引用本文： 苏云洁, 李熙鸿, 杨欣, 王静, 屈艺. 脓毒症对大鼠海马区caspase-3表达的影响. 华西医学, 2014, 29(6): 1011-1014. doi: 10.7507/1002-0179.20140309 复制
脓毒症脑损伤是全身炎症反应导致的弥漫性脑功能障碍，是儿童重症监护病房常见的危急重症[1]。超过50%的脓毒症患者伴有不同程度的脑损伤[2]。其发病机制可能与氧化应激和炎症反应所致的细胞凋亡有关[3, 4]。caspase家族是细胞凋亡相关蛋白质，其中，caspase-3是细胞凋亡过程中主要的终末剪切酶。目前关于caspase-3蛋白在脓毒症脑损伤发病中的作用并不清楚。因此，本研究探讨了脓毒症脑损伤对大鼠海马区caspase-3蛋白表达的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验对象
80只30日龄健康Wistar雄性大鼠，体质量（110 ±10）g，清洁级，由四川简阳达硕动物科技有限公司提供（蜀ICP备09003144号）。随机分为对照组30只，盲肠结扎穿孔（CLP）组50只。所有大鼠在避强光、避噪音、自由获取饲料和水的环境中饲养。
1.2 主要试剂和仪器
兔抗大鼠caspase-3多抗、小鼠抗大鼠β-actin单抗（美国CST公司），辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），驴抗兔IgG抗体（美国Jackson公司），蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒（美国Millipore公司），封闭用小牛血清白蛋白、胎牛血清、蛋白酶抑制剂Cocktail（瑞士Roche公司）；放射免疫沉淀法裂解液配方：50 mmol/L Tris-HCl（pH值7.4），150 mmol/L NaCl，10 mg/L NP-40，使用前每10毫升裂解液加入10 mg蛋白酶抑制剂Cocktail、水合氯醛（成都科龙化工试剂厂）；BR4i高速冷冻离心机（美国Thermo公司），Varioskan Flash连续波长多功能酶标仪（美国Thermo公司），凝胶成像系统（美国Bio-RAD公司）、震荡切片机（美国Leica公司），激光共聚焦显微成像系统（美国Olympus公司）。
1.3 方法
1.3.1 CLP建立脓毒症模型[5 ]
CLP组：将10%的水合氯醛按照1.0 mL/300 mg腹腔注射于大鼠，待大鼠被麻醉后，用胶布固定于手术台上，聚维酮碘溶液消毒腹部皮肤，沿腹中线行约2 cm的纵向切口，打开腹腔，找到盲肠，将盲肠内容物轻轻挤向远端盲肠，在盲肠根部结扎盲肠，用18GG的穿刺针在盲肠根部从肠系膜侧向肠系膜游离侧穿刺2次，挤出少量粪便至腹腔，回纳盲肠至腹腔，保持切口不被粪便污染，逐层缝合腹壁，术毕，按5 mL/100 g皮下注射林格液抗休克。分别于术后6、12、24 h处死大鼠5只，取脑组织，置于-80℃备用。对照组：同样麻醉之后打开大鼠腹腔，拉出盲肠，但不给予盲肠结扎穿孔，不造成脓毒症模型，其余处理同CLP组。
1.3.2 大鼠神经行为学评价
两组在6、12、24 h各时间点分别另取5只大鼠进行神经行为学检测：包括耳廓反射、角膜反射、翻正反射、甩尾反射和逃避反射。采用张丽娜等[6]脓毒症脑损伤动物模型的鉴定方法，0分为无反射，1分为反射减弱（10 s以内缺乏反射），2分为正常反射，最高评分为10分。
1.3.3 免疫荧光检测caspase-3蛋白在大鼠大脑海马区的表达
两组在术后24 h各取大鼠3只。大鼠经水合氯醛麻醉后置于手术台上，剪开肋骨暴露心脏，经左心室依次灌注生理盐水和4%多聚甲醛，直至大鼠四肢僵直后开颅取脑。用多聚甲醛4℃固定24～48 h，用现配的4%琼脂糖包埋组织，震荡切片。切片经漂洗后用5%的胎牛血清封闭液室温封闭1 h，加兔抗大鼠caspase-3多抗（1︰200），4 ℃冰箱过夜，漂洗5次后加驴抗兔IgG抗体（1︰1 000），室温孵育1 h，漂洗5次后4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核10 min，然后加淬灭剂封片，用倒置荧光显微镜观察。
1.3.4 蛋白质印迹法检测caspase-3的表达
① caspase-3蛋白质的提取：将-80℃的标本取出置于冰上，用镊子捣碎，每个组织加入新配的裂解液1 mL，用移液器吹打并冰上放置30 min后，4 ℃离心，上清液即为蛋白质，取10 μL测蛋白浓度，其余加入sample buffer后放于-80℃冻存备用。② 蛋白质浓度的测定：用双辛丁酸法测定蛋白质浓度[7]。③ 蛋白质印迹法：清洗玻璃板，加已经配制的12%分离胶、5%浓缩胶和蛋白（计算40 μg蛋白所需要的上样量），先用恒压70 V电泳至样品到达分离胶与浓缩胶交界处，换为恒压110 V电泳至溴酚兰跑到分离胶下缘，停止电泳。280 mA转膜1 h，脱脂奶粉配制的5%封闭液封闭1 h，加兔抗大鼠caspase-3（1︰500）、小鼠抗大鼠β-actin（1︰3 000），4℃冰箱过夜，然后，Tris-Hcl的等渗盐缓冲液漂洗3次，加过氧化物酶标记的羊抗鼠、兔IgG（1︰3 000），室温孵育1 h，漂洗后，用增强化学发光法（ECL）化学显色法凝胶成像仪曝光，用Gel-pro凝胶成像分析软件测定条带的整合吸光度值（IDV）。计算caspase-3/β-actin的IDV比值，即为caspase-3相对表达量。
1.4 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。所有数据均进行正态性检验和方差齐性检验。计量资料采用均数±标准差表示，两组间均数比较采用t检验，均为双侧检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠神经行为学评分
大鼠在CLP后出现蜷缩少动、竖毛、寒战等表现。CLP组大鼠各时间点神经行为学评分均明显低于对照组（P＜0.05），从6 h开始随着时间变化，CLP组大鼠的评分逐渐降低，大鼠的整体情况越来越差，见表 1。
表1
对照组和CLP组大鼠神经行为学评分表（n=5，2.2 大鼠大脑海马区caspase-3蛋白的表达
免疫荧光检测结果：caspase-3蛋白在对照组仅微量表达，在CLP后24 h的脓毒症大鼠大脑海马区则明显表达增加，见图 1。蛋白质印迹法检测结果：与对照组比较，CLP组在处理6 h后，caspase-3蛋白的表达即开始升高，24 h表达较高，均明显高于对照组（P＜0.05），见图 2。
图1
术后24 h免疫荧光检测脓毒症大鼠海马区caspase-3蛋白的表达变化（DAPI染色×40） 蓝色为DAPI，绿色为caspase-3蛋白（白箭） 1a. 对照组大鼠 1b. CLP组大鼠
图2
蛋白质印迹法检测脓毒症大鼠大脑海马区caspase-3蛋白的表达 2a. 蛋白质印迹法检测caspase-3蛋白的表达变化 2b. caspase-3蛋白相对表达量，与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01
3 讨论
脓毒症激活全身炎症反应，大量的炎症因子和细胞因子释放入血，如白细胞介素2、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，导致失衡的全身炎症反应[8]，严重者极易发生多器官功能障碍甚至衰竭[9]，其中，脓毒症脑损伤是重症监护病房（ICU）目前最常见的危急重症，是由全身炎症反应引起的弥漫性脑功能障碍。临床表现多样且没有特异性，在ICU的病死率高达49%[10]，而且脓毒症会导致长期的认知损害以及空间学习和记忆能力的下降，这主要与脓毒症导致的海马区的损伤有关[11]，因此引起危急重症专家的关注。
目前的研究认为：脓毒症脑损伤与补体系统的激活、神经递质的紊乱及脑血流障碍有关，氧化应激、全身炎症反应及线粒体功能障碍在其发病中也发挥了极重要的作用[10]。氧化应激及全身炎症反应可通过影响神经元细胞凋亡导致脑损伤，影响海马区功能障碍，引起以上临床症状，但其具体机制目前仍不清楚。
caspase蛋白酶家族在细胞凋亡过程中起到了重要的调控作用，其引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节，通过切割特异性的底物，导致细胞凋亡。经典的caspase细胞凋亡有2条途径，即细胞外途径和细胞内途径，也有人将其称为细胞表面死亡受体（如TNF-α等）途径和线粒体引发途径。caspase-3蛋白是该家族中的关键蛋白酶，参与哺乳动物多种细胞的死亡程序，一旦被激活，就会催化裂解下游一系列的细胞内关键蛋白酶，导致细胞的结构及功能受损[12]。
近年来的研究表明，脓毒症时，肝脏内皮细胞损伤，出现凋亡现象，肝窦内皮细胞中caspase-3蛋白表达增强[13]。在脓毒症导致的肺脏和脾脏损伤中也有类似的发现[14]。此外，利用小干扰RNA技术使caspase-3蛋白的基因沉默可以减少脓毒症休克时血管内皮的损伤[15]。但是，caspase-3蛋白在脓毒症脑损伤中的研究却鲜见报道。
Comim等[16]最近发现，在脓毒症大鼠的海马齿状回存在神经元的凋亡现象，而且caspase-3蛋白在CLP后表达增加。我们在实验也中观察到，对照组大鼠海马区神经元仅微量表达凋亡蛋白酶caspase-3，而CLP组在CLP后6 h caspase-3蛋白的表达即开始升高，24 h表达较高；与对照组相比，大鼠在CLP后出现蜷缩少动、竖毛、寒战等表现，神经行为学评分从CLP 6 h后开始一直降低，表明脓毒症脑损伤使海马区神经元凋亡蛋白酶caspase-3的表达上调。这可能与线粒体功能紊乱导致的氧化应激以及全身炎症反应时TNF-α的表达增加有关[17-20]。
总之，本研究表明，凋亡蛋白酶caspase-3在脓毒症大鼠海马区的表达上调，并在24 h内随时间表达不断增加。但caspase-3蛋白在脓毒症大鼠海马区中的作用及随时间变化的机制尚需进一步的研究。
脓毒症脑损伤是全身炎症反应导致的弥漫性脑功能障碍，是儿童重症监护病房常见的危急重症[1]。超过50%的脓毒症患者伴有不同程度的脑损伤[2]。其发病机制可能与氧化应激和炎症反应所致的细胞凋亡有关[3, 4]。caspase家族是细胞凋亡相关蛋白质，其中，caspase-3是细胞凋亡过程中主要的终末剪切酶。目前关于caspase-3蛋白在脓毒症脑损伤发病中的作用并不清楚。因此，本研究探讨了脓毒症脑损伤对大鼠海马区caspase-3蛋白表达的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验对象
80只30日龄健康Wistar雄性大鼠，体质量（110 ±10）g，清洁级，由四川简阳达硕动物科技有限公司提供（蜀ICP备09003144号）。随机分为对照组30只，盲肠结扎穿孔（CLP）组50只。所有大鼠在避强光、避噪音、自由获取饲料和水的环境中饲养。
1.2 主要试剂和仪器
兔抗大鼠caspase-3多抗、小鼠抗大鼠β-actin单抗（美国CST公司），辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），驴抗兔IgG抗体（美国Jackson公司），蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒（美国Millipore公司），封闭用小牛血清白蛋白、胎牛血清、蛋白酶抑制剂Cocktail（瑞士Roche公司）；放射免疫沉淀法裂解液配方：50 mmol/L Tris-HCl（pH值7.4），150 mmol/L NaCl，10 mg/L NP-40，使用前每10毫升裂解液加入10 mg蛋白酶抑制剂Cocktail、水合氯醛（成都科龙化工试剂厂）；BR4i高速冷冻离心机（美国Thermo公司），Varioskan Flash连续波长多功能酶标仪（美国Thermo公司），凝胶成像系统（美国Bio-RAD公司）、震荡切片机（美国Leica公司），激光共聚焦显微成像系统（美国Olympus公司）。
1.3 方法
1.3.1 CLP建立脓毒症模型[5 ]
CLP组：将10%的水合氯醛按照1.0 mL/300 mg腹腔注射于大鼠，待大鼠被麻醉后，用胶布固定于手术台上，聚维酮碘溶液消毒腹部皮肤，沿腹中线行约2 cm的纵向切口，打开腹腔，找到盲肠，将盲肠内容物轻轻挤向远端盲肠，在盲肠根部结扎盲肠，用18GG的穿刺针在盲肠根部从肠系膜侧向肠系膜游离侧穿刺2次，挤出少量粪便至腹腔，回纳盲肠至腹腔，保持切口不被粪便污染，逐层缝合腹壁，术毕，按5 mL/100 g皮下注射林格液抗休克。分别于术后6、12、24 h处死大鼠5只，取脑组织，置于-80℃备用。对照组：同样麻醉之后打开大鼠腹腔，拉出盲肠，但不给予盲肠结扎穿孔，不造成脓毒症模型，其余处理同CLP组。
1.3.2 大鼠神经行为学评价
两组在6、12、24 h各时间点分别另取5只大鼠进行神经行为学检测：包括耳廓反射、角膜反射、翻正反射、甩尾反射和逃避反射。采用张丽娜等[6]脓毒症脑损伤动物模型的鉴定方法，0分为无反射，1分为反射减弱（10 s以内缺乏反射），2分为正常反射，最高评分为10分。
1.3.3 免疫荧光检测caspase-3蛋白在大鼠大脑海马区的表达
两组在术后24 h各取大鼠3只。大鼠经水合氯醛麻醉后置于手术台上，剪开肋骨暴露心脏，经左心室依次灌注生理盐水和4%多聚甲醛，直至大鼠四肢僵直后开颅取脑。用多聚甲醛4℃固定24～48 h，用现配的4%琼脂糖包埋组织，震荡切片。切片经漂洗后用5%的胎牛血清封闭液室温封闭1 h，加兔抗大鼠caspase-3多抗（1︰200），4 ℃冰箱过夜，漂洗5次后加驴抗兔IgG抗体（1︰1 000），室温孵育1 h，漂洗5次后4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核10 min，然后加淬灭剂封片，用倒置荧光显微镜观察。
1.3.4 蛋白质印迹法检测caspase-3的表达
① caspase-3蛋白质的提取：将-80℃的标本取出置于冰上，用镊子捣碎，每个组织加入新配的裂解液1 mL，用移液器吹打并冰上放置30 min后，4 ℃离心，上清液即为蛋白质，取10 μL测蛋白浓度，其余加入sample buffer后放于-80℃冻存备用。② 蛋白质浓度的测定：用双辛丁酸法测定蛋白质浓度[7]。③ 蛋白质印迹法：清洗玻璃板，加已经配制的12%分离胶、5%浓缩胶和蛋白（计算40 μg蛋白所需要的上样量），先用恒压70 V电泳至样品到达分离胶与浓缩胶交界处，换为恒压110 V电泳至溴酚兰跑到分离胶下缘，停止电泳。280 mA转膜1 h，脱脂奶粉配制的5%封闭液封闭1 h，加兔抗大鼠caspase-3（1︰500）、小鼠抗大鼠β-actin（1︰3 000），4℃冰箱过夜，然后，Tris-Hcl的等渗盐缓冲液漂洗3次，加过氧化物酶标记的羊抗鼠、兔IgG（1︰3 000），室温孵育1 h，漂洗后，用增强化学发光法（ECL）化学显色法凝胶成像仪曝光，用Gel-pro凝胶成像分析软件测定条带的整合吸光度值（IDV）。计算caspase-3/β-actin的IDV比值，即为caspase-3相对表达量。
1.4 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。所有数据均进行正态性检验和方差齐性检验。计量资料采用均数±标准差表示，两组间均数比较采用t检验，均为双侧检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠神经行为学评分
大鼠在CLP后出现蜷缩少动、竖毛、寒战等表现。CLP组大鼠各时间点神经行为学评分均明显低于对照组（P＜0.05），从6 h开始随着时间变化，CLP组大鼠的评分逐渐降低，大鼠的整体情况越来越差，见表 1。
表1
对照组和CLP组大鼠神经行为学评分表（n=5，2.2 大鼠大脑海马区caspase-3蛋白的表达
免疫荧光检测结果：caspase-3蛋白在对照组仅微量表达，在CLP后24 h的脓毒症大鼠大脑海马区则明显表达增加，见图 1。蛋白质印迹法检测结果：与对照组比较，CLP组在处理6 h后，caspase-3蛋白的表达即开始升高，24 h表达较高，均明显高于对照组（P＜0.05），见图 2。
图1
术后24 h免疫荧光检测脓毒症大鼠海马区caspase-3蛋白的表达变化（DAPI染色×40） 蓝色为DAPI，绿色为caspase-3蛋白（白箭） 1a. 对照组大鼠 1b. CLP组大鼠
图2
蛋白质印迹法检测脓毒症大鼠大脑海马区caspase-3蛋白的表达 2a. 蛋白质印迹法检测caspase-3蛋白的表达变化 2b. caspase-3蛋白相对表达量，与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01
3 讨论
脓毒症激活全身炎症反应，大量的炎症因子和细胞因子释放入血，如白细胞介素2、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，导致失衡的全身炎症反应[8]，严重者极易发生多器官功能障碍甚至衰竭[9]，其中，脓毒症脑损伤是重症监护病房（ICU）目前最常见的危急重症，是由全身炎症反应引起的弥漫性脑功能障碍。临床表现多样且没有特异性，在ICU的病死率高达49%[10]，而且脓毒症会导致长期的认知损害以及空间学习和记忆能力的下降，这主要与脓毒症导致的海马区的损伤有关[11]，因此引起危急重症专家的关注。
目前的研究认为：脓毒症脑损伤与补体系统的激活、神经递质的紊乱及脑血流障碍有关，氧化应激、全身炎症反应及线粒体功能障碍在其发病中也发挥了极重要的作用[10]。氧化应激及全身炎症反应可通过影响神经元细胞凋亡导致脑损伤，影响海马区功能障碍，引起以上临床症状，但其具体机制目前仍不清楚。
caspase蛋白酶家族在细胞凋亡过程中起到了重要的调控作用，其引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节，通过切割特异性的底物，导致细胞凋亡。经典的caspase细胞凋亡有2条途径，即细胞外途径和细胞内途径，也有人将其称为细胞表面死亡受体（如TNF-α等）途径和线粒体引发途径。caspase-3蛋白是该家族中的关键蛋白酶，参与哺乳动物多种细胞的死亡程序，一旦被激活，就会催化裂解下游一系列的细胞内关键蛋白酶，导致细胞的结构及功能受损[12]。
近年来的研究表明，脓毒症时，肝脏内皮细胞损伤，出现凋亡现象，肝窦内皮细胞中caspase-3蛋白表达增强[13]。在脓毒症导致的肺脏和脾脏损伤中也有类似的发现[14]。此外，利用小干扰RNA技术使caspase-3蛋白的基因沉默可以减少脓毒症休克时血管内皮的损伤[15]。但是，caspase-3蛋白在脓毒症脑损伤中的研究却鲜见报道。
Comim等[16]最近发现，在脓毒症大鼠的海马齿状回存在神经元的凋亡现象，而且caspase-3蛋白在CLP后表达增加。我们在实验也中观察到，对照组大鼠海马区神经元仅微量表达凋亡蛋白酶caspase-3，而CLP组在CLP后6 h caspase-3蛋白的表达即开始升高，24 h表达较高；与对照组相比，大鼠在CLP后出现蜷缩少动、竖毛、寒战等表现，神经行为学评分从CLP 6 h后开始一直降低，表明脓毒症脑损伤使海马区神经元凋亡蛋白酶caspase-3的表达上调。这可能与线粒体功能紊乱导致的氧化应激以及全身炎症反应时TNF-α的表达增加有关[17-20]。
总之，本研究表明，凋亡蛋白酶caspase-3在脓毒症大鼠海马区的表达上调，并在24 h内随时间表达不断增加。但caspase-3蛋白在脓毒症大鼠海马区中的作用及随时间变化的机制尚需进一步的研究。
