引用本文： 赵川, 李毅, 舒丽, 王文平, 谭敏, 杨凤, 周红. 阿德福韦酯对乙型肝炎病毒e抗原阴性慢性乙型肝炎患者T细胞亚群的影响. 华西医学, 2016, 31(1): 106-108. doi: 10.7507/1002-0179.20160028 复制
慢性乙型肝炎（CHB）在我国发病率较高，CHB患者病情常常反复发作，迁延不愈。目前认为乙型肝炎慢性化的主要机制与宿主抗病毒免疫功能低下，尤其与乙型肝炎病毒（HBV）特异性T细胞功能不全有关[1]。宿主的细胞免疫功能特别是CD4+和CD8+ T细胞反应对HBV的清除和疾病的转归有重要的影响[2]。常规的护肝降酶治疗在减轻肝脏炎症活动方面虽有一定作用，但由于HBV的持续复制与免疫功能紊乱，常不能避免肝炎病情的复发甚至加重进展。因此，持续的病毒抑制及持久的免疫控制可考虑作为治疗CHB的新手段。本研究通过比较CHB患者在阿德福韦酯治疗前后HBV DNA载量及T淋巴细胞水平的变化，从而了解阿德福韦酯治疗对CHB患者免疫功能的影响。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2012年5月－2013年5月在我院住院和门诊诊治的CHB患者56例，其中男45例，女11例；年龄18 ～ 58岁，平均（34.2±10.8）岁。患者均为依据《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》[3]进行临床诊断，乙型肝炎e抗原（HBeAg）阴性并符合抗病毒治疗指征[HbeAg阴性，HBV DNA＞1.0×104 copies/mL；年龄≥18岁，血清谷丙转氨酶（ALT）水平＞2倍正常值]的CHB患者。排除合并其他嗜肝病毒重叠感染、自身免疫性肝病、药物性肝损伤、酒精性肝病、肝癌患者。
1.2 治疗方法
给予阿德福韦酯（天津药物研究院药业有限责任公司）10 mg，1次/d，疾病早期同时给予其他保肝、对症治疗，肝功能稳定后仅给予阿德福韦酯治疗，观察48周。
1.3 血清学检测
用药前后定期检测肝功能常规项目[包括ALT、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）等]，以及血清HBV DNA。肝功能常规项目在日立717OA全自动生物化学分析仪检测，其中ALT采用国际临床化学联合会推荐的方法检测，ALT采用比色法检测，二者试剂均购自德国罗氏诊断有限公司；TBIL测定采用氧化法，采用四川迈克生物科技股份公司的检测试剂盒；HBV-DNA检测采用荧光定量聚合酶链式反应法，由中山大学达安基因股份有限公司提供试剂。
1.4 外周血T细胞亚群检测
治疗前后分别检测外周血T细胞亚群，使用美国BD公司生产的FACS Calibur型流式细胞仪及CD3/CD8/CD45/CD4检测试剂盒（美国BD公司原装试剂）。
1.5 统计学方法
应用SPSS 12.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差表示，HBV DNA值取其载量的对数值，转换后以均数±标准差表示；治疗前后的比较采用配对t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 治疗前后患者肝功能及HBV DNA变化
治疗后患者ALT、AST、TBIL和HBV DNA较治疗前均有明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
表1
治疗前后患者肝功能和HBV DNA变化比较（n=56，2.2 治疗前后患者T细胞亚群变化
治疗后患者CD4+ T细胞百分比较治疗前上升，而CD8+ T细胞百分比较治疗降低，CD4+/CD8+较治疗前升高，治疗前后患者T细胞亚群变化差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
表2
治疗前后患者T细胞亚群变化比较（n=56，3 讨论
我国是CHB高流行国家，大约7.18%的人口携带HBV[3]。通常情况下，大多数免疫功能健全的成年人感染HBV后可通过主动或被动免疫应答清除病毒，仅仅引起隐性感染或急性乙型肝炎过程，其后可获得对HBV再次感染的抵抗力。但少数免疫功能缺陷的成年人或经母婴传播的婴幼儿感染HBV后常不能有效清除感染的HBV，形成对HBV的免疫耐受，从而导致病毒的持续感染，其中部分感染者会发展成慢性活动性肝炎，甚至进展为肝功能失代偿、肝硬化或肝癌。因此导致乙型肝炎慢性化及病情进展转归主要与免疫功能紊乱有关，而T细胞免疫在HBV感染的结果中起了关键作用[4]。宿主的细胞免疫功能尤其是HBV特异性CD4+ T细胞反应和CD8+ T细胞反应对HBV的清除和疾病的转归有重要的影响，其中CD8+ T细胞功能失调与慢性HBV感染的免疫耐受状态有关[5]。而在CD4+ T细胞表达CD127和（或）CD25的亚群的比例改变与乙型肝炎的病情进展相关[6]。国外研究者还发现，CHB病毒感染者体内CD8和CD4 T细胞免疫反应低下与血清中的HBV载量密切相关[7]，表明高HBV负载可能影响T细胞免疫功能，而抗病毒治疗可以通过降低HBV载量而提高机体的免疫功能[4]。
目前抗病毒是治疗CHB的关键，干扰素是第一个用于临床的抗HBV药物，现已证实干扰素具有抗病毒和免疫调节双重作用。干扰素抗病毒的机制除产生抗病毒蛋白外，还促进感染的肝细胞HL-I类分子的表达，增强细胞毒性T细胞的杀伤效果。但干扰素抑制病毒作用较弱，不良反应较多，尤其聚乙二醇干扰素价格昂贵，影响了干扰素或聚乙二醇干扰素的应用。近十年来，核苷（酸）类似物开始用于抗HBV治疗，CHB的治疗水平得到了显著的提升。其中，拉米夫定是第一个批准用于CHB的核苷类抗病毒药物，在临床应用证明能够快速抑制HBV复制，同时国内外研究者还发现其对T细胞亚群有明显的影响，经治疗后，CD4+ T细胞相对率及CD4+/CD8+明显提高，而CD8+ T细胞相对率明显下降，表明拉米夫定可改善乙型肝炎患者的T细胞免疫功能[8]。然而，拉米夫定抗病毒治疗也存在一定的局限性，长期使用过程中易导致致HBV变异而出现耐药性，尤其是随着使用时间的增加，病毒变异耐药的几率也逐渐增加同，当使用时间超过5年时，67%的患者可出现耐药[9]。
阿德福韦酯是继拉米夫定之后第一个用于临床的核苷酸类似物口服抗病毒药物，拉米夫定耐药患者的首选药物之一，对拉米夫定耐药的患者和初治患者同样有效。阿德福韦酯耐药性低，抗HBV治疗3年的耐药变异率仅为3.9%[10]。阿德福韦酯能同时抑制野生型和拉米夫定耐药的HBV DNA聚合酶。国外也有用阿德福韦酯治疗HBeAg阳性CHB，发现患者的特异性CD4+ T细胞活性增强，并能促进HBeAg的阴转[11]。在CHB的自然史中，处于非活动期的患者可能出现1次或数次的肝炎发作，部分由于前C区和（或）C基因基本核心区启动子变异导致HBeAg表达水平低下或不表达，表现为HBeAg阴性，抗-HBe阳性的，HBV DNA活动性复制、ALT持续或反复异常，成为HBeAg阴性CHB。国内指南认为，这些患者患者抗病毒治疗停药后的复发率更高，最好选用耐药发生率低的核苷（酸）类似物治疗，且疗程宜长[3]。故我们选择阿德福韦酯进行研究。阿德福韦酯口服后在体内迅速地转化为阿德福韦，阿德福韦是一种单磷酸腺无环磷酸化核苷类似物。在细胞激酶的作用下被磷酸化为有活性的代谢产物即阿德福韦二磷酸盐。阿德福韦二磷酸盐通过下列2种机制抑制HBV DNA多聚酶：一是与自然底物脱氧腺苷三磷酸竞争，二是整合到病毒DNA后引起DNA链延长终止。本研究中虽然阿德福韦酯起效较慢，但仍对HBV DNA有明显的抑制作用。本研究进一步发现阿德福韦酯抑制病毒疗效确切，病毒载量显著下降，48周后多数患者病毒DNA低于检测下限。同时机体内患者CD4+ T细胞上升，CD8+ T细胞下降，而CD4+/CD8+明显上升。阿德福韦酯对CD4+ T细胞亚群的影响与国外的报道一致[11]。因此表明阿德福韦酯在抑制病毒的同时，不仅减轻了肝脏的炎症反应，同时通过纠正T细胞亚群的失衡，从而促进了T细胞介导的细胞免疫功能恢复。
综上所述，本研究主要观察了HBeAg阴性CHB患者接受阿德福韦酯治疗前后CD4+、CD8+ T细胞亚群及比例的变化，发现阿德福韦酯在抑制HBV的复制、减轻肝脏炎症反应的同时，也可能改善了CHB患者的细胞免疫功能。
慢性乙型肝炎（CHB）在我国发病率较高，CHB患者病情常常反复发作，迁延不愈。目前认为乙型肝炎慢性化的主要机制与宿主抗病毒免疫功能低下，尤其与乙型肝炎病毒（HBV）特异性T细胞功能不全有关[1]。宿主的细胞免疫功能特别是CD4+和CD8+ T细胞反应对HBV的清除和疾病的转归有重要的影响[2]。常规的护肝降酶治疗在减轻肝脏炎症活动方面虽有一定作用，但由于HBV的持续复制与免疫功能紊乱，常不能避免肝炎病情的复发甚至加重进展。因此，持续的病毒抑制及持久的免疫控制可考虑作为治疗CHB的新手段。本研究通过比较CHB患者在阿德福韦酯治疗前后HBV DNA载量及T淋巴细胞水平的变化，从而了解阿德福韦酯治疗对CHB患者免疫功能的影响。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2012年5月－2013年5月在我院住院和门诊诊治的CHB患者56例，其中男45例，女11例；年龄18 ～ 58岁，平均（34.2±10.8）岁。患者均为依据《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》[3]进行临床诊断，乙型肝炎e抗原（HBeAg）阴性并符合抗病毒治疗指征[HbeAg阴性，HBV DNA＞1.0×104 copies/mL；年龄≥18岁，血清谷丙转氨酶（ALT）水平＞2倍正常值]的CHB患者。排除合并其他嗜肝病毒重叠感染、自身免疫性肝病、药物性肝损伤、酒精性肝病、肝癌患者。
1.2 治疗方法
给予阿德福韦酯（天津药物研究院药业有限责任公司）10 mg，1次/d，疾病早期同时给予其他保肝、对症治疗，肝功能稳定后仅给予阿德福韦酯治疗，观察48周。
1.3 血清学检测
用药前后定期检测肝功能常规项目[包括ALT、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）等]，以及血清HBV DNA。肝功能常规项目在日立717OA全自动生物化学分析仪检测，其中ALT采用国际临床化学联合会推荐的方法检测，ALT采用比色法检测，二者试剂均购自德国罗氏诊断有限公司；TBIL测定采用氧化法，采用四川迈克生物科技股份公司的检测试剂盒；HBV-DNA检测采用荧光定量聚合酶链式反应法，由中山大学达安基因股份有限公司提供试剂。
1.4 外周血T细胞亚群检测
治疗前后分别检测外周血T细胞亚群，使用美国BD公司生产的FACS Calibur型流式细胞仪及CD3/CD8/CD45/CD4检测试剂盒（美国BD公司原装试剂）。
1.5 统计学方法
应用SPSS 12.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差表示，HBV DNA值取其载量的对数值，转换后以均数±标准差表示；治疗前后的比较采用配对t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 治疗前后患者肝功能及HBV DNA变化
治疗后患者ALT、AST、TBIL和HBV DNA较治疗前均有明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
表1
治疗前后患者肝功能和HBV DNA变化比较（n=56，2.2 治疗前后患者T细胞亚群变化
治疗后患者CD4+ T细胞百分比较治疗前上升，而CD8+ T细胞百分比较治疗降低，CD4+/CD8+较治疗前升高，治疗前后患者T细胞亚群变化差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。
表2
治疗前后患者T细胞亚群变化比较（n=56，3 讨论
我国是CHB高流行国家，大约7.18%的人口携带HBV[3]。通常情况下，大多数免疫功能健全的成年人感染HBV后可通过主动或被动免疫应答清除病毒，仅仅引起隐性感染或急性乙型肝炎过程，其后可获得对HBV再次感染的抵抗力。但少数免疫功能缺陷的成年人或经母婴传播的婴幼儿感染HBV后常不能有效清除感染的HBV，形成对HBV的免疫耐受，从而导致病毒的持续感染，其中部分感染者会发展成慢性活动性肝炎，甚至进展为肝功能失代偿、肝硬化或肝癌。因此导致乙型肝炎慢性化及病情进展转归主要与免疫功能紊乱有关，而T细胞免疫在HBV感染的结果中起了关键作用[4]。宿主的细胞免疫功能尤其是HBV特异性CD4+ T细胞反应和CD8+ T细胞反应对HBV的清除和疾病的转归有重要的影响，其中CD8+ T细胞功能失调与慢性HBV感染的免疫耐受状态有关[5]。而在CD4+ T细胞表达CD127和（或）CD25的亚群的比例改变与乙型肝炎的病情进展相关[6]。国外研究者还发现，CHB病毒感染者体内CD8和CD4 T细胞免疫反应低下与血清中的HBV载量密切相关[7]，表明高HBV负载可能影响T细胞免疫功能，而抗病毒治疗可以通过降低HBV载量而提高机体的免疫功能[4]。
目前抗病毒是治疗CHB的关键，干扰素是第一个用于临床的抗HBV药物，现已证实干扰素具有抗病毒和免疫调节双重作用。干扰素抗病毒的机制除产生抗病毒蛋白外，还促进感染的肝细胞HL-I类分子的表达，增强细胞毒性T细胞的杀伤效果。但干扰素抑制病毒作用较弱，不良反应较多，尤其聚乙二醇干扰素价格昂贵，影响了干扰素或聚乙二醇干扰素的应用。近十年来，核苷（酸）类似物开始用于抗HBV治疗，CHB的治疗水平得到了显著的提升。其中，拉米夫定是第一个批准用于CHB的核苷类抗病毒药物，在临床应用证明能够快速抑制HBV复制，同时国内外研究者还发现其对T细胞亚群有明显的影响，经治疗后，CD4+ T细胞相对率及CD4+/CD8+明显提高，而CD8+ T细胞相对率明显下降，表明拉米夫定可改善乙型肝炎患者的T细胞免疫功能[8]。然而，拉米夫定抗病毒治疗也存在一定的局限性，长期使用过程中易导致致HBV变异而出现耐药性，尤其是随着使用时间的增加，病毒变异耐药的几率也逐渐增加同，当使用时间超过5年时，67%的患者可出现耐药[9]。
阿德福韦酯是继拉米夫定之后第一个用于临床的核苷酸类似物口服抗病毒药物，拉米夫定耐药患者的首选药物之一，对拉米夫定耐药的患者和初治患者同样有效。阿德福韦酯耐药性低，抗HBV治疗3年的耐药变异率仅为3.9%[10]。阿德福韦酯能同时抑制野生型和拉米夫定耐药的HBV DNA聚合酶。国外也有用阿德福韦酯治疗HBeAg阳性CHB，发现患者的特异性CD4+ T细胞活性增强，并能促进HBeAg的阴转[11]。在CHB的自然史中，处于非活动期的患者可能出现1次或数次的肝炎发作，部分由于前C区和（或）C基因基本核心区启动子变异导致HBeAg表达水平低下或不表达，表现为HBeAg阴性，抗-HBe阳性的，HBV DNA活动性复制、ALT持续或反复异常，成为HBeAg阴性CHB。国内指南认为，这些患者患者抗病毒治疗停药后的复发率更高，最好选用耐药发生率低的核苷（酸）类似物治疗，且疗程宜长[3]。故我们选择阿德福韦酯进行研究。阿德福韦酯口服后在体内迅速地转化为阿德福韦，阿德福韦是一种单磷酸腺无环磷酸化核苷类似物。在细胞激酶的作用下被磷酸化为有活性的代谢产物即阿德福韦二磷酸盐。阿德福韦二磷酸盐通过下列2种机制抑制HBV DNA多聚酶：一是与自然底物脱氧腺苷三磷酸竞争，二是整合到病毒DNA后引起DNA链延长终止。本研究中虽然阿德福韦酯起效较慢，但仍对HBV DNA有明显的抑制作用。本研究进一步发现阿德福韦酯抑制病毒疗效确切，病毒载量显著下降，48周后多数患者病毒DNA低于检测下限。同时机体内患者CD4+ T细胞上升，CD8+ T细胞下降，而CD4+/CD8+明显上升。阿德福韦酯对CD4+ T细胞亚群的影响与国外的报道一致[11]。因此表明阿德福韦酯在抑制病毒的同时，不仅减轻了肝脏的炎症反应，同时通过纠正T细胞亚群的失衡，从而促进了T细胞介导的细胞免疫功能恢复。
综上所述，本研究主要观察了HBeAg阴性CHB患者接受阿德福韦酯治疗前后CD4+、CD8+ T细胞亚群及比例的变化，发现阿德福韦酯在抑制HBV的复制、减轻肝脏炎症反应的同时，也可能改善了CHB患者的细胞免疫功能。
