引用本文： 罗翼, 邹昌, 张帅, 周勇, 闵理, 张闻力, 石锐, 段宏, 屠重棋. 注射型可吸收氨基酸聚合物/硫酸钙复合材料动物体内降解吸收及促成骨作用实验研究. 华西医学, 2015, 30(12): 2224-2228. doi: 10.7507/1002-0179.20150639 复制
目前，临床上骨缺损的修复方式主要包括：自体骨移植[1]、同种异体骨移植[2]、金属假体[3]及人工合成生物替代材料[4]等。而在骨填充修复材料方面，绝大多数的材料为固态型，表面欠规则，需切开显露方可填充固定，患者需承受较大的手术创伤和风险，且该种材料不易完全充满整个缺损腔，不能与周围骨组织表面形成紧密接触，因此不能有效地促进骨再生[5]。理想的骨移植替代材料应具有良好的成骨性、骨诱导性、骨传导性、生物相容性和生物可吸收性，临床应用能够提供结构支撑并价格低廉[6]。氨基酸聚合物作为生物医用材料，具有良好的生物相容性和可降解性，广泛应用于药物缓释系统、人工疫苗、基因治疗等方面，但其溶解性差别大且降解周期及速度较难控制，应用受限[7]。硫酸钙早期就已用作填充修复骨缺损，可较快被完全吸收且组织周围组织炎性反应轻，但其降解速度快[8]。早期研发的氨基酸聚合物/硫酸钙（PAA/CS）复合材料降解速度可、生物相容性好，具有良好的机械性能及稳定性[9-10]。
四川大学华西医院骨科和四川国纳科技有限公司在既往研究的基础上，联合开发了一种新型注射性、可吸收生物活性骨修复材料-PAA/CS复合材料，前期的研究已经证实了其在动物体内的安全性及组织相容性[11]。本实验在此基础上，进一步观察该复合材料在动物体内的降解吸收及促成骨作用。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
粉末状PAA/CS复合材料充填剂（硫酸钙含量70%），由四川国纳科技有限公司生产提供。
新西兰大白兔雌雄各半，共48只，由四川大学华西医院实验动物中心提供，体质量2.0～2.5 kg。所有动物实验前在进食、活动方面均良好，皮肤、黏膜无病损，随机分为空白对照组和实验组，每组24只。根据抽取的先后顺序分别对应4个时间点（术后4、8、12、16周），两组每个时间点各6只；所有动物均清洁级分笼饲养。
1.2 方法
1.2.1 手术及围手术期处理
术前1 d将实验兔称体质量后，随机编号，选择左膝或右膝关节上、下各6 cm去毛备皮，洗净后过夜。以耳缘静脉推注10%水合氯醛静脉麻醉（剂量2.5 mL/kg），术区常规消毒、铺巾，严格无菌操作，手术取膝关节外侧髌旁入路，暴露股骨外侧髁。定义股骨远侧干骺端距髌股关节面外侧端和股骨外髁关节面外侧端各0.5 cm处为钻孔点，以直径5 mm钻头自外向内、垂直于股骨长轴钻孔，深度约1 cm，注意保留对侧骨皮质，防止下肢骨折及人工骨外漏，生理盐水冲尽骨屑后拭干。
空白对照组：股骨髁钻孔造缺损后逐层缝合伤口。实验组：粉末状PAA/CS用生理盐水按照1 g︰1 mL混合搅拌均匀后，通过骨水泥注射器经皮穿刺，于骨缺损处注入，充填骨缺损。骨道内人工骨凝固后清除其溢出物，逐层缝合伤口。所有动物术后麻醉苏醒正常，并逐渐恢复进食、饮水，术后3 d内每日肌肉注射青霉素钠40万U/只。
1.2.2 标本的取材和处理
术后4、8、12、16周各时间点，分批处死实验兔取材，取材范围为骨缺损侧下肢，行X线摄片检查后，实验组取缺损骨行组织学检查，染色方法为苏木精-伊红（HE）染色法和马松三色染色（MASSON）。
1.2.3 观察指标
一般情况观察：观察麻醉清醒后兔下肢活动步态、饮食及伤口愈合（Ⅰ/甲级愈合：愈合优良，无不良反应的初期愈合；Ⅱ/乙级愈合：愈合欠佳，愈合处有炎症反应，如红肿、硬结、血肿、积液等但未化脓；Ⅲ/丙级愈合：切口化脓，需切开引流）情况等。X线检查：术后4、8、12、16周行X线摄片，观察人工骨分布显影、新骨形成及材料降解吸收情况。组织学观察：实验组各时间点标本取材后，4%多聚甲醛液固定，制作硬组织矢状位切片，进行HE及MASSON染色，光学显微镜下观察新骨形成、材料降解吸收及材料周围组织反应情况。
2 结果
2.1 大体形态观察
两组动物麻醉清醒后开始负重，所有兔活动和饮食均未见异常，喂养期间未发生死亡，伤口均Ⅰ/甲级愈合。
2.2 影像学观察
X线片透视显示：术后4周，实验组6例骨缺损处与空白组相似，人工骨较周围骨松质密度低，不显影，骨缺损处无明显骨痂生长；空白对照组骨缺损区为低密度影。术后8周，实验组注射人工骨仍不显影，5例骨缺损处孔道较术后4周时已不清晰，原缺损区有高密度影，显示有骨痂生长，周围骨质仍有硬化；实验组1例骨缺损处与空白对照组相似，孔道清晰，仍为缺损影。术后12周，实验组骨缺损区人工骨继续降解，骨痂继续生长，5例骨缺损处仅残留较小低密度区，1例骨缺损处与术后8周时相似；空白对照组骨缺损仍未见明显修复。术后16周，实验组5例骨缺损区人工骨完全降解，新骨长入，恢复正常松质骨密度，1例骨缺损处与术后12周时相似；空白对照组2例骨缺损处与实验组术后8周相似，孔道变小，可见部分修复，剩余4例骨缺损孔道未见明显修复。见图 1。
图1
术后4、8、12、16周两组兔股骨X线片 1a. 空白对照组术后4周 1b. 实验组术后4周 1c. 空白对照组术后8周 1d. 实验组术后8周 1e. 空白对照组术后12周 1f. 实验组术后12周 1g. 空白对照组术后16周 1h. 实验组术后16周 图 2 实验组术后4、8、12、16周硬组织学切片组织学检查 2a. 术后4周（HE ×200） 2b. 术后4周（MASSON ×200） 2c. 术后8周（HE ×200） 2d. 术后8周（MASSON ×200） 2e. 术后12周（HE ×200） 2f. 术后12周（MASSON ×200） 2g. 术后16周（HE ×200） 2h. 术后16周（MASSON ×200）
2.3 不脱钙骨组织学观察
术后4周，在骨与材料界面可见较多胶原纤维生成，材料开始降解，周围有较多炎性细胞浸润，可见异物巨噬细胞，在材料内部可见新生幼稚骨小梁，新生骨小梁周围可见大量排列整齐的成骨细胞。术后8周，在骨缺损内可见继续增多的排列不规则的新生骨小梁，材料继续降解，染色较术后4周变浅，仍有较多炎性细胞浸润。术后12周，骨缺损内材料大部分降解，新生骨小梁进一步增多、密集并增粗，部分区域编织骨开始转化为板层骨，已具有正常骨小梁形态。术后16周，骨缺损内材料基本完全降解，被新生骨替代，大部分新生骨已具有正常骨小梁结构。见图 2。
3 讨论
肿瘤性或创伤性骨缺损、骨折不愈合等都需要植骨填充以促进骨修复或骨愈合，临床对骨移植材料的需求巨大[12]。人工骨材料及骨组织工程支架材料依然是目前生物骨材料研究的重点，由有机高分子聚合物与生物活性无机盐复合而成的双相复合材料，具有与正常骨组织相仿的有机/无机双相复合结构[13]。因具有仿生性能，材料具有良好的生物相容性及生物活性。氨基酸聚合物具有稳定性好、无毒、降解速度可调等诸多优点，可作为许多复合材料的组成部分。硫酸钙来源广泛，具有良好的骨传导性和生物相容性。半水硫酸钙现已有可注射型并获准用于临床[14]，使用前先用水性固化液调和成凝胶状，直接注射于缺损处，5 min左右硬化并转变成二水硫酸钙，尽管该人工骨修复缺损速度明显提高[15]，但其质地较脆，体内抗压、抗扭转等机械强度不足。氨基酸聚合物降解产物为氨基酸、水及其他小分子，对机体无害；在作为组织工程支架时，氨基酸基团能增加材料与组织细胞的亲和性，利于种子细胞与材料黏附，且可调节材料的降解速率[16-17]。本实验利用前期制备的氨基酸硫酸钙复合材料，通过动物实验以评估该种复合材料修复骨缺损的能力，特别是降解吸收特性及成骨能力。
聚合物材料的化学成分、植入位置、植入体形状及降解产物等均可影响其在体内的降解速度。Bell[18]研究发现，将硫酸钙材料埋入犬肌肉组织内，其最长吸收时间为4.7周。而Nilsso等[19]和Turner等[20]也报道纯硫酸钙在机体骨内完全降解吸收约需6周。针对硫酸钙复合材料体内存留时间，Stubbs等[21]认为复合材料埋置机体皮质骨、髓腔及肌肉内的位置不同，降解吸收时间存在差异。本实验所用PAA/CS复合材料，其中硫酸钙所占的比例为70%，该研究发现，无论是将材料埋入肌肉内，还是植入骨内，在兔肌肉内降解时间为6～8周，8周后肌袋内有少量颗粒状材料存在。而X线片结果提示骨内降解时间长于8周，这可能是肌肉内材料不断受到研磨积压从而加速崩解的缘故，骨缺损内机械活动干扰小，因而材料维持时间更长。此外，肌肉组织与骨在细胞及血供方面的差异也可能导致降解速度不一致。本实验复合材料动物体内降解时间都长于单一硫酸钙类材料，说明氨基酸聚合物与硫酸钙的复合起到了减缓硫酸钙降解速度的作用，但这种作用的强弱及其可控性仍需进一步的研究。
骨移植材料修复骨缺损是一个复杂的爬行替代过程，需经历材料的降解吸收、新生血管的长入和新骨形成及改建等过程[22]。目前对骨修复材料植入体内后的存活情况、成骨活性的比较多采用组织学和X线观察，本实验术后4、8、12、16周相应检查结果表明：实验组X线观察和组织学观察基本一致，术后4周，骨缺损内材料周围有无菌性炎症反应存在，可见异物巨噬细胞，材料已开始降解吸收，同时较多胶原纤维及部分新生原始骨小梁长入；术后8周，材料继续降解，骨缺损内新生骨小梁继续增多，在X线片上可显示有骨痂生长；术后12、16周，材料逐渐降解吸收完全，新生骨组织代替材料长入骨缺损内，并且新生骨组织逐渐由编织骨变为成熟的板状骨。在X线片上实验组骨缺损孔道逐渐消失，被新生骨组织填充，而空白对照组大部分骨缺损孔道术后16周仍较清晰。提示本实验所用注射型可吸收PAA/CS复合材料具有较好的生物相容性及良好的成骨活性，对临床骨缺损的修复具有一定的价值。
因此，注射型可吸收PAA/CS复合材料具有良好的体内相容性和生物活性，在体内能够完全降解、吸收，具备一定的成骨能力，有望成为一种具有发展应用前景的新型、自固化可注射骨修复材料。
目前，临床上骨缺损的修复方式主要包括：自体骨移植[1]、同种异体骨移植[2]、金属假体[3]及人工合成生物替代材料[4]等。而在骨填充修复材料方面，绝大多数的材料为固态型，表面欠规则，需切开显露方可填充固定，患者需承受较大的手术创伤和风险，且该种材料不易完全充满整个缺损腔，不能与周围骨组织表面形成紧密接触，因此不能有效地促进骨再生[5]。理想的骨移植替代材料应具有良好的成骨性、骨诱导性、骨传导性、生物相容性和生物可吸收性，临床应用能够提供结构支撑并价格低廉[6]。氨基酸聚合物作为生物医用材料，具有良好的生物相容性和可降解性，广泛应用于药物缓释系统、人工疫苗、基因治疗等方面，但其溶解性差别大且降解周期及速度较难控制，应用受限[7]。硫酸钙早期就已用作填充修复骨缺损，可较快被完全吸收且组织周围组织炎性反应轻，但其降解速度快[8]。早期研发的氨基酸聚合物/硫酸钙（PAA/CS）复合材料降解速度可、生物相容性好，具有良好的机械性能及稳定性[9-10]。
四川大学华西医院骨科和四川国纳科技有限公司在既往研究的基础上，联合开发了一种新型注射性、可吸收生物活性骨修复材料-PAA/CS复合材料，前期的研究已经证实了其在动物体内的安全性及组织相容性[11]。本实验在此基础上，进一步观察该复合材料在动物体内的降解吸收及促成骨作用。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
粉末状PAA/CS复合材料充填剂（硫酸钙含量70%），由四川国纳科技有限公司生产提供。
新西兰大白兔雌雄各半，共48只，由四川大学华西医院实验动物中心提供，体质量2.0～2.5 kg。所有动物实验前在进食、活动方面均良好，皮肤、黏膜无病损，随机分为空白对照组和实验组，每组24只。根据抽取的先后顺序分别对应4个时间点（术后4、8、12、16周），两组每个时间点各6只；所有动物均清洁级分笼饲养。
1.2 方法
1.2.1 手术及围手术期处理
术前1 d将实验兔称体质量后，随机编号，选择左膝或右膝关节上、下各6 cm去毛备皮，洗净后过夜。以耳缘静脉推注10%水合氯醛静脉麻醉（剂量2.5 mL/kg），术区常规消毒、铺巾，严格无菌操作，手术取膝关节外侧髌旁入路，暴露股骨外侧髁。定义股骨远侧干骺端距髌股关节面外侧端和股骨外髁关节面外侧端各0.5 cm处为钻孔点，以直径5 mm钻头自外向内、垂直于股骨长轴钻孔，深度约1 cm，注意保留对侧骨皮质，防止下肢骨折及人工骨外漏，生理盐水冲尽骨屑后拭干。
空白对照组：股骨髁钻孔造缺损后逐层缝合伤口。实验组：粉末状PAA/CS用生理盐水按照1 g︰1 mL混合搅拌均匀后，通过骨水泥注射器经皮穿刺，于骨缺损处注入，充填骨缺损。骨道内人工骨凝固后清除其溢出物，逐层缝合伤口。所有动物术后麻醉苏醒正常，并逐渐恢复进食、饮水，术后3 d内每日肌肉注射青霉素钠40万U/只。
1.2.2 标本的取材和处理
术后4、8、12、16周各时间点，分批处死实验兔取材，取材范围为骨缺损侧下肢，行X线摄片检查后，实验组取缺损骨行组织学检查，染色方法为苏木精-伊红（HE）染色法和马松三色染色（MASSON）。
1.2.3 观察指标
一般情况观察：观察麻醉清醒后兔下肢活动步态、饮食及伤口愈合（Ⅰ/甲级愈合：愈合优良，无不良反应的初期愈合；Ⅱ/乙级愈合：愈合欠佳，愈合处有炎症反应，如红肿、硬结、血肿、积液等但未化脓；Ⅲ/丙级愈合：切口化脓，需切开引流）情况等。X线检查：术后4、8、12、16周行X线摄片，观察人工骨分布显影、新骨形成及材料降解吸收情况。组织学观察：实验组各时间点标本取材后，4%多聚甲醛液固定，制作硬组织矢状位切片，进行HE及MASSON染色，光学显微镜下观察新骨形成、材料降解吸收及材料周围组织反应情况。
2 结果
2.1 大体形态观察
两组动物麻醉清醒后开始负重，所有兔活动和饮食均未见异常，喂养期间未发生死亡，伤口均Ⅰ/甲级愈合。
2.2 影像学观察
X线片透视显示：术后4周，实验组6例骨缺损处与空白组相似，人工骨较周围骨松质密度低，不显影，骨缺损处无明显骨痂生长；空白对照组骨缺损区为低密度影。术后8周，实验组注射人工骨仍不显影，5例骨缺损处孔道较术后4周时已不清晰，原缺损区有高密度影，显示有骨痂生长，周围骨质仍有硬化；实验组1例骨缺损处与空白对照组相似，孔道清晰，仍为缺损影。术后12周，实验组骨缺损区人工骨继续降解，骨痂继续生长，5例骨缺损处仅残留较小低密度区，1例骨缺损处与术后8周时相似；空白对照组骨缺损仍未见明显修复。术后16周，实验组5例骨缺损区人工骨完全降解，新骨长入，恢复正常松质骨密度，1例骨缺损处与术后12周时相似；空白对照组2例骨缺损处与实验组术后8周相似，孔道变小，可见部分修复，剩余4例骨缺损孔道未见明显修复。见图 1。
图1
术后4、8、12、16周两组兔股骨X线片 1a. 空白对照组术后4周 1b. 实验组术后4周 1c. 空白对照组术后8周 1d. 实验组术后8周 1e. 空白对照组术后12周 1f. 实验组术后12周 1g. 空白对照组术后16周 1h. 实验组术后16周 图 2 实验组术后4、8、12、16周硬组织学切片组织学检查 2a. 术后4周（HE ×200） 2b. 术后4周（MASSON ×200） 2c. 术后8周（HE ×200） 2d. 术后8周（MASSON ×200） 2e. 术后12周（HE ×200） 2f. 术后12周（MASSON ×200） 2g. 术后16周（HE ×200） 2h. 术后16周（MASSON ×200）
2.3 不脱钙骨组织学观察
术后4周，在骨与材料界面可见较多胶原纤维生成，材料开始降解，周围有较多炎性细胞浸润，可见异物巨噬细胞，在材料内部可见新生幼稚骨小梁，新生骨小梁周围可见大量排列整齐的成骨细胞。术后8周，在骨缺损内可见继续增多的排列不规则的新生骨小梁，材料继续降解，染色较术后4周变浅，仍有较多炎性细胞浸润。术后12周，骨缺损内材料大部分降解，新生骨小梁进一步增多、密集并增粗，部分区域编织骨开始转化为板层骨，已具有正常骨小梁形态。术后16周，骨缺损内材料基本完全降解，被新生骨替代，大部分新生骨已具有正常骨小梁结构。见图 2。
3 讨论
肿瘤性或创伤性骨缺损、骨折不愈合等都需要植骨填充以促进骨修复或骨愈合，临床对骨移植材料的需求巨大[12]。人工骨材料及骨组织工程支架材料依然是目前生物骨材料研究的重点，由有机高分子聚合物与生物活性无机盐复合而成的双相复合材料，具有与正常骨组织相仿的有机/无机双相复合结构[13]。因具有仿生性能，材料具有良好的生物相容性及生物活性。氨基酸聚合物具有稳定性好、无毒、降解速度可调等诸多优点，可作为许多复合材料的组成部分。硫酸钙来源广泛，具有良好的骨传导性和生物相容性。半水硫酸钙现已有可注射型并获准用于临床[14]，使用前先用水性固化液调和成凝胶状，直接注射于缺损处，5 min左右硬化并转变成二水硫酸钙，尽管该人工骨修复缺损速度明显提高[15]，但其质地较脆，体内抗压、抗扭转等机械强度不足。氨基酸聚合物降解产物为氨基酸、水及其他小分子，对机体无害；在作为组织工程支架时，氨基酸基团能增加材料与组织细胞的亲和性，利于种子细胞与材料黏附，且可调节材料的降解速率[16-17]。本实验利用前期制备的氨基酸硫酸钙复合材料，通过动物实验以评估该种复合材料修复骨缺损的能力，特别是降解吸收特性及成骨能力。
聚合物材料的化学成分、植入位置、植入体形状及降解产物等均可影响其在体内的降解速度。Bell[18]研究发现，将硫酸钙材料埋入犬肌肉组织内，其最长吸收时间为4.7周。而Nilsso等[19]和Turner等[20]也报道纯硫酸钙在机体骨内完全降解吸收约需6周。针对硫酸钙复合材料体内存留时间，Stubbs等[21]认为复合材料埋置机体皮质骨、髓腔及肌肉内的位置不同，降解吸收时间存在差异。本实验所用PAA/CS复合材料，其中硫酸钙所占的比例为70%，该研究发现，无论是将材料埋入肌肉内，还是植入骨内，在兔肌肉内降解时间为6～8周，8周后肌袋内有少量颗粒状材料存在。而X线片结果提示骨内降解时间长于8周，这可能是肌肉内材料不断受到研磨积压从而加速崩解的缘故，骨缺损内机械活动干扰小，因而材料维持时间更长。此外，肌肉组织与骨在细胞及血供方面的差异也可能导致降解速度不一致。本实验复合材料动物体内降解时间都长于单一硫酸钙类材料，说明氨基酸聚合物与硫酸钙的复合起到了减缓硫酸钙降解速度的作用，但这种作用的强弱及其可控性仍需进一步的研究。
骨移植材料修复骨缺损是一个复杂的爬行替代过程，需经历材料的降解吸收、新生血管的长入和新骨形成及改建等过程[22]。目前对骨修复材料植入体内后的存活情况、成骨活性的比较多采用组织学和X线观察，本实验术后4、8、12、16周相应检查结果表明：实验组X线观察和组织学观察基本一致，术后4周，骨缺损内材料周围有无菌性炎症反应存在，可见异物巨噬细胞，材料已开始降解吸收，同时较多胶原纤维及部分新生原始骨小梁长入；术后8周，材料继续降解，骨缺损内新生骨小梁继续增多，在X线片上可显示有骨痂生长；术后12、16周，材料逐渐降解吸收完全，新生骨组织代替材料长入骨缺损内，并且新生骨组织逐渐由编织骨变为成熟的板状骨。在X线片上实验组骨缺损孔道逐渐消失，被新生骨组织填充，而空白对照组大部分骨缺损孔道术后16周仍较清晰。提示本实验所用注射型可吸收PAA/CS复合材料具有较好的生物相容性及良好的成骨活性，对临床骨缺损的修复具有一定的价值。
因此，注射型可吸收PAA/CS复合材料具有良好的体内相容性和生物活性，在体内能够完全降解、吸收，具备一定的成骨能力，有望成为一种具有发展应用前景的新型、自固化可注射骨修复材料。
