引用本文： 贺银, 罗朝志. 磷丙泊酚钠后处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及bcl-2/bax蛋白表达的影响. 华西医学, 2014, 29(7): 1242-1247. doi: 10.7507/1002-0179.20140382 复制
磷丙泊酚钠是一种新型镇静催眠药，为脂溶性丙泊酚的水溶性前体药，经静脉注射后，在碱性磷酸酶代谢下产生活性成分丙泊酚，无注射痛，避免了脂溶性丙泊酚长时间输注脂肪乳积聚导致的代谢紊乱。研究发现，丙泊酚对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用可能和调控B淋巴细胞瘤/白血病-2（bcl-2）蛋白、bcl-2相关X蛋白（bax）的表达有关[1-3]。磷丙泊酚钠作为其前体药，具有保护肝脏缺血再灌注损伤的作用[4]，但其保护作用是否与调控bcl-2和bax蛋白表达有关，目前尚无相关报道。因此本研究利用大鼠肝脏缺血再灌注模型，拟通过肝脏缺血再灌注期间bcl-2和bax蛋白的变化来探讨磷丙泊酚钠后处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用及可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康雄性Sprague-Dawley大鼠48 只，体质量200～220 g，随机分4 组，即假手术组（S组）、对照组（C组）、丙泊酚组（P组）、磷丙泊酚钠组（F组）。每组再根据再灌注时间分为2个亚组，再灌注2 h的亚组分别为S2h亚组、C2h亚组、P2h亚组、F2h亚组；再灌注4 h的亚组分别为S4h亚组、C4h亚组、P4h亚组、F4h亚组，每个亚组6只大鼠。S2h、S4h亚组只行腹正中切口暴露肝门而不夹闭肝门，1 h后，持续静脉泵注生理盐水1 mL/h直至实验结束；C2h、C4h亚组缺血1 h，分别再灌注2 h和4 h，再灌注开始即给予生理盐水1 mL/h静脉泵注；P2h、P4h亚组缺血1 h，分别再灌注2 h和4 h，再灌注开始即给予丙泊酚（AstraZeneca，丙泊酚浓度稀释为5 mg/mL） 20 mg/（kg·h）静脉泵注；F2h、F4h亚组缺血1 h，分别再灌注2 h和4 h，再灌注开始即给予磷丙泊酚钠（磷丙泊酚钠浓度为15 mg/mL）60 mg/（kg·h）静脉泵注。
1.2 动物模型制备
实验前禁食12 h，自由饮水，3%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定。大鼠经气管插管行机械通气（呼吸频率70次/min，潮气量7 mL/kg，吸呼比5︰4），左股动脉穿刺置管用于监测有创血压，左股静脉穿刺置管建立静脉通道，用于术中给药和补液。作腹正中切口，暴露肝门，用无创血管钳缓慢钳夹闭供应肝左叶和中叶的门静脉、肝动脉血管分支，建立大鼠肝实质70%缺血模型。保留供应肝右叶、尾叶和乳突叶门静脉分支，防止门静脉及胃肠道淤血。肝脏组织变灰白为缺血成功标志，肝脏表面恢复红润为再灌注成功标志。
1.3 转氨酶测定
各组分别于缺血1 h及再灌注结束后抽取1.5 mL 股动脉血经水平超速离心机离心（3 000 r/min，15 min），取上清液，采用全自动生物化学分析仪BS-120检测谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）。
1.4 肝组织病理检查
取左叶肝组织甲醛固定，石蜡包埋切片后苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察肝组织和细胞形态，点计数法计数坏死肝细胞占总细胞百分比。坏死细胞评价标准：嗜伊红颜色增多、细胞气球样变、细胞裂解、核碎裂、细胞失去形态结构。
1.5 肝组织bcl-2、bax蛋白含量测定
采用二步免疫法检测bcl-2、bax蛋白的表达情况。各组于再灌注结束后处死大鼠，取左叶肝组织块2.0 cm×3.0 cm×0.3 cm，用10%中性甲醛固定后，石蜡包埋切片，按照免疫组织化学试剂盒（abcam）说明操作染色。肝细胞细胞质呈棕黄色者为阳性区域，显微镜下每张切片随机选取5个视野拍照，应用image-ProPlus6.0图像分析软件测定所拍照片阳性区域平均吸光度值，以平均吸光度值代表bcl-2和bax蛋白含量。
1.6 统计学方法
应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析或者秩和检验，组内比较采用重复测量方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 各组大鼠血清中ALT和AST的活性变化
缺血1 h后，各组ALT和AST含量差异无统计学意义。再灌注相同时间后，与S2h亚组比较，C2h、P2h和F2h亚组血清中ALT和AST含量增高（P＜0.05），与S4h亚组比较，C4h、P4h和F4h亚组血清中ALT和AST含量增高（P＜0.05）；与C2h亚组比较，P2h和F2h亚组血清中ALT和AST含量都降低（P＜0.05），与C4h亚组比较，P4h和F4h亚组血清中ALT和AST含量都降低（P＜0.05）；P2h与F2h亚组、P4h与F4h亚组比较，血清中ALT和AST含量差异无统计学意义（P＞0.05）。S组、C组、P组和F组各组两亚组间血清中ALT和AST含量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。
表1
各组大鼠血清ALT、AST含量的比较（n=6，2.2 肝组织病理结果
肝组织形态学观察：S组细胞形态正常，极少见细胞变性坏死；C2h亚组可见细胞质空泡化，细胞气球样变，C4h亚组可见区域性凝固性坏死，广泛窦状隙膨胀充血；P2h和F2h亚组可见细胞质空泡化，灶状细胞核固缩，P4h和F4h亚组可见细胞质空泡化，灶状细胞核固缩，充血，细胞边缘模糊。
与S2h亚组比较，C2h、P2h和F2h亚组肝组织损伤明显，坏死数/细胞总数百分比增加（P＜0.05），与S4h亚组比较，C4h、P4h和F4h亚组肝组织损伤明显，坏死数/细胞总数百分比增加（P＜0.05）；与C2h亚组比较，P2h和F2h亚组肝组织损伤减轻，坏死数/细胞总数百分比减少（P＜0.05），与C4h亚组比较，P4h和F4h亚组肝组织损伤减轻，坏死数/细胞总数百分比减少（P＜0.05）；P2h与F2h亚组、P4h与F4h亚组比较坏死数/细胞总数百分比差异无统计学意义（P＞0.05）；C4h比C2h、P4h比P2h和F4h比F2h亚组比较坏死数/细胞总数百分比增加（P＜0.05），S2h与S4h亚组比较坏死数/细胞总数百分比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
各组大鼠肝组织细胞坏死数/细胞总数百分比（2.3 各组大鼠肝组织中bcl-2和bax蛋白含量的变化
与S2h亚组比较，C2h、P2h和F2h亚组bcl-2、bax蛋白含量都增加（P＜0.05），与S4h亚组比较，C4h、P4h和F4h亚组bcl-2、bax蛋白含量都增加（P＜0.05）；与C2h亚组比较，P2h和F2h亚组bcl-2蛋白含量增加（P＜0.05），bax蛋白含量减少（P＜0.05），与C4h亚组比较，P4h和F4h亚组bcl-2蛋白含量增加（P＜0.05），bax蛋白含量减少（P＜0.05）；P2h与F2h亚组、P4h与F4h亚组比较bcl-2、bax蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05）。S2h与S4h、C2h与C4h、P2h与P4h和F2h与F4h亚组比较bcl-2、bax蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 3，图 1、2。
表3
各组大鼠bcl-2和bax蛋白含量的比较（
图1
各亚组肝组织bcl-2蛋白免疫组织化学染色表达情况（二步法×400） 1a. S2h亚组 1b. C2h亚组 1c. P2h亚组 1d. F2h亚组 1e. S4h亚组 1f. C4h亚组 1g. P4h亚组 1h. F4h亚组 图 2 各亚组肝组织bax蛋白免疫组织化学染色表达情况（二步法×400） 2a. S2h亚组 2b. C2h亚组 2c. P2h亚组 2d. F2h亚组 2e. S4h亚组 2f. C4h亚组 2g. P4h亚组 2h. F4h亚组
3 讨论
肝脏缺血再灌注损伤常见于休克后复苏，肝切除和肝移植手术后，可导致肝功能和形态学损害。研究发现，对肝脏进行缺血后处理和药物后处理可减轻肝脏缺血再灌注损伤[5]。后处理作为一种补救措施，在器官发生缺血性损伤时，可减轻器官的缺血再灌注损伤，在临床上具有实用性。
研究发现，大鼠肝脏缺血1 h再灌注2 h时肝组织损伤明显，随着再灌注时间的延长，肝组织损伤程度进一步增加[6]。研究表明，持续输注丙泊酚20 mg/（kg·h）可减轻缺血再灌注损伤[7]。本实验参照文献[8]，将丙泊酚转化为等效剂量的磷丙泊酚钠60 mg/（kg·h）进行实验。在预实验中发现再灌注后4 h内，血流动力学的改变较小，为保持再灌注后血压基本一致，减小干扰因素，故本实验选择再灌注2 h和4 h作比较。
肝细胞坏死后，细胞膜破外，释放出ALT和AST。转氨酶水平能够反映肝脏损伤程度，损伤程度越重，转氨酶水平越高。本研究中，与S组比较，C组、P组和F组大鼠ALT和AST活性明显升高，从酶学水平提示缺血再灌注损伤了肝功能。而病理结果显示，C2h亚组可见细胞质空泡化，细胞气球样变，C4h亚组可见区域性凝固性坏死，广泛窦状隙膨胀充血；P2h和F2h亚组可见细胞质空泡化，灶状细胞核固缩，P4h和F4h亚组可见细胞质空泡化，灶状细胞核固缩，充血，细胞边缘模糊，且C组、P组和F组大鼠肝细胞坏死比例明显高于S组，进一步证实存在肝脏损伤。因此，从酶学和病理学两个方面证明该实验模型建立成功。
本研究结果显示：与对照组相同再灌注时间的亚组相比，给予丙泊酚或磷丙泊酚钠后处理后，ALT和AST的值明显降低，肝细胞坏死数量与肝细胞总数所占百分比减少，肝组织损伤程度减轻，说明丙泊酚和磷丙泊酚钠可减轻肝脏缺血再灌注损伤，且bcl-2蛋白含量增加，bax蛋白含量减少，提示这种保护作用可能和调控bcl-2蛋白和bax蛋白的表达有关。而丙泊酚或者磷丙泊酚钠处理组间ALT和AST值、肝细胞坏死数量与肝细胞总数所占百分比及bcl-2和bax蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05），提示丙泊酚和磷丙泊酚钠减轻肝脏缺血再灌注损伤的效果相同。磷丙泊酚钠在体内代谢为丙泊酚发挥药理作用，研究证实它对大鼠肝脏缺血再灌注损伤有保护作用，这种保护作用可能和水解出的丙泊酚的抗氧化机制有关[4]。肝脏缺血再灌注后引起的钙超载，氧自由基释放等可损伤肝细胞膜，最终细胞坏死；抑制细胞对死亡信号的反应通路减少细胞坏死从而产生保护作用是符合逻辑的。细胞坏死途径主要受细胞凋亡途径和核转录因子-κB途径的调控[9]。Bcl-2家族蛋白是重要的凋亡调节蛋白，其中bcl-2蛋白主要位于线粒体外膜，抑制细胞凋亡；bax蛋白位于细胞质，促进凋亡，两者的比例决定了细胞对死亡信号的反应[10]。研究发现，调控bcl-2家族蛋白的表达可以抑制线粒体通透性转换孔开放，阻止线粒体内的某些与凋亡有关的活性物质诱发的凋亡级联反应[11] ；还能抑制肝细胞以及其他类型细胞的坏死，减轻肝脏缺血再灌注损伤[12, 13]。张玮玮等[14]对丙泊酚后处理联合缺血后处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响的研究中也得到相同的结论。
本研究通过比较再灌注4 h与再灌注2 h亚组的结果显示：随着再灌注时间延长至4 h，对照组肝细胞坏死数量与肝细胞总数所占百分比明显增加，说明随着再灌注时间延长，肝脏损伤进一步加重；丙泊酚或者磷丙泊酚钠处理组肝细胞坏死数量与肝细胞总数所占百分比继续增加，提示延长丙泊酚或者磷丙泊酚钠持续输注时间并未能进一步减轻肝脏损伤。肝脏缺血再灌注后早期，由于肝窦内皮细胞肿胀和坏死脱落而阻塞血窦、内皮细胞收缩、微血栓形成及粒细胞的黏附和聚积等作用，引起肝脏微循环障碍，肝脏微循环障碍使得肝窦血流减少甚至消失，这加重了肝脏缺血缺氧[15]。肝脏缺血再灌注后期，中性粒细胞的集聚、大量炎性介质和细胞因子的产生引起炎症反应，形成恶性循环加重肝细胞的损伤[16]，以致肝脏缺血再灌注损伤随着再灌注时间延长而损伤加重[17]。丙泊酚可以直接作用于血管平滑肌，扩张血管，增加血流，改善循环，同时也可以通过抗氧化作用保护肝脏。但它仅阻断了部分引起损伤的通路，并不能完全抑制损伤进一步发展。袁苑等[17]在对丙泊酚对大鼠肠缺血再灌注时肝损伤及bcl-2、bax蛋白表达的影响的研究中发现，随着再灌注时间延长，肝脏损伤程度进一步增加，延长丙泊酚输注时间并未能进一步减轻损伤和增加bcl-2或者减少bax蛋白的表达，与本实验的结果相一致。本研究结果显示，随着再灌注时间的延长，对照组、丙泊酚钠组和磷丙泊酚钠组肝脏损伤程度增加，但这3 组bcl-2蛋白含量未随着再灌注时间的延长而增加，bax蛋白含量未随着再灌注时间的延长而降低，造成这一结果的原因尚不清楚，需要进一步研究。
当血药浓度相同时，磷丙泊酚钠的药效学效能比脂溶性丙泊酚的药效学效能高[18]；它作为水溶性药物，避免了长时间输注脂溶性丙泊酚所致脂肪乳积聚等引起的代谢紊乱和相应并发症，对肝肾功能障碍，合并高脂血症或胰腺炎，需要长期镇静患者，磷丙泊酚钠将更安全，故磷丙泊酚钠在临床上具有较好的使用前景。
综上所述，在肝脏缺血再灌注早期，磷丙泊酚钠后处理能减轻肝脏缺血再灌注损伤，具有保护作用，随着再灌注时间延长，延长磷丙泊酚钠的输注时间并未能进一步减轻损伤；同时磷丙泊酚钠可能是通过上调bcl-2蛋白表达和下调bax蛋白表达来发挥保护作用，但具体调控机制尚不清楚，有待进一步研究。
磷丙泊酚钠是一种新型镇静催眠药，为脂溶性丙泊酚的水溶性前体药，经静脉注射后，在碱性磷酸酶代谢下产生活性成分丙泊酚，无注射痛，避免了脂溶性丙泊酚长时间输注脂肪乳积聚导致的代谢紊乱。研究发现，丙泊酚对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用可能和调控B淋巴细胞瘤/白血病-2（bcl-2）蛋白、bcl-2相关X蛋白（bax）的表达有关[1-3]。磷丙泊酚钠作为其前体药，具有保护肝脏缺血再灌注损伤的作用[4]，但其保护作用是否与调控bcl-2和bax蛋白表达有关，目前尚无相关报道。因此本研究利用大鼠肝脏缺血再灌注模型，拟通过肝脏缺血再灌注期间bcl-2和bax蛋白的变化来探讨磷丙泊酚钠后处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用及可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康雄性Sprague-Dawley大鼠48 只，体质量200～220 g，随机分4 组，即假手术组（S组）、对照组（C组）、丙泊酚组（P组）、磷丙泊酚钠组（F组）。每组再根据再灌注时间分为2个亚组，再灌注2 h的亚组分别为S2h亚组、C2h亚组、P2h亚组、F2h亚组；再灌注4 h的亚组分别为S4h亚组、C4h亚组、P4h亚组、F4h亚组，每个亚组6只大鼠。S2h、S4h亚组只行腹正中切口暴露肝门而不夹闭肝门，1 h后，持续静脉泵注生理盐水1 mL/h直至实验结束；C2h、C4h亚组缺血1 h，分别再灌注2 h和4 h，再灌注开始即给予生理盐水1 mL/h静脉泵注；P2h、P4h亚组缺血1 h，分别再灌注2 h和4 h，再灌注开始即给予丙泊酚（AstraZeneca，丙泊酚浓度稀释为5 mg/mL） 20 mg/（kg·h）静脉泵注；F2h、F4h亚组缺血1 h，分别再灌注2 h和4 h，再灌注开始即给予磷丙泊酚钠（磷丙泊酚钠浓度为15 mg/mL）60 mg/（kg·h）静脉泵注。
1.2 动物模型制备
实验前禁食12 h，自由饮水，3%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定。大鼠经气管插管行机械通气（呼吸频率70次/min，潮气量7 mL/kg，吸呼比5︰4），左股动脉穿刺置管用于监测有创血压，左股静脉穿刺置管建立静脉通道，用于术中给药和补液。作腹正中切口，暴露肝门，用无创血管钳缓慢钳夹闭供应肝左叶和中叶的门静脉、肝动脉血管分支，建立大鼠肝实质70%缺血模型。保留供应肝右叶、尾叶和乳突叶门静脉分支，防止门静脉及胃肠道淤血。肝脏组织变灰白为缺血成功标志，肝脏表面恢复红润为再灌注成功标志。
1.3 转氨酶测定
各组分别于缺血1 h及再灌注结束后抽取1.5 mL 股动脉血经水平超速离心机离心（3 000 r/min，15 min），取上清液，采用全自动生物化学分析仪BS-120检测谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）。
1.4 肝组织病理检查
取左叶肝组织甲醛固定，石蜡包埋切片后苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察肝组织和细胞形态，点计数法计数坏死肝细胞占总细胞百分比。坏死细胞评价标准：嗜伊红颜色增多、细胞气球样变、细胞裂解、核碎裂、细胞失去形态结构。
1.5 肝组织bcl-2、bax蛋白含量测定
采用二步免疫法检测bcl-2、bax蛋白的表达情况。各组于再灌注结束后处死大鼠，取左叶肝组织块2.0 cm×3.0 cm×0.3 cm，用10%中性甲醛固定后，石蜡包埋切片，按照免疫组织化学试剂盒（abcam）说明操作染色。肝细胞细胞质呈棕黄色者为阳性区域，显微镜下每张切片随机选取5个视野拍照，应用image-ProPlus6.0图像分析软件测定所拍照片阳性区域平均吸光度值，以平均吸光度值代表bcl-2和bax蛋白含量。
1.6 统计学方法
应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析或者秩和检验，组内比较采用重复测量方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 各组大鼠血清中ALT和AST的活性变化
缺血1 h后，各组ALT和AST含量差异无统计学意义。再灌注相同时间后，与S2h亚组比较，C2h、P2h和F2h亚组血清中ALT和AST含量增高（P＜0.05），与S4h亚组比较，C4h、P4h和F4h亚组血清中ALT和AST含量增高（P＜0.05）；与C2h亚组比较，P2h和F2h亚组血清中ALT和AST含量都降低（P＜0.05），与C4h亚组比较，P4h和F4h亚组血清中ALT和AST含量都降低（P＜0.05）；P2h与F2h亚组、P4h与F4h亚组比较，血清中ALT和AST含量差异无统计学意义（P＞0.05）。S组、C组、P组和F组各组两亚组间血清中ALT和AST含量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。
表1
各组大鼠血清ALT、AST含量的比较（n=6，2.2 肝组织病理结果
肝组织形态学观察：S组细胞形态正常，极少见细胞变性坏死；C2h亚组可见细胞质空泡化，细胞气球样变，C4h亚组可见区域性凝固性坏死，广泛窦状隙膨胀充血；P2h和F2h亚组可见细胞质空泡化，灶状细胞核固缩，P4h和F4h亚组可见细胞质空泡化，灶状细胞核固缩，充血，细胞边缘模糊。
与S2h亚组比较，C2h、P2h和F2h亚组肝组织损伤明显，坏死数/细胞总数百分比增加（P＜0.05），与S4h亚组比较，C4h、P4h和F4h亚组肝组织损伤明显，坏死数/细胞总数百分比增加（P＜0.05）；与C2h亚组比较，P2h和F2h亚组肝组织损伤减轻，坏死数/细胞总数百分比减少（P＜0.05），与C4h亚组比较，P4h和F4h亚组肝组织损伤减轻，坏死数/细胞总数百分比减少（P＜0.05）；P2h与F2h亚组、P4h与F4h亚组比较坏死数/细胞总数百分比差异无统计学意义（P＞0.05）；C4h比C2h、P4h比P2h和F4h比F2h亚组比较坏死数/细胞总数百分比增加（P＜0.05），S2h与S4h亚组比较坏死数/细胞总数百分比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
各组大鼠肝组织细胞坏死数/细胞总数百分比（2.3 各组大鼠肝组织中bcl-2和bax蛋白含量的变化
与S2h亚组比较，C2h、P2h和F2h亚组bcl-2、bax蛋白含量都增加（P＜0.05），与S4h亚组比较，C4h、P4h和F4h亚组bcl-2、bax蛋白含量都增加（P＜0.05）；与C2h亚组比较，P2h和F2h亚组bcl-2蛋白含量增加（P＜0.05），bax蛋白含量减少（P＜0.05），与C4h亚组比较，P4h和F4h亚组bcl-2蛋白含量增加（P＜0.05），bax蛋白含量减少（P＜0.05）；P2h与F2h亚组、P4h与F4h亚组比较bcl-2、bax蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05）。S2h与S4h、C2h与C4h、P2h与P4h和F2h与F4h亚组比较bcl-2、bax蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 3，图 1、2。
表3
各组大鼠bcl-2和bax蛋白含量的比较（
图1
各亚组肝组织bcl-2蛋白免疫组织化学染色表达情况（二步法×400） 1a. S2h亚组 1b. C2h亚组 1c. P2h亚组 1d. F2h亚组 1e. S4h亚组 1f. C4h亚组 1g. P4h亚组 1h. F4h亚组 图 2 各亚组肝组织bax蛋白免疫组织化学染色表达情况（二步法×400） 2a. S2h亚组 2b. C2h亚组 2c. P2h亚组 2d. F2h亚组 2e. S4h亚组 2f. C4h亚组 2g. P4h亚组 2h. F4h亚组
3 讨论
肝脏缺血再灌注损伤常见于休克后复苏，肝切除和肝移植手术后，可导致肝功能和形态学损害。研究发现，对肝脏进行缺血后处理和药物后处理可减轻肝脏缺血再灌注损伤[5]。后处理作为一种补救措施，在器官发生缺血性损伤时，可减轻器官的缺血再灌注损伤，在临床上具有实用性。
研究发现，大鼠肝脏缺血1 h再灌注2 h时肝组织损伤明显，随着再灌注时间的延长，肝组织损伤程度进一步增加[6]。研究表明，持续输注丙泊酚20 mg/（kg·h）可减轻缺血再灌注损伤[7]。本实验参照文献[8]，将丙泊酚转化为等效剂量的磷丙泊酚钠60 mg/（kg·h）进行实验。在预实验中发现再灌注后4 h内，血流动力学的改变较小，为保持再灌注后血压基本一致，减小干扰因素，故本实验选择再灌注2 h和4 h作比较。
肝细胞坏死后，细胞膜破外，释放出ALT和AST。转氨酶水平能够反映肝脏损伤程度，损伤程度越重，转氨酶水平越高。本研究中，与S组比较，C组、P组和F组大鼠ALT和AST活性明显升高，从酶学水平提示缺血再灌注损伤了肝功能。而病理结果显示，C2h亚组可见细胞质空泡化，细胞气球样变，C4h亚组可见区域性凝固性坏死，广泛窦状隙膨胀充血；P2h和F2h亚组可见细胞质空泡化，灶状细胞核固缩，P4h和F4h亚组可见细胞质空泡化，灶状细胞核固缩，充血，细胞边缘模糊，且C组、P组和F组大鼠肝细胞坏死比例明显高于S组，进一步证实存在肝脏损伤。因此，从酶学和病理学两个方面证明该实验模型建立成功。
本研究结果显示：与对照组相同再灌注时间的亚组相比，给予丙泊酚或磷丙泊酚钠后处理后，ALT和AST的值明显降低，肝细胞坏死数量与肝细胞总数所占百分比减少，肝组织损伤程度减轻，说明丙泊酚和磷丙泊酚钠可减轻肝脏缺血再灌注损伤，且bcl-2蛋白含量增加，bax蛋白含量减少，提示这种保护作用可能和调控bcl-2蛋白和bax蛋白的表达有关。而丙泊酚或者磷丙泊酚钠处理组间ALT和AST值、肝细胞坏死数量与肝细胞总数所占百分比及bcl-2和bax蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05），提示丙泊酚和磷丙泊酚钠减轻肝脏缺血再灌注损伤的效果相同。磷丙泊酚钠在体内代谢为丙泊酚发挥药理作用，研究证实它对大鼠肝脏缺血再灌注损伤有保护作用，这种保护作用可能和水解出的丙泊酚的抗氧化机制有关[4]。肝脏缺血再灌注后引起的钙超载，氧自由基释放等可损伤肝细胞膜，最终细胞坏死；抑制细胞对死亡信号的反应通路减少细胞坏死从而产生保护作用是符合逻辑的。细胞坏死途径主要受细胞凋亡途径和核转录因子-κB途径的调控[9]。Bcl-2家族蛋白是重要的凋亡调节蛋白，其中bcl-2蛋白主要位于线粒体外膜，抑制细胞凋亡；bax蛋白位于细胞质，促进凋亡，两者的比例决定了细胞对死亡信号的反应[10]。研究发现，调控bcl-2家族蛋白的表达可以抑制线粒体通透性转换孔开放，阻止线粒体内的某些与凋亡有关的活性物质诱发的凋亡级联反应[11] ；还能抑制肝细胞以及其他类型细胞的坏死，减轻肝脏缺血再灌注损伤[12, 13]。张玮玮等[14]对丙泊酚后处理联合缺血后处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响的研究中也得到相同的结论。
本研究通过比较再灌注4 h与再灌注2 h亚组的结果显示：随着再灌注时间延长至4 h，对照组肝细胞坏死数量与肝细胞总数所占百分比明显增加，说明随着再灌注时间延长，肝脏损伤进一步加重；丙泊酚或者磷丙泊酚钠处理组肝细胞坏死数量与肝细胞总数所占百分比继续增加，提示延长丙泊酚或者磷丙泊酚钠持续输注时间并未能进一步减轻肝脏损伤。肝脏缺血再灌注后早期，由于肝窦内皮细胞肿胀和坏死脱落而阻塞血窦、内皮细胞收缩、微血栓形成及粒细胞的黏附和聚积等作用，引起肝脏微循环障碍，肝脏微循环障碍使得肝窦血流减少甚至消失，这加重了肝脏缺血缺氧[15]。肝脏缺血再灌注后期，中性粒细胞的集聚、大量炎性介质和细胞因子的产生引起炎症反应，形成恶性循环加重肝细胞的损伤[16]，以致肝脏缺血再灌注损伤随着再灌注时间延长而损伤加重[17]。丙泊酚可以直接作用于血管平滑肌，扩张血管，增加血流，改善循环，同时也可以通过抗氧化作用保护肝脏。但它仅阻断了部分引起损伤的通路，并不能完全抑制损伤进一步发展。袁苑等[17]在对丙泊酚对大鼠肠缺血再灌注时肝损伤及bcl-2、bax蛋白表达的影响的研究中发现，随着再灌注时间延长，肝脏损伤程度进一步增加，延长丙泊酚输注时间并未能进一步减轻损伤和增加bcl-2或者减少bax蛋白的表达，与本实验的结果相一致。本研究结果显示，随着再灌注时间的延长，对照组、丙泊酚钠组和磷丙泊酚钠组肝脏损伤程度增加，但这3 组bcl-2蛋白含量未随着再灌注时间的延长而增加，bax蛋白含量未随着再灌注时间的延长而降低，造成这一结果的原因尚不清楚，需要进一步研究。
当血药浓度相同时，磷丙泊酚钠的药效学效能比脂溶性丙泊酚的药效学效能高[18]；它作为水溶性药物，避免了长时间输注脂溶性丙泊酚所致脂肪乳积聚等引起的代谢紊乱和相应并发症，对肝肾功能障碍，合并高脂血症或胰腺炎，需要长期镇静患者，磷丙泊酚钠将更安全，故磷丙泊酚钠在临床上具有较好的使用前景。
综上所述，在肝脏缺血再灌注早期，磷丙泊酚钠后处理能减轻肝脏缺血再灌注损伤，具有保护作用，随着再灌注时间延长，延长磷丙泊酚钠的输注时间并未能进一步减轻损伤；同时磷丙泊酚钠可能是通过上调bcl-2蛋白表达和下调bax蛋白表达来发挥保护作用，但具体调控机制尚不清楚，有待进一步研究。
