多能干细胞能分化为单倍体雌性生殖细胞，但所产生的单倍体雌性生殖细胞既不像卵母细胞也不具有受精能力，即具有体外卵母细胞成熟障碍的问题[20]。在辅助生殖技术中也同样存在体外卵母细胞成熟障碍，对此体外卵母细胞成熟技术（IVM）逐步得以研究，并认为IVM没有基于促性腺激素刺激的体外受精（IVF）的卵巢过度刺激的弊端且可进入卵母细胞体内发育过程中的自然周期，将来有望取代IVF。1998，Goud等[21]研究表皮生长因子及颗粒细胞对卵细胞核及卵细胞质成熟的作用，他们发现表皮生长因子对无颗粒细胞的卵细胞及有颗粒细胞的卵细胞的成熟均有作用；而颗粒细胞的存在有助于细胞质的成熟，提高受精后的卵裂率。Hayashi等[22]报道鼠干细胞能在体内外分化为OLC，并且能与精子完成受精过程，产生正常后代。此成果能否应用于人干细胞的分化，仍需进一步研究。但此次突破表明干细胞具有向成年机体所有细胞分化的能力，同时为由于医疗干预、毒物接触或卵巢早衰而致不孕患者通过iPSC获得新的有功能的卵母细胞开辟了另一条途径。③ PGC与ESC的关系。如前述，PGC与ESC具有相似的标志物表达谱，使得ESC与应用ESC分化产生的生殖细胞难以鉴别和分离。明确以及选择合适的特异性标志基因有助于间接了解体外生殖细胞的分化进程。④ 成体干细胞与生殖干细胞之间的关系目前尚未探讨清楚。⑤ 质疑生殖干细胞的存在。多个研究证实在哺乳动物的卵巢中发现潜在的生殖干细胞[23]，但仍然不确定这些细胞在生理条件下的卵巢中是否存在及其功能状态是否正常。并且，之前表明有PGC的研究中只是应用免疫荧光学证实有PGC的存在，但未观察到PGC进行减数分裂以及分化成卵细胞[24]。证明卵巢中存在PGC不同研究本身存在争论，比如对Ddx4的表达，一些实验中仅研究卵细胞但不研究生殖干细胞，因为表达细胞质标志物Ddx4的卵细胞不能发生有丝分裂，所以结果未发现Ddx4阳性的有丝分裂细胞[25]。Ddx4是存在于细胞质还是细胞表面，分离出生殖系干细胞是否可靠，这些问题使得类似实验结果不可靠，需后续研究加以明确。
上述各种问题的存在将严重影响干细胞在体外分化为雌性生殖细胞，使卵巢功能衰竭或结构缺如导致不孕患者卵巢再生的机会渺茫，严重阻碍临床恢复卵巢生殖功能及内分泌功能的进程。相信随着时代的进步和科学技术的发展，这些问题最终会被解决，干细胞体外分化为雌性生殖细胞的深入研究必将促进人类发育学的发展，为不同原因导致不孕患者带来新的希望。
5 结语
不孕不育发病率逐年增加，虽然辅助生殖技术的应用使不孕妇女妊娠成为可能，但无法从根本上解决卵巢功能或结构缺失患者的生育问题。已有研究发现mESC在体外诱导出OLC，并在培养基中检测到雌二醇的生成。但在人卵巢上皮细胞转分化为雌性生殖细胞的研究还存在很多问题，目前关于这方面的研究报道尚不多并且有一定的争议。因此，解决妇女因卵巢功能或结构确实所致的不孕，有待更多更全面深入的研究。
据统计，全球近72 400 000人或15%夫妻遭受不孕不育的困扰，其中女性不孕因素占50% ～ 60%[1]。虽然辅助生殖技术能够使80%以上的不孕不育夫妇怀孕，但无法从根本上解决卵巢功能衰竭或卵巢结构缺如所致的不孕[2]。2003年Hübner等[3]在体外首次成功将胚胎干细胞（ESC）诱导分化为卵母细胞样细胞（OLC），为卵巢功能低下或结构缺如致不孕患者带来希望。现细胞治疗已逐渐成为治疗退行性疾病的一种新兴方法。
1 干细胞：细胞治疗的新希望
干细胞的特性：① 自我更新能力；② 克隆性，即子细胞来源于同一个干细胞；③ 分化性，干细胞能分化为机体的不同类型细胞，所以又称“万能细胞”[4]。
干细胞分为ESC、成体干细胞、胚外组织干细胞和诱导多能干细胞（iPSC）与核转移胚胎干细胞（NT-ESC）。其中，ESC在多能阶段时期具有无限增殖能力，能稳定地分化为三胚层衍生细胞、组织及器官。成体干细胞有助于器官损伤后的修复[5]。胚外组织干细胞最大的优点在于其取材方便、资源充足、无伦理学争议、无致瘤风险及无免疫原性等。
Takahashi等[6]获得iPSC，并检出其表达ESC标志物和具有端粒酶活性，具有分化为三胚层能力。Deuse等[7]发现卵细胞过早退出减数分裂过程以及不适宜的生长环境为NT-ESC胚胎发育停止的关键因素。
可见，干细胞在体外能分化为雌性生殖细胞以及卵细胞。干细胞的分化潜能使其在生殖医学领域具有广阔的应用前景，为卵巢功能衰竭或卵巢结构缺失致生殖细胞缺如不孕患者带来希望。
2 雌性生殖细胞的体内发育及体外研究
原始生殖细胞（PGC）源于胚胎第4周卵黄囊顶近尿囊处的内胚层。PGC历经临近卵黄囊的胚外区域及内胚层的后肠，称为迁移后PGC[8]。胚胎第6周时，PGC迁入生殖腺内的初级性索，进行有丝分裂产生卵原细胞。若核型为46.XX，胚胎第10周时初级性索退化，未分化性腺的表面上皮增生再次向间充质伸入次级性索形成即皮质索，次级性索与上皮细胞分离后发育为卵巢皮质，未分化性腺的表面上皮下的间充质分化为白膜。胚胎第4个月时，皮质索断裂形成多个细胞团，其中央的卵原细胞继续增殖达高峰，约600万 ～ 700万个称为始基卵泡。妊娠中后期卵泡不断闭锁，至胎儿出生时卵巢中有100万～ 200万原始卵泡。经过儿童期至青春期，只剩下约30万个。经过原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡4个阶段卵泡成熟并排卵，至排卵前完成，形成次级卵母细胞，其迅速进入第2次减数分裂并停滞于中期，若与精子结合则完成第2次减数分裂形成受精卵，若未受精则在排卵后12 ～ 24 h退化。女性一生约排400个卵，其余均退化。
Clark等[9]对胎儿或成年不同阶段生殖细胞基因表达谱进行了总结，认为生殖细胞各阶段标志物有重叠，从而增加了各阶段生殖细胞的鉴定难度。Tada等[10]认为PGC与ESC均源于多向分化潜能的内细胞群，都能分化为原始三胚层及生殖系，并通过与体细胞融合可重组体细胞为胚胎样细胞。人胚胎干细胞（hESC）具有特异的集落形态学以及不能表达早期生殖细胞标志物，但能表达无精症缺失基因（DAZL）、nanos蛋白和Pumilio基因等[11]。1988年Thomson等[12]首次建立体外hESC系，为建立体外早期胚胎发育模型以及研究生殖细胞复杂的发育机制奠定了基础。Takahashi等[6]通过重组体细胞遗传物质而获得iPSC以及Deuse等[7]通过核移植技术获得的NT-ESC均提供了胚胎发育和疾病研究的细胞模型，为生殖医学的未来发展提供新途径。
人们一直认为女性一生中仅有400 ～ 500个卵泡发育成熟并排卵，从而女性生殖功能走向衰竭。近年来，多个研究表明成年卵巢中存在多能细胞，这种多能细胞被称为雌性生殖系干细胞（FGSC）[13-14]。Zou等[15]从新生和成年小鼠卵巢中成功获得这类干细胞系，并将绿色荧光蛋白表达阳性的FGSC移植入绝育小鼠，FGSC可分化为成熟的卵母细胞，产生绿色荧光蛋白阳性的后代。使通过植入卵母细胞和卵泡结构以重建卵巢组织不再是一个遥不可及的目标，为生殖细胞缺如患者带来希望。
3 各种干细胞分化为雌性生殖细胞的研究
3.1 ESC分化为雌性生殖细胞
Hübner等[3]在体外首次成功将鼠胚胎干细胞（mESC）诱导分化为OLC，并在其培养基中检测到有雌激素产生。Clark等[9]从形态学、基因表达等多方面表明hESC在体外也能分化为雌性生殖细胞，其能表达生殖细胞特异性基因DAZL及生长分化因子9、联会复合体蛋白1、联会复合体蛋白3等生殖细胞特异性标志物。但其未观察到完整的联合复合体的产生，可推测减数分裂需在体内必需的细胞因子和（或）体细胞的直接接触下才能有效准确地完成[10]。可见，ESC具有向雌性生殖细胞分化的潜力，但体外诱导分化获得的OLC存在成熟障碍。体外卵母细胞成熟障碍可能与卵母细胞生长发育的微环境有关。
3.2 成体干细胞分化为雌性生殖细胞
Dyce等[16]从胎猪皮肤分离出干细胞，并诱导其分化成OLC，有个别OLC自然形成孤雌胚胎样结构。随后，Dyce等[17]研究显示新生胎鼠皮肤干细胞也可在体外分化为OLC。皮肤干细胞在体外能分化为OLC，可推测其培养基中可能含有促进卵母细胞生长发育的必需生长因子。后来，Virant-Klun等[18]研究显示在卵巢早衰妇女的卵巢上皮细胞中存在多能性干细胞，并在体外、卵泡液诱导下此干细胞能产生OLC结构，并表达多能干细胞及卵细胞相关基因。卵巢生殖干细胞的提出为不同原因所致的卵巢功能衰竭或卵巢结构缺如的患者提供新的生殖细胞来源。
3.3 iPSC分化为雌性生殖细胞
Anchan等[19]研究表明源于鼠或人卵巢颗粒细胞的iPSC能分化为产生类固醇激素及生殖细胞样细胞，表达卵巢标志物以及早期配子形成标志物，并且源于卵巢颗粒细胞的iPSC比源于胚体细胞的iPSC在分化过程中表达量更高。由此表明从卵巢组织获得的iPSC更易向卵巢组织分化。
4 干细胞分化为雌性生殖细胞的应用前景及挑战
干细胞在一定条件下具有分化为雌性生殖细胞的潜力。然而，ESC因源于早期胚胎组织而存在伦理学争议；ESC高表达端粒酶活性，将其移植入受体组织后有产生致瘤性和免疫排斥等风险。这些不利因素严重限制了ESC应用于细胞治疗、再生医学及临床治疗。成体干细胞取材方便，无免疫排斥及致瘤性等弊端，是一种较ESC理想的干细胞。
生殖细胞的体内起源、迁移、发育及性别分化等过程需特定微环境及生殖细胞特定基因等共同调控。但生殖细胞体外培养模型建立较困难，以致人类对生殖细胞生长发育的调控机制至今仍不清楚。幸运的是，在体外成功将干细胞诱导为雌性生殖细胞的研究为建立哺乳动物雌性生殖细胞体外培养模型带来希望，为研究生殖细胞生长发育等过程中的复杂调控机制及不孕不育的发生机制奠定了基础，并有望为细胞治疗及再生医学提供一种新型理想的种子细胞。以后将为因卵巢功能衰竭或卵巢结构缺如致不孕患者提供卵巢再生的机会。
多能干细胞分化为雌性生殖细胞所面临的挑战：① 卵母细胞获得率低且具有随机性。由于对生殖细胞分化过程和启动性别定向分化的机制及其所需的微环境不明确，目前尚无提高其分化效率以实现规模化生产的有效、稳定、统一的诱导方案。② 体外卵母细胞成熟障碍。有研究报道人多能干细胞能分化为单倍体雌性生殖细胞，但所产生的单倍体雌性生殖细胞既不像卵母细胞也不具有受精能力，即具有体外卵母细胞成熟障碍的问题[20]。在辅助生殖技术中也同样存在体外卵母细胞成熟障碍，对此体外卵母细胞成熟技术（IVM）逐步得以研究，并认为IVM没有基于促性腺激素刺激的体外受精（IVF）的卵巢过度刺激的弊端且可进入卵母细胞体内发育过程中的自然周期，将来有望取代IVF。1998，Goud等[21]研究表皮生长因子及颗粒细胞对卵细胞核及卵细胞质成熟的作用，他们发现表皮生长因子对无颗粒细胞的卵细胞及有颗粒细胞的卵细胞的成熟均有作用；而颗粒细胞的存在有助于细胞质的成熟，提高受精后的卵裂率。Hayashi等[22]报道鼠干细胞能在体内外分化为OLC，并且能与精子完成受精过程，产生正常后代。此成果能否应用于人干细胞的分化，仍需进一步研究。但此次突破表明干细胞具有向成年机体所有细胞分化的能力，同时为由于医疗干预、毒物接触或卵巢早衰而致不孕患者通过iPSC获得新的有功能的卵母细胞开辟了另一条途径。③ PGC与ESC的关系。如前述，PGC与ESC具有相似的标志物表达谱，使得ESC与应用ESC分化产生的生殖细胞难以鉴别和分离。明确以及选择合适的特异性标志基因有助于间接了解体外生殖细胞的分化进程。④ 成体干细胞与生殖干细胞之间的关系目前尚未探讨清楚。⑤ 质疑生殖干细胞的存在。多个研究证实在哺乳动物的卵巢中发现潜在的生殖干细胞[23]，但仍然不确定这些细胞在生理条件下的卵巢中是否存在及其功能状态是否正常。并且，之前表明有PGC的研究中只是应用免疫荧光学证实有PGC的存在，但未观察到PGC进行减数分裂以及分化成卵细胞[24]。证明卵巢中存在PGC不同研究本身存在争论，比如对Ddx4的表达，一些实验中仅研究卵细胞但不研究生殖干细胞，因为表达细胞质标志物Ddx4的卵细胞不能发生有丝分裂，所以结果未发现Ddx4阳性的有丝分裂细胞[25]。Ddx4是存在于细胞质还是细胞表面，分离出生殖系干细胞是否可靠，这些问题使得类似实验结果不可靠，需后续研究加以明确。
上述各种问题的存在将严重影响干细胞在体外分化为雌性生殖细胞，使卵巢功能衰竭或结构缺如导致不孕患者卵巢再生的机会渺茫，严重阻碍临床恢复卵巢生殖功能及内分泌功能的进程。相信随着时代的进步和科学技术的发展，这些问题最终会被解决，干细胞体外分化为雌性生殖细胞的深入研究必将促进人类发育学的发展，为不同原因导致不孕患者带来新的希望。
5 结语
不孕不育发病率逐年增加，虽然辅助生殖技术的应用使不孕妇女妊娠成为可能，但无法从根本上解决卵巢功能或结构缺失患者的生育问题。已有研究发现mESC在体外诱导出OLC，并在培养基中检测到雌二醇的生成。但在人卵巢上皮细胞转分化为雌性生殖细胞的研究还存在很多问题，目前关于这方面的研究报道尚不多并且有一定的争议。因此，解决妇女因卵巢功能或结构确实所致的不孕，有待更多更全面深入的研究。