引用本文： 吴侗, 周彬, 龙丽, 张晶. 血小板生成素及其抗体与原发性干燥综合征患者血小板减少的相关性研究. 华西医学, 2016, 31(5): 871-874. doi: 10.7507/1002-0179.201600237 复制
原发性干燥综合征（PSS）是一种以外分泌腺淋巴细胞高度浸润的自身免疫性疾病。PSS常常被关注口眼干燥、肾脏受损等症状，随着医学研究的进步，人们对该病的认识逐渐加深，发现其对非外分泌腺组织也可造成严重损害，其中血液系统损害较为常见，发病率约28.7%～71.7%[1-6]。目前针对PSS器官损害的研究不多，对其造成的血液系统损害研究更加缺乏。PSS血液系统损害的常见表现包括血小板减少，可单独出现也可合并贫血和白细胞减少出现，国内任立敏等[7]调查PSS血小板减少发生率约13% ～ 20%。血小板生成素（TPO）是一种主要由肝脏细胞生成的糖蛋白，它通过与造血干/祖细胞和巨核细胞膜表面的其受体（c-mpl）结合，促进巨核细胞成熟分化释放血小板。PSS的发病机制与大量自身免疫抗体生成相关，本研究旨在探讨TPO及其抗体与PSS患者血小板减少之间的相关性和临床意义。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取我院风湿免疫科2013年9月－2014年10月间住院的PSS患者共计102例，均符合2002年PSS国际分类（诊断）标准[8]。其中血小板减少[血小板计数（PLT）＜100×109/L]的PSS患者40例（A组），既往曾有血小板减少现已恢复正常的PSS患者22例（B组），无血小板减少的PSS患者40例（C组），以及同期正常体检的健康志愿者（PLT正常并且无风湿免疫病和血液病病史）40例（D组）。A组男4例，女36例；年龄22 ～ 78岁，平均（55.64±14.98）岁。B组男1例，女21例；年龄24 ～ 76岁，平均（53.75±12.11）岁。C组男3例，女37例；年龄19 ～ 74岁，平均（58.28±16.11）岁。D组男4例，女36例；年龄19 ～ 69岁，平均（50.47±12.76）岁。4组年龄、性别构成差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。
1.2 TPO及其抗体水平检测
采集所有受试者清晨空腹静脉血3 mL，分离血清，−80℃保存。酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清TPO水平，具体步骤按照试剂盒（美国R&D System公司）说明书进行。间接ELISA法测定抗TPO抗体水平，具体步骤为：用重组人TPO（美国R&D System公司）以4 mg/L浓度包被96孔 ELISA板（美国Costar公司），4℃过夜，磷酸盐吐温缓冲液[2% tween，欧蒙医学诊断（中国）有限公司]洗涤后用0.05 g/L小牛血清蛋白（美国Sigma公司）封闭非特异位点，37℃孵育1 h，洗涤后每孔加待测血清（1∶200）100 μL，洗涤后加1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG（北京中杉金桥公司）100 μL/孔，再次洗涤后每孔加入四甲基联苯胺使用液（北京纽朴生物技术有限公司）100 μL，37℃孵育20 min，用2 mol/L稀硫酸终止反应，最后用酶标仪测定450/570 nm吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，以A值大于健康对照平均值2.1倍（源自厂家说明书及统计学截断值确定方法）以上者为阳性。
1.3 临床指标检测
所有PSS患者均测定PLT、红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白A（IgA）、补体C4、抗核抗体（ANA）、抗磷脂抗体（APL）等，其中ANA滴度＞1∶320为ANA阳性。
1.4 统计学方法
运用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料正态分布者用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间进行LSD检验；两组间比较采用t检验；非正态分布者采用非参数检验（Mann-Whitney秩和检验）。计数资料采用χ2检验。相关性分析，正态分布资料使用Pearson检验，非正态分布资料使用Spearman检验和χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 TPO水平
A、B、C、D组血清TPO水平分别为（129.74±17.47）、（330.23±18.07）、（364.19±12.25）、（54.04±10.71）pg/mL，4组组间差异有统计学意义（F=14.483，P＜0.001），其中A、B、C 3组与D组组间差异有统计学意义（P＜0.001），A、B、C组间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.2 抗TPO抗体
PSS患者抗TPO抗体检出率为20.59%（21/102），明显高于正常对照组（0/40）。抗TPO抗体阳性率在A、B、C组分别为17.5%（7/40）、22.72%（5/22）、22.5%（9/40），两两组间比较差异无统计学意义（χ2=0.248，P=0.618；χ2=0.313，P=0.576；χ2＜0.001，P=0.984）。
2.3 TPO水平与临床指标间关系
PSS患者TPO水平明显与C反应蛋白、IgA水平呈正相关，而与补体C4水平呈负相关，而与PLT、ESR、抗磷脂抗体水平以及ANA滴度无相关性。见表 1。
表1
TPO水平与临床指标相关性
2.4 抗TPO抗体与临床指标间关系
比较抗TPO抗体阳性组与阴性组PSS患者PLT、ESR、CRP、IgA、补体C4以及ANA滴度、抗磷脂抗体APL水平等临床指标，结果显示差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
抗TPO抗体与临床指标间关系
3 讨论
TPO是骨髓巨核细胞增殖、成熟和血小板生成调控的主要因子，又称巨核细胞生长发育因子[9]。TPO对血小板生成具有举足轻重的作用，其浓度的增加以及和其配体c-Mpl形成的信号传导通路对血小板生成具有特异性促进作用[10]。目前研究发现系统性红斑狼疮血小板减少患者体内存在抗TPO抗体和抗c-Mpl抗体[11-12]。抗TPO抗体通过与TPO结合直接影响TPO在患者体内浓度和功能作用。Vadhan-Raj等[13]2000年首次报道发现抗TPO抗体，华宝来[14]等在接受TPO治疗的患者血液中发现并且再次证实该抗体与血小板计数减少相关。2002年，Füreder等[15]首次应用酶联免疫法（EIA）检测到系统性红斑狼疮（SLE）患者血清中存在抗TPO抗体，他们提出抗TPO抗体与SLE血小板减少具有相关性。2006年，Ziakas等[16]应用改良后的ELISA再次检测到SLE患者血清中存在抗TPO抗体。2008年，Ziakas等[17]分别将抗TPO抗体阳性和阴性的血清加入巨核细胞后，进行体外培养，结果提示抗TPO抗体阳性组巨核细胞集落生长发育明显受抑制，提示该抗体可能有抑制巨核细胞生长发育的作用。但是在PSS患者中Ziakas等[17]未发现抗TPO抗体是否存在相同的作用。
本研究显示，PSS患者TPO水平明显高于健康对照人群，提示在PSS患者中TPO可能与病情有一定相关性。但同时我们也发现TPO水平在血小板减少和血小板已恢复以及血小板正常的PSS患者间无明显差异，非且与血小板计数不相关，这与我们之前发现TPO浓度明显升高患者血小板计数无显著下降的观点一致[18]。本研究提示PSS患者的TPO浓度与循环中血小板计数不成因果关系，TPO可能受其他细胞因子调控。本研究发现与C反应蛋白和IgA水平具有正相关，而与补体C4水平呈负相关，提示TPO水平可能与炎症因子及病情严重程度呈一定相关性。最近的研究已表明SLE患者的TPO水平不与血栓症和血小板减少相关，而与巨噬细胞炎症蛋白-1α、白细胞介素（IL）-4、IL-6等炎症因子水平相关[19]。本研究显示抗TPO抗体阳性率约20.59%，但其阳性率在PSS血小板减少组、血小板曾减少已恢复组和无血小板减少组无明显差异，同时比较抗TPO抗体阳性组与阴性组PSS患者PLT、ESR、CRP、IgA、补体C4以及ANA滴度、抗磷脂抗体APL水平等临床指标，结果显示差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果提示虽然抗TPO能够中和TPO降低循环中TPO浓度，但此抗体不是PSS血小板减少的重要原因。目前部分研究显示PSS患者血小板减少与骨髓巨核细胞成熟障碍相关[18]，因此TPO/c-Mpl信号传导通路的功能失常可能是PSS血小板减少的致病机制。
综上所述，本研究对PSS相关血小板减少与TPO及其抗体之间相关性进行了初步的探讨，TPO浓度与炎症因子有一些定相关性，而抗TPO抗体可能不是PSS血小板减少的主要发病机制。但样本量较少，同时抗体的检测方法、特异性与TPO浓度的的关系及其作用机制，还有待进一步研究。
原发性干燥综合征（PSS）是一种以外分泌腺淋巴细胞高度浸润的自身免疫性疾病。PSS常常被关注口眼干燥、肾脏受损等症状，随着医学研究的进步，人们对该病的认识逐渐加深，发现其对非外分泌腺组织也可造成严重损害，其中血液系统损害较为常见，发病率约28.7%～71.7%[1-6]。目前针对PSS器官损害的研究不多，对其造成的血液系统损害研究更加缺乏。PSS血液系统损害的常见表现包括血小板减少，可单独出现也可合并贫血和白细胞减少出现，国内任立敏等[7]调查PSS血小板减少发生率约13% ～ 20%。血小板生成素（TPO）是一种主要由肝脏细胞生成的糖蛋白，它通过与造血干/祖细胞和巨核细胞膜表面的其受体（c-mpl）结合，促进巨核细胞成熟分化释放血小板。PSS的发病机制与大量自身免疫抗体生成相关，本研究旨在探讨TPO及其抗体与PSS患者血小板减少之间的相关性和临床意义。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取我院风湿免疫科2013年9月－2014年10月间住院的PSS患者共计102例，均符合2002年PSS国际分类（诊断）标准[8]。其中血小板减少[血小板计数（PLT）＜100×109/L]的PSS患者40例（A组），既往曾有血小板减少现已恢复正常的PSS患者22例（B组），无血小板减少的PSS患者40例（C组），以及同期正常体检的健康志愿者（PLT正常并且无风湿免疫病和血液病病史）40例（D组）。A组男4例，女36例；年龄22 ～ 78岁，平均（55.64±14.98）岁。B组男1例，女21例；年龄24 ～ 76岁，平均（53.75±12.11）岁。C组男3例，女37例；年龄19 ～ 74岁，平均（58.28±16.11）岁。D组男4例，女36例；年龄19 ～ 69岁，平均（50.47±12.76）岁。4组年龄、性别构成差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。
1.2 TPO及其抗体水平检测
采集所有受试者清晨空腹静脉血3 mL，分离血清，−80℃保存。酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清TPO水平，具体步骤按照试剂盒（美国R&D System公司）说明书进行。间接ELISA法测定抗TPO抗体水平，具体步骤为：用重组人TPO（美国R&D System公司）以4 mg/L浓度包被96孔 ELISA板（美国Costar公司），4℃过夜，磷酸盐吐温缓冲液[2% tween，欧蒙医学诊断（中国）有限公司]洗涤后用0.05 g/L小牛血清蛋白（美国Sigma公司）封闭非特异位点，37℃孵育1 h，洗涤后每孔加待测血清（1∶200）100 μL，洗涤后加1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG（北京中杉金桥公司）100 μL/孔，再次洗涤后每孔加入四甲基联苯胺使用液（北京纽朴生物技术有限公司）100 μL，37℃孵育20 min，用2 mol/L稀硫酸终止反应，最后用酶标仪测定450/570 nm吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，以A值大于健康对照平均值2.1倍（源自厂家说明书及统计学截断值确定方法）以上者为阳性。
1.3 临床指标检测
所有PSS患者均测定PLT、红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白A（IgA）、补体C4、抗核抗体（ANA）、抗磷脂抗体（APL）等，其中ANA滴度＞1∶320为ANA阳性。
1.4 统计学方法
运用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料正态分布者用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间进行LSD检验；两组间比较采用t检验；非正态分布者采用非参数检验（Mann-Whitney秩和检验）。计数资料采用χ2检验。相关性分析，正态分布资料使用Pearson检验，非正态分布资料使用Spearman检验和χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 TPO水平
A、B、C、D组血清TPO水平分别为（129.74±17.47）、（330.23±18.07）、（364.19±12.25）、（54.04±10.71）pg/mL，4组组间差异有统计学意义（F=14.483，P＜0.001），其中A、B、C 3组与D组组间差异有统计学意义（P＜0.001），A、B、C组间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
2.2 抗TPO抗体
PSS患者抗TPO抗体检出率为20.59%（21/102），明显高于正常对照组（0/40）。抗TPO抗体阳性率在A、B、C组分别为17.5%（7/40）、22.72%（5/22）、22.5%（9/40），两两组间比较差异无统计学意义（χ2=0.248，P=0.618；χ2=0.313，P=0.576；χ2＜0.001，P=0.984）。
2.3 TPO水平与临床指标间关系
PSS患者TPO水平明显与C反应蛋白、IgA水平呈正相关，而与补体C4水平呈负相关，而与PLT、ESR、抗磷脂抗体水平以及ANA滴度无相关性。见表 1。
表1
TPO水平与临床指标相关性
2.4 抗TPO抗体与临床指标间关系
比较抗TPO抗体阳性组与阴性组PSS患者PLT、ESR、CRP、IgA、补体C4以及ANA滴度、抗磷脂抗体APL水平等临床指标，结果显示差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
抗TPO抗体与临床指标间关系
3 讨论
TPO是骨髓巨核细胞增殖、成熟和血小板生成调控的主要因子，又称巨核细胞生长发育因子[9]。TPO对血小板生成具有举足轻重的作用，其浓度的增加以及和其配体c-Mpl形成的信号传导通路对血小板生成具有特异性促进作用[10]。目前研究发现系统性红斑狼疮血小板减少患者体内存在抗TPO抗体和抗c-Mpl抗体[11-12]。抗TPO抗体通过与TPO结合直接影响TPO在患者体内浓度和功能作用。Vadhan-Raj等[13]2000年首次报道发现抗TPO抗体，华宝来[14]等在接受TPO治疗的患者血液中发现并且再次证实该抗体与血小板计数减少相关。2002年，Füreder等[15]首次应用酶联免疫法（EIA）检测到系统性红斑狼疮（SLE）患者血清中存在抗TPO抗体，他们提出抗TPO抗体与SLE血小板减少具有相关性。2006年，Ziakas等[16]应用改良后的ELISA再次检测到SLE患者血清中存在抗TPO抗体。2008年，Ziakas等[17]分别将抗TPO抗体阳性和阴性的血清加入巨核细胞后，进行体外培养，结果提示抗TPO抗体阳性组巨核细胞集落生长发育明显受抑制，提示该抗体可能有抑制巨核细胞生长发育的作用。但是在PSS患者中Ziakas等[17]未发现抗TPO抗体是否存在相同的作用。
本研究显示，PSS患者TPO水平明显高于健康对照人群，提示在PSS患者中TPO可能与病情有一定相关性。但同时我们也发现TPO水平在血小板减少和血小板已恢复以及血小板正常的PSS患者间无明显差异，非且与血小板计数不相关，这与我们之前发现TPO浓度明显升高患者血小板计数无显著下降的观点一致[18]。本研究提示PSS患者的TPO浓度与循环中血小板计数不成因果关系，TPO可能受其他细胞因子调控。本研究发现与C反应蛋白和IgA水平具有正相关，而与补体C4水平呈负相关，提示TPO水平可能与炎症因子及病情严重程度呈一定相关性。最近的研究已表明SLE患者的TPO水平不与血栓症和血小板减少相关，而与巨噬细胞炎症蛋白-1α、白细胞介素（IL）-4、IL-6等炎症因子水平相关[19]。本研究显示抗TPO抗体阳性率约20.59%，但其阳性率在PSS血小板减少组、血小板曾减少已恢复组和无血小板减少组无明显差异，同时比较抗TPO抗体阳性组与阴性组PSS患者PLT、ESR、CRP、IgA、补体C4以及ANA滴度、抗磷脂抗体APL水平等临床指标，结果显示差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果提示虽然抗TPO能够中和TPO降低循环中TPO浓度，但此抗体不是PSS血小板减少的重要原因。目前部分研究显示PSS患者血小板减少与骨髓巨核细胞成熟障碍相关[18]，因此TPO/c-Mpl信号传导通路的功能失常可能是PSS血小板减少的致病机制。
综上所述，本研究对PSS相关血小板减少与TPO及其抗体之间相关性进行了初步的探讨，TPO浓度与炎症因子有一些定相关性，而抗TPO抗体可能不是PSS血小板减少的主要发病机制。但样本量较少，同时抗体的检测方法、特异性与TPO浓度的的关系及其作用机制，还有待进一步研究。
