引用本文： 陈斌, 李雅斐, 苏云洁, 李熙鸿. 地塞米松对脓毒症相关性脑病大鼠海马区星形胶质细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达的影响. 华西医学, 2016, 31(6): 1013-1018. doi: 10.7507/1002-0179.201600273 复制
脓毒症相关性脑病（SAE）是全身炎症反应引起的脑损伤，常见于严重脓毒症/脓毒性休克患者[1]。其发病可能与全身炎症反应时氧化应激[2]、细胞因子风暴[3]、线粒体功能障碍[4]、细胞凋亡[5]和脑血流量减少[6]等有关。临床上主要采用对症支持治疗，其中，具有抗炎作用的糖皮质激素在严重脓毒症/脓毒性休克患者中的应用仍存在争议[6-8]。
中枢神经系统感染时星形胶质细胞被活化，细胞数量增加，以便清除坏死的组织和细胞，并阻止病原微生物、内毒素、炎性细胞侵入脑组织，有助于宿主的防御和脑组织的修复[9]。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是星形胶质细胞特异表达的细胞骨架蛋白，为星形胶质细胞免疫荧光染色的特征性标记[10]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与了机体的免疫调节，其适度表达对神经细胞具有保护作用[11]。但是，关于SAE时海马区星形胶质细胞表达mTOR的研究比较少。本实验拟建立SAE大鼠模型，采用免疫荧光等技术，研究SAE时海马区星形胶质细胞mTOR表达及地塞米松对其表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
无特定病原体级30日龄雄性Wistar大鼠90只，购自四川简阳达硕动物科技有限公司，平均体质量（110±15） g，所有大鼠均在避强光、避噪音、自由获取饲料和水的环境中饲养。
1.2 主要材料和仪器
一抗GFAP鼠抗免疫球蛋白（Ig）G和mTOR兔抗IgG（美国Millipore公司），二抗DyLight 488山羊抗鼠和Cy3山羊抗兔抗体IgG（美国Jackson ImmunoResearch公司），Western二抗为辣根过氧化物酶标志的羊抗兔IgG抗体（美国Sigma公司），Western发光底物（ECL）显色试剂盒（美国Sigma公司），转移缓冲液（美国Amresco公司），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（TBS，美国Amresco公司），三羟甲基氨基甲烷缓冲液+吐温（TBST，美国Amreseo公司），多导生理记录仪（日本光电公司），光学显微镜（日本Olympus公司），H-600透射电子显微镜（日本Hitachi公司），GDS8000凝胶成像分析系统（美国UVP公司）。
1.3 动物分组和SAE大鼠模型建立
1.3.1 动物分型
90只30日龄Wistar大鼠按随机数字表法分为假手术组（10只）和盲肠结扎穿孔术（CLP）组（80只）；SAE造模成功后，再将SAE大鼠随机分为未使用地塞米松组（脑病未治疗组）和使用地塞米松组（地塞米松组）。
1.3.2 脑电图和诱发电位的监测
大鼠在CLP或假手术前10 d放置脑电监测电极。腹腔内注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉大鼠，常规外科消毒，在头颅中间矢状位行约3 cm皮肤切口，分离软组织，去除骨膜。用牙科钻在头颅前囟点后2.5 mm与右侧矢状缝旁2.5 mm处（皮质电极）和前囟点前10 mm与矢状面两侧1 mm处（额窦电极）分别钻孔，将3根不锈钢螺丝轻轻置入硬脑膜。放置好电极后，用牙托粉固定并封闭骨孔，缝合皮肤。两个刺激电极置于大鼠左侧尾巴中，两电极间距2 mm。
脑电图监测：立体定位仪将大鼠头部固定，皮质电极记录脑电图，对侧额窦电极作为信号地线。脑电图机记录δ波（0.5～3 Hz），θ波（4～8 Hz），α波（8～13 Hz）和β波（13～30 Hz）的频带，以及棘波出现的时间。
躯体诱发电位（SEP）监测：两个刺激电极刺激大鼠产生SEP。刺激信号为多导生理记录仪产生的2 ms直流方形波脉冲，强度为5～15 mA，波宽10 ms，频率3 Hz，叠加次数200次。皮质电极记录SEP，同侧额窦电极作为参考电极，对侧额窦电极作为信号地线。观察记录P1波的波幅（μV）和P1、N1波的潜伏期（ms）。
1.3.3 动物模型的建立
按照参考文献[12]建立脓毒症大鼠CLP模型和实施假手术。CLP组采用CLP。腹腔内注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉大鼠，待大鼠被麻醉后，用胶布固定于手术台上，聚维酮碘溶液消毒腹部皮肤，沿腹中线行约2 cm的纵向切口，打开腹腔，找到盲肠，将盲肠内容物轻轻挤向远端盲肠，在盲肠根部结扎盲肠，用18GG的穿刺针在盲肠根部从肠系膜侧向肠系膜游离侧穿刺2次，挤出少量粪便至腹腔，回纳盲肠至腹腔，保持切口不被粪便污染，逐层缝合腹壁，术后皮下注射林格液（5 mL/100 g）抗休克。假手术组未进行盲肠结扎和穿刺，余处理同上。
CLP后12 h观察记录大鼠的精神及活动状态、切口愈合状况及有无感染等一般情况，进行神经行为学评分（包括耳廓反射、角膜反射、翻正反射、甩尾反射和逃避反射），0分为无反射，1分为反射减弱（10 s以内缺乏反射），2分为正常反射，最高评分为10分。并完成脑电图和SEP检查，如神经行为学评分降低，并伴有脑电图、SEP异常则诊断为SAE[13]，证明SAE大鼠动物模型建立成功。
SAE大鼠造模成功后，地塞米松组行尾静脉注射地塞米松（1 mg/kg），隔天1次，共3次；脑病未治疗组注射同剂量的生理盐水。
1.4 标本收集
大鼠40日龄时再次进行神经行为学评分和脑电图、SEP检查，然后统一处死大鼠，在冠状面视交叉后1～4 mm处切取脑组织，部分组织采用4%多聚甲醛溶液固定，常规方法石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红染色及免疫组织化学检测，其余置−80℃冰箱备用。
1.5 蛋白质印迹法检测mTOR蛋白的表达
提取大鼠海马区脑组织总蛋白，用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。制备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，上样电泳，湿转法将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜上，TBST漂洗膜3次，脱脂牛奶封闭转印膜，然后，将膜置于溶有LC3或β-actin的一抗体的封闭液中，室温0.5 h，4℃过夜，TBST在室温下脱色，TBS漂洗10 min，同上方法进行二抗稀释液与膜接触。取出转印膜，加ECL底物显色液，室温反应1 min；放进暗盒中，洗片，将胶片进行扫描或拍照。另外，凝胶图像处理系统分析十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白条带，测定mTOR和β-actin条带吸光度值，并计算mTOR/β-actin的比值。
1.6 免疫荧光检测GFAP和mTOR的表达
4%多聚甲醛固定待测脑组织24～48 h，4%琼脂糖包埋组织，震荡切片，切片厚度4 μm，漂洗后用5%的胎牛血清封闭液室温封闭1 h，加入1︰200稀释的一抗，4℃冰箱孵育过夜，37 ℃复温l h，磷酸盐缓冲液（PBS）振荡洗涤3遍；加入1︰800稀释的二抗，37℃避光孵育1 h，PBS振荡洗涤3遍；用90%甘油封片，4℃冰箱避光保存，荧光显微镜观察。
1.7 数据收集
在荧光显微镜的电脑屏幕上，观察星形胶质细胞的形态。不同倍数的物镜下采集图像，采用图像分析系统软件（Software Image Pm Plus 4.5 for Windows）进行定量的分析。
1.8 统计学方法
应用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计学分析。正态分布计量资料采用均数±标准差表示，组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 CLP大鼠SAE的发病率
80只CLP Wistar大鼠在术后12 h内死亡6只，CLP后12 h时检查发现存活74只大鼠中有28只出现神经行为学评分降低、脑电图和SEP异常，诊断为SAE，发病率为37.84%（28/74）。
2.2 地塞米松对SAE大鼠神经行为学、脑电图和SEP的影响
大鼠40日龄时，对各组6只大鼠进行神经行为学评分、脑电图和SEP检查，结果显示：与脑病未治疗组比较，地塞米松组大鼠神经行为学评分降低；脑电图的α波明显减少，δ波增加；SEP的P1振幅下降，P1和N1潜伏期延长；以上差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
表1
各组大鼠神经行为学评分、脑电图和SEP的比较（n=6，2.3 地塞米松对SAE大鼠海马区神经细胞mTOR表达的影响
地塞米松组大鼠海马区神经细胞mTOR表达明显低于脑病未治疗组（P＜0.05）。见图 1、2。
图1
蛋白质印迹法检测SAE 大鼠海马区神经细胞mTOR 的表达 图 2各组 mTOR 阳性细胞百分比直条图 *与假手术组和地塞米松组比较，P＜0.05 图 33 各组GFAP阳性细胞数量直条图 图 4各组大鼠海马区星形胶质细胞免疫荧光图片（标尺：30 μm） 绿色荧光示星形胶质细胞GFAP 4a. 假手术组 4b. 脑病未治疗组 4c. 地塞米松组 图 55 各组大鼠海马区星形胶质细胞免疫荧光图片（标尺：50 μm） 图 6各组GFAP/mTOR融合后阳性细胞数量直条图 *与假手术组和地塞米松组比较，P＜0.05；#与假手术组比较，P＜0.05
2.4 SAE大鼠海马区星形胶质细胞对地塞米松的反应
GFAP免疫荧光染色提示：假手术组大鼠海马区星形胶质细胞胞体小，突起细。而脑病未治疗组星形胶质细胞胞体和突起肥大，与假手术组比较，细胞数量明显增多（P＜0.05）。与脑病未治疗组比较，地塞米松组星形胶质细胞胞体小，突起细，细胞数量明显减少（P＜0.05）。见图 3、4。
2.5 地塞米松对SAE大鼠海马区星形胶质细胞mTOR表达的影响
假手术组和地塞米松组大鼠海马区表达mTOR的星形胶质细胞较少。与假手术组比较，脑病未治疗组表达mTOR的星形胶质细胞数量明显增多（P＜0.05）；与脑病未治疗组比较，地塞米松组表达mTOR的星形胶质细胞数量明显减少（P＜0.05）。见图 5、6。
3 讨论
本研究通过CLP建立SAE大鼠模型和荧光免疫技术发现，SAE大鼠在全身炎症反应时海马区星形胶质细胞胞体明显增大，突起肥大，细胞数量增加，mTOR表达上调。SAE大鼠使用地塞米松治疗后海马区星形胶质细胞胞体变小，突起变细，细胞数量减少，mTOR表达下调，大鼠神经行为学评分降低，脑电图和SEP明显异常。上述研究结果表明，SAE时大鼠海马区星形胶质细胞被激活，细胞出现反应性增生，免疫反应增强，而地塞米松对其具有抑制作用。
星形胶质细胞被激活，反应性增生是中枢神经系统感染，尤其是不同类型病毒性脑炎突出的病理改变[13]，而腹膜炎所致的全身炎症反应也可以诱导星形胶质细胞反应性增生[14]。但是，增生活化的星形胶质细胞对神经元是否存在保护作用仍存在争论。一方面，增生活化的星形胶质细胞可以通过包绕血管周围炎症细胞和受损组织，分泌神经营养因子，如碱性成纤维生长因子、脑源性生长因子等，在神经保护及修复中发挥作用[14]。另一方面，增生活化的星形胶质细胞也可分泌肿瘤坏死因子-α[15]、白细胞介素-6[16]等前炎症细胞因子，导致免疫损伤。SAE时星形胶质细胞是否存在反应性增生，对神经系统的作用并不十分清楚。因此，我们拟研究SAE时大鼠海马区星形胶质细胞反应性增生，同时检查其mTOR的表达。
mTOR在细胞凋亡及自噬、蛋白质合成、免疫、细胞运动及代谢中发挥重要的作用[17]。当机体缺乏营养、能量和生长因子时，mTOR可以根据机体的需要调节细胞胞体的扩张能力，促进细胞生长，同时，通过激活下游效应分子S6K1，传递有丝分裂信号，上调细胞周期素和细胞周期依赖性蛋白激酶的翻译功能，促进细胞增殖与分化[18]，另外，mTOR也可以通过调节蛋白质的合成、抗凋亡和抗自噬功能参与细胞的生长和增殖[19]。在单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞殖的炎性反应中，mTOR可抑制核转录因子κB生成，激活信号转导及转录激活蛋白3，增加抗炎因子白细胞介素-10的产生[19-20]，同时，mTOR也可以通过调节T细胞活化参与炎症反应时的免疫调节[21]。因此，炎症反应时适度mTOR表达有利于神经细胞增生和修复。本研究表明，SAE时大鼠海马区星形胶质细胞被激活，GFAP表达上调，存在反应性增生，同时，具有促神经生长、抗凋亡、抗自噬和抗炎作用的mTOR表达上调，提示在SAE早期，激活的星形胶质细胞可能对中枢神经系统具有保护作用。
尽管糖皮质激素在严重脓毒症/脓毒性休克中的使用已有大量的研究，但是，其安全性和有效性仍存在争论[6-8]。Minneci等[22]Meta分析研究了糖皮质激素治疗严重脓毒症/脓毒性休克的疗效，认为脓毒性休克时氢化可的松5～7 d生理剂量使用可以提高患者的生存率。Levy等[23]通过建立脑膜炎球菌所致脓毒症小鼠模型研究了地塞米松治疗脓毒症的疗效，结果表明，地塞米松可以提高血液中白细胞介素-10的水平，降低肿瘤坏死因子-α水平和血中细菌的负荷，作者认为脓毒症时地塞米松的使用可能会对机体产生有利影响。但是，Atkinson等[24]对糖皮质激素在脓毒性休克中的应用进行了风险分层分析，发现脓毒性休克患者并不能从糖皮质激素使用中获益。Casserly等[25]研究发现糖皮质激素使用可以增加脓毒性休克患者住院病死率。本研究发现，大鼠患SAE时，地塞米松可以抑制其海马区星形胶质细胞的反应性增生，下调mTOR表达，且与脑病未治疗组比较，地塞米松组大鼠神经行为学、脑电图和SEP并未得到改善，反而导致大鼠神经行为学评分降低。上述结果表明，SAE时，早期使用地塞米松可能不利于其脑损伤的修复。
综上所述，SAE大鼠在全身炎症反应时，海马区星形胶质细胞mTOR表达上调，细胞出现反应性增生，从而抵抗大鼠神经损伤，而早期使用地塞米松可以抑制上述反应，不利于SAE脑损伤的修复。因此，建议SAE患者，特别是儿童，不宜早期使用地塞米松。
脓毒症相关性脑病（SAE）是全身炎症反应引起的脑损伤，常见于严重脓毒症/脓毒性休克患者[1]。其发病可能与全身炎症反应时氧化应激[2]、细胞因子风暴[3]、线粒体功能障碍[4]、细胞凋亡[5]和脑血流量减少[6]等有关。临床上主要采用对症支持治疗，其中，具有抗炎作用的糖皮质激素在严重脓毒症/脓毒性休克患者中的应用仍存在争议[6-8]。
中枢神经系统感染时星形胶质细胞被活化，细胞数量增加，以便清除坏死的组织和细胞，并阻止病原微生物、内毒素、炎性细胞侵入脑组织，有助于宿主的防御和脑组织的修复[9]。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是星形胶质细胞特异表达的细胞骨架蛋白，为星形胶质细胞免疫荧光染色的特征性标记[10]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与了机体的免疫调节，其适度表达对神经细胞具有保护作用[11]。但是，关于SAE时海马区星形胶质细胞表达mTOR的研究比较少。本实验拟建立SAE大鼠模型，采用免疫荧光等技术，研究SAE时海马区星形胶质细胞mTOR表达及地塞米松对其表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
无特定病原体级30日龄雄性Wistar大鼠90只，购自四川简阳达硕动物科技有限公司，平均体质量（110±15） g，所有大鼠均在避强光、避噪音、自由获取饲料和水的环境中饲养。
1.2 主要材料和仪器
一抗GFAP鼠抗免疫球蛋白（Ig）G和mTOR兔抗IgG（美国Millipore公司），二抗DyLight 488山羊抗鼠和Cy3山羊抗兔抗体IgG（美国Jackson ImmunoResearch公司），Western二抗为辣根过氧化物酶标志的羊抗兔IgG抗体（美国Sigma公司），Western发光底物（ECL）显色试剂盒（美国Sigma公司），转移缓冲液（美国Amresco公司），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（TBS，美国Amresco公司），三羟甲基氨基甲烷缓冲液+吐温（TBST，美国Amreseo公司），多导生理记录仪（日本光电公司），光学显微镜（日本Olympus公司），H-600透射电子显微镜（日本Hitachi公司），GDS8000凝胶成像分析系统（美国UVP公司）。
1.3 动物分组和SAE大鼠模型建立
1.3.1 动物分型
90只30日龄Wistar大鼠按随机数字表法分为假手术组（10只）和盲肠结扎穿孔术（CLP）组（80只）；SAE造模成功后，再将SAE大鼠随机分为未使用地塞米松组（脑病未治疗组）和使用地塞米松组（地塞米松组）。
1.3.2 脑电图和诱发电位的监测
大鼠在CLP或假手术前10 d放置脑电监测电极。腹腔内注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉大鼠，常规外科消毒，在头颅中间矢状位行约3 cm皮肤切口，分离软组织，去除骨膜。用牙科钻在头颅前囟点后2.5 mm与右侧矢状缝旁2.5 mm处（皮质电极）和前囟点前10 mm与矢状面两侧1 mm处（额窦电极）分别钻孔，将3根不锈钢螺丝轻轻置入硬脑膜。放置好电极后，用牙托粉固定并封闭骨孔，缝合皮肤。两个刺激电极置于大鼠左侧尾巴中，两电极间距2 mm。
脑电图监测：立体定位仪将大鼠头部固定，皮质电极记录脑电图，对侧额窦电极作为信号地线。脑电图机记录δ波（0.5～3 Hz），θ波（4～8 Hz），α波（8～13 Hz）和β波（13～30 Hz）的频带，以及棘波出现的时间。
躯体诱发电位（SEP）监测：两个刺激电极刺激大鼠产生SEP。刺激信号为多导生理记录仪产生的2 ms直流方形波脉冲，强度为5～15 mA，波宽10 ms，频率3 Hz，叠加次数200次。皮质电极记录SEP，同侧额窦电极作为参考电极，对侧额窦电极作为信号地线。观察记录P1波的波幅（μV）和P1、N1波的潜伏期（ms）。
1.3.3 动物模型的建立
按照参考文献[12]建立脓毒症大鼠CLP模型和实施假手术。CLP组采用CLP。腹腔内注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉大鼠，待大鼠被麻醉后，用胶布固定于手术台上，聚维酮碘溶液消毒腹部皮肤，沿腹中线行约2 cm的纵向切口，打开腹腔，找到盲肠，将盲肠内容物轻轻挤向远端盲肠，在盲肠根部结扎盲肠，用18GG的穿刺针在盲肠根部从肠系膜侧向肠系膜游离侧穿刺2次，挤出少量粪便至腹腔，回纳盲肠至腹腔，保持切口不被粪便污染，逐层缝合腹壁，术后皮下注射林格液（5 mL/100 g）抗休克。假手术组未进行盲肠结扎和穿刺，余处理同上。
CLP后12 h观察记录大鼠的精神及活动状态、切口愈合状况及有无感染等一般情况，进行神经行为学评分（包括耳廓反射、角膜反射、翻正反射、甩尾反射和逃避反射），0分为无反射，1分为反射减弱（10 s以内缺乏反射），2分为正常反射，最高评分为10分。并完成脑电图和SEP检查，如神经行为学评分降低，并伴有脑电图、SEP异常则诊断为SAE[13]，证明SAE大鼠动物模型建立成功。
SAE大鼠造模成功后，地塞米松组行尾静脉注射地塞米松（1 mg/kg），隔天1次，共3次；脑病未治疗组注射同剂量的生理盐水。
1.4 标本收集
大鼠40日龄时再次进行神经行为学评分和脑电图、SEP检查，然后统一处死大鼠，在冠状面视交叉后1～4 mm处切取脑组织，部分组织采用4%多聚甲醛溶液固定，常规方法石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红染色及免疫组织化学检测，其余置−80℃冰箱备用。
1.5 蛋白质印迹法检测mTOR蛋白的表达
提取大鼠海马区脑组织总蛋白，用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。制备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，上样电泳，湿转法将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜上，TBST漂洗膜3次，脱脂牛奶封闭转印膜，然后，将膜置于溶有LC3或β-actin的一抗体的封闭液中，室温0.5 h，4℃过夜，TBST在室温下脱色，TBS漂洗10 min，同上方法进行二抗稀释液与膜接触。取出转印膜，加ECL底物显色液，室温反应1 min；放进暗盒中，洗片，将胶片进行扫描或拍照。另外，凝胶图像处理系统分析十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白条带，测定mTOR和β-actin条带吸光度值，并计算mTOR/β-actin的比值。
1.6 免疫荧光检测GFAP和mTOR的表达
4%多聚甲醛固定待测脑组织24～48 h，4%琼脂糖包埋组织，震荡切片，切片厚度4 μm，漂洗后用5%的胎牛血清封闭液室温封闭1 h，加入1︰200稀释的一抗，4℃冰箱孵育过夜，37 ℃复温l h，磷酸盐缓冲液（PBS）振荡洗涤3遍；加入1︰800稀释的二抗，37℃避光孵育1 h，PBS振荡洗涤3遍；用90%甘油封片，4℃冰箱避光保存，荧光显微镜观察。
1.7 数据收集
在荧光显微镜的电脑屏幕上，观察星形胶质细胞的形态。不同倍数的物镜下采集图像，采用图像分析系统软件（Software Image Pm Plus 4.5 for Windows）进行定量的分析。
1.8 统计学方法
应用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计学分析。正态分布计量资料采用均数±标准差表示，组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 CLP大鼠SAE的发病率
80只CLP Wistar大鼠在术后12 h内死亡6只，CLP后12 h时检查发现存活74只大鼠中有28只出现神经行为学评分降低、脑电图和SEP异常，诊断为SAE，发病率为37.84%（28/74）。
2.2 地塞米松对SAE大鼠神经行为学、脑电图和SEP的影响
大鼠40日龄时，对各组6只大鼠进行神经行为学评分、脑电图和SEP检查，结果显示：与脑病未治疗组比较，地塞米松组大鼠神经行为学评分降低；脑电图的α波明显减少，δ波增加；SEP的P1振幅下降，P1和N1潜伏期延长；以上差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
表1
各组大鼠神经行为学评分、脑电图和SEP的比较（n=6，2.3 地塞米松对SAE大鼠海马区神经细胞mTOR表达的影响
地塞米松组大鼠海马区神经细胞mTOR表达明显低于脑病未治疗组（P＜0.05）。见图 1、2。
图1
蛋白质印迹法检测SAE 大鼠海马区神经细胞mTOR 的表达 图 2各组 mTOR 阳性细胞百分比直条图 *与假手术组和地塞米松组比较，P＜0.05 图 33 各组GFAP阳性细胞数量直条图 图 4各组大鼠海马区星形胶质细胞免疫荧光图片（标尺：30 μm） 绿色荧光示星形胶质细胞GFAP 4a. 假手术组 4b. 脑病未治疗组 4c. 地塞米松组 图 55 各组大鼠海马区星形胶质细胞免疫荧光图片（标尺：50 μm） 图 6各组GFAP/mTOR融合后阳性细胞数量直条图 *与假手术组和地塞米松组比较，P＜0.05；#与假手术组比较，P＜0.05
2.4 SAE大鼠海马区星形胶质细胞对地塞米松的反应
GFAP免疫荧光染色提示：假手术组大鼠海马区星形胶质细胞胞体小，突起细。而脑病未治疗组星形胶质细胞胞体和突起肥大，与假手术组比较，细胞数量明显增多（P＜0.05）。与脑病未治疗组比较，地塞米松组星形胶质细胞胞体小，突起细，细胞数量明显减少（P＜0.05）。见图 3、4。
2.5 地塞米松对SAE大鼠海马区星形胶质细胞mTOR表达的影响
假手术组和地塞米松组大鼠海马区表达mTOR的星形胶质细胞较少。与假手术组比较，脑病未治疗组表达mTOR的星形胶质细胞数量明显增多（P＜0.05）；与脑病未治疗组比较，地塞米松组表达mTOR的星形胶质细胞数量明显减少（P＜0.05）。见图 5、6。
3 讨论
本研究通过CLP建立SAE大鼠模型和荧光免疫技术发现，SAE大鼠在全身炎症反应时海马区星形胶质细胞胞体明显增大，突起肥大，细胞数量增加，mTOR表达上调。SAE大鼠使用地塞米松治疗后海马区星形胶质细胞胞体变小，突起变细，细胞数量减少，mTOR表达下调，大鼠神经行为学评分降低，脑电图和SEP明显异常。上述研究结果表明，SAE时大鼠海马区星形胶质细胞被激活，细胞出现反应性增生，免疫反应增强，而地塞米松对其具有抑制作用。
星形胶质细胞被激活，反应性增生是中枢神经系统感染，尤其是不同类型病毒性脑炎突出的病理改变[13]，而腹膜炎所致的全身炎症反应也可以诱导星形胶质细胞反应性增生[14]。但是，增生活化的星形胶质细胞对神经元是否存在保护作用仍存在争论。一方面，增生活化的星形胶质细胞可以通过包绕血管周围炎症细胞和受损组织，分泌神经营养因子，如碱性成纤维生长因子、脑源性生长因子等，在神经保护及修复中发挥作用[14]。另一方面，增生活化的星形胶质细胞也可分泌肿瘤坏死因子-α[15]、白细胞介素-6[16]等前炎症细胞因子，导致免疫损伤。SAE时星形胶质细胞是否存在反应性增生，对神经系统的作用并不十分清楚。因此，我们拟研究SAE时大鼠海马区星形胶质细胞反应性增生，同时检查其mTOR的表达。
mTOR在细胞凋亡及自噬、蛋白质合成、免疫、细胞运动及代谢中发挥重要的作用[17]。当机体缺乏营养、能量和生长因子时，mTOR可以根据机体的需要调节细胞胞体的扩张能力，促进细胞生长，同时，通过激活下游效应分子S6K1，传递有丝分裂信号，上调细胞周期素和细胞周期依赖性蛋白激酶的翻译功能，促进细胞增殖与分化[18]，另外，mTOR也可以通过调节蛋白质的合成、抗凋亡和抗自噬功能参与细胞的生长和增殖[19]。在单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞殖的炎性反应中，mTOR可抑制核转录因子κB生成，激活信号转导及转录激活蛋白3，增加抗炎因子白细胞介素-10的产生[19-20]，同时，mTOR也可以通过调节T细胞活化参与炎症反应时的免疫调节[21]。因此，炎症反应时适度mTOR表达有利于神经细胞增生和修复。本研究表明，SAE时大鼠海马区星形胶质细胞被激活，GFAP表达上调，存在反应性增生，同时，具有促神经生长、抗凋亡、抗自噬和抗炎作用的mTOR表达上调，提示在SAE早期，激活的星形胶质细胞可能对中枢神经系统具有保护作用。
尽管糖皮质激素在严重脓毒症/脓毒性休克中的使用已有大量的研究，但是，其安全性和有效性仍存在争论[6-8]。Minneci等[22]Meta分析研究了糖皮质激素治疗严重脓毒症/脓毒性休克的疗效，认为脓毒性休克时氢化可的松5～7 d生理剂量使用可以提高患者的生存率。Levy等[23]通过建立脑膜炎球菌所致脓毒症小鼠模型研究了地塞米松治疗脓毒症的疗效，结果表明，地塞米松可以提高血液中白细胞介素-10的水平，降低肿瘤坏死因子-α水平和血中细菌的负荷，作者认为脓毒症时地塞米松的使用可能会对机体产生有利影响。但是，Atkinson等[24]对糖皮质激素在脓毒性休克中的应用进行了风险分层分析，发现脓毒性休克患者并不能从糖皮质激素使用中获益。Casserly等[25]研究发现糖皮质激素使用可以增加脓毒性休克患者住院病死率。本研究发现，大鼠患SAE时，地塞米松可以抑制其海马区星形胶质细胞的反应性增生，下调mTOR表达，且与脑病未治疗组比较，地塞米松组大鼠神经行为学、脑电图和SEP并未得到改善，反而导致大鼠神经行为学评分降低。上述结果表明，SAE时，早期使用地塞米松可能不利于其脑损伤的修复。
综上所述，SAE大鼠在全身炎症反应时，海马区星形胶质细胞mTOR表达上调，细胞出现反应性增生，从而抵抗大鼠神经损伤，而早期使用地塞米松可以抑制上述反应，不利于SAE脑损伤的修复。因此，建议SAE患者，特别是儿童，不宜早期使用地塞米松。
