通过回顾近年来国内外采用的组织工程双相支架修复软骨及软骨下骨缺损的文献，比较不同双相支架修复软骨及软骨下骨效果差别，分析其优势及存在的主要问题，并初步探讨软骨修复的合理方式和发展趋势。研究结果表明，以双相支架作为载体材料一体化修复软骨及软骨下骨缺损，较之传统方式以及其他组织工程修复途径有着不可比拟的优越性，而复合理想的种子细胞及合适生长因子后，更能促进修复效果。由此可见，双相支架有利于修复骨软骨缺损，而构建仿生化多相支架是未来研究的趋势。
引用本文： 刘明, 余曦, 黄富国, 岑石强, 项舟. 组织工程双相支架修复关节软骨及软骨下骨缺损研究进展. 华西医学, 2014, 29(4): 783-787. doi: 10.7507/1002-0179.20140238 复制
外伤、炎症、退变等常见疾患均可造成关节软骨缺损，一旦缺损可产生疼痛、关节畸形等明显症状，晚期并发关节功能障碍，已日益成为影响国民健康状况和生活质量的专科问题。单纯软骨组织再生能力非常有限，有研究指出，通常＜2 cm2的缺损面积机体能自身修复[1]，且软骨缺损的同时往往伴有软骨下骨缺损。近来的研究表明其修复和重建对软骨修复的整体效果尤其是远期疗效有重要影响[2]。传统修复方法诸如软骨下骨钻孔术、软骨移植和软骨细胞移植等，存在新生软骨缺乏透明软骨特性、远期临床疗效欠佳等问题[3]，而关节置换则存在假体磨损、腐蚀及松动等问题，且适用人群有限[4]。因此，自从组织工程理念产生伊始，关节软骨的修复重建便成为这一领域研究的焦点与难点。
经过20余年的发展，软骨组织工程在基础研究、临床应用方面都取得了显著进展，其关注的焦点围绕在以下3个方面：① 理想种子细胞的选取；② 三维生物支架的构建；③ 细胞培养及与材料复合的合适环境和条件[5]。随着生物材料、细胞分子生物学的深入研究及再生医学技术的发展，组织工程软骨支架不仅需要为种子细胞提供仿生的三维细胞外基质结构，并具备细胞/分子调控能力，为细胞的黏附、生长、分化提供最近似于体内的微环境[6]。兼具骨相和软骨相修复作用的“双相支架”以及探索一体化修复软骨与软骨下骨缺损的新方法，对于明确骨软骨缺损修复的机制、进一步发现更为有效的修复途径非常有必要。
1 国内外研究现状
1.1 单纯双相支架
理想的组织工程支架应具有良好的生物相容性、表面活性、可塑性及适宜的生物降解性[7]，同时兼具力学强度，尤其在新生组织长入初期能为其提供一定的机械支撑作用十分必要[8]。
双相支架由软骨相和骨相构成。上层软骨相支架主要起临时细胞外基质的作用，为软骨细胞提供附着、增殖、分化和代谢的场所，故应具有良好的生物相容性、可降解吸收性和利于软骨细胞贴壁生长的表面特性；下层骨相材料应在结构及生物力学特性上近似于体内骨组织，并在功能上有利于成骨细胞的黏附、增殖或者种子细胞向成骨方向分化。Holland等[9]使用聚乙二醇富马酸水凝胶制备双层支架修复兔关节软骨缺损，术后4周和14周观察均未发现炎性细胞或关节肿胀，表明水凝胶材料及其降解产物具有良好的生物相容性；术后4周超过60%的支架降解，14周时软骨区由透明软骨填充，软骨细胞排列有序，并伴有大量糖胺多糖，骨区则由小梁骨填充，且未发现骨组织向上长入软骨区域的现象。表明该种水凝胶支架具有生物可降解性，其降解速率可与骨软骨缺损修复速率相匹配，并诱导生理状态下自体修复作用，是一种较适宜双相支架制备的原材料。Getgood等[10]采用胶原-糖胺聚糖（GAG）-磷酸钙制作新型双相支架并建立山羊膝关节骨软骨缺损模型，与传统聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）双相支架进行对比，评估该种新型双相支架诱导的新生组织的形态学、组织学和力学性质。力学测试显示，虽然浸润的新型胶原-GAG-磷酸钙支架硬度较低，且摆放时已出现不可逆的压缩，但12周和26周观察结果都显示两种支架组缺损处硬度均超过80%，说明细胞外基质在新型双相支架内沉积，加强了新型支架的力学性质。作者观察了12周和26周修复情况，发现组织学和形态学结果均显示新型胶原-GAG-磷酸钙双相支架产生的新生组织优于传统PLGA支架。植入26周观察发现，75%的新型胶原-GAG-磷酸钙双相支架出现透明软骨样新生组织，而仅50%的PLGA支架和17%的空白对照组出现透明软骨样组织，说明该种新型支架为软骨的修复提供了优渥的环境。另外，研究还提到胶原-GAG能被蛋白酶、软骨素酶等降解，其降解产物为低聚肽和糖类的片段，是骨软骨中自然存在的物质且对缺损部位无任何影响。因此胶原-GAG可作为骨软骨缺损的修复中软骨修复支架材料。
1.2 细胞-双相支架复合物
利用单纯双相支架修复骨软骨缺损组织的来源为自体成熟细胞或内源性干细胞；修复通过自体组织爬行至支架进行，此种途径面临的主要问题可能是细胞爬行距离不足或爬行受限导致修复时间延长甚至远期效果欠佳[1, 11]。随后有研究尝试将特定种子细胞与双相支架构建复合物修复骨软骨缺损，利用组织工程支架体内或者体外的诱导特性，为种子细胞的生长、分化提供更为优化的微环境[5, 12]。多项研究比较了细胞-支架复合物与单纯支架修复骨软骨缺损的能力，绝大部分发现前者具有更好的效果[11-17]，也有研究发现二者间差异无统计意义[18]。目前运用较多的是自体软骨细胞、间充质干细胞（MSC）以及脂肪源性干细胞（ADSC）。其他来源的干细胞，如骨髓来源祖细胞（BMPC）及滑膜来源干细胞（SDSC），脐带血干细胞（UCSC）和羊水源性干细胞（AFSC）也有相应的报道[16-23]。
自体软骨细胞具有分化程度高、分泌功能旺盛、不引起免疫排斥反应等优点，植入体内后可快速分泌细胞外基质替代软骨缺损[5, 19]。Jiang等[11]使用聚乳酸及PLGA/β-磷酸三钙构制备双相支架，实验组将自体软骨细胞种植在软骨相，植入猪股骨远端负重关节面骨软骨缺损，6个月后软骨相材料完全降解，新生软骨以透明软骨为主，并检测到同质性Ⅱ型胶原和硫酸糖胺多糖表达；而采用单纯支架修复的对照组则以纤维软骨或纤维组织为主要修复组织。表明经过添加成分和有效的构建，PLGA可成为骨软骨双相支架，并具备合适的软骨诱导特性，二组间比较结果也在一定程度上证明了自体内源性软骨细胞难以在生物支架长距离爬行的假说。
MSC具有来源广泛、易获取、增殖能力强、多向分化潜能等优势，是组织工程领域应用最为广泛的一类种子细胞[5, 22, 23]。张华亮等[17]将体外培养扩增的兔MSC种植于壳聚糖/羟基磷灰石双相支架修复其股骨远端关节面缺损，术后12周发现细胞-支架组软骨相被透明软骨修复，软骨细胞规律排列，周围有均一基质填充，骨相则被小梁骨填充，两相的修复组织与周围自体组织整合良好；而单纯支架组缺损处则被少量纤维样组织修复，且有大量炎性细胞。Shao等[18]将聚己内酯（PCL）作为骨相材料、纤维蛋白胶作为软骨相材料构建双相支架，并种植MSC修复兔膝关节骨软骨缺损，取得了类似效果。Ho等[15]较为创新地将MSC-PCL/PCL+磷酸三钙双相支架的表面进一步添加电纺丝PCL-胶原膜作为骨膜替代物，同时植入猪股骨髁间骨软骨缺损模型内，利用电纺丝膜选择性渗透功能及特定的孔径，促进来自滑膜间隙的营养物质的交换，防止种子细胞漏至关节腔，从而预防继发性软骨肥大。植入后6个月，新生软骨中含有少量纤维软骨和大量糖胺多糖，软骨下骨缺损处有新生骨组织长入，且矿化程度较高。上述研究以及其他同类比较研究揭示：在高分子材料基础上加入合适的天然材料或人工材料，可以发挥各种成分的优势，改善支架整体的生物相容性，是制备骨软骨双相支架的一种合理途径，而MSC在不同的诱导环境下既能促进透明软骨再生，也能形成类骨组织，也是一种理想的种子细胞[12, 24]。单纯植入支架更多依赖内源性MSC的自我修复，最终主要形成纤维软骨，而细胞-双相支架复合物的修复模式无疑更接近体内真实的修复过程，为种子细胞的爬行、生长和分化提供了合适的微环境。
ADSC实为间充质干细胞的一种，已经成为骨软骨组织工程学中种子细胞研究的热点。Jurgens等[13]通过建立山羊右膝关节骨软骨缺损模型，针对脂肪源性基质血管成分和脂肪源性干细胞种植的两种支架，分析研究和评估了其安全性、适用性和修复效果。研究以无细胞胶原Ⅰ/Ⅲ支架作为对照组，植入支架1和4个月后分别进行大体标本观察，免疫组织化学等结果测定和分析。支架植入1个月后3组均无不良反应，显微镜下观察3组无明显差异。4个月后发现，细胞种植支架组新生修复组织明显增多，Ⅱ型胶原、透明软骨样物质生成明显增多，且软骨层糖胺聚糖含量更接近宿主组织，缺损部位可见良好成熟的软骨下骨生成。脂肪源性干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，且ADSC来源广泛，获取容易，供体创伤小，易于临床操作等优势，为骨软骨缺损修复重建种子细胞的研究提供了另一种选择。
BMPC可由滑膜中获得，研究发现其具有形成软骨或骨的潜能[14]。Gao等[14]在透明质酸/磷酸三钙双相支架的软骨相接种BMPC，术后14周发现与空白支架组相比，细胞-支架组的新生软骨组织同质性更好，软骨细胞形态也更为典型，与周围软骨整合也更好。另外该研究使用的骨相材料——注射用磷酸三钙无需预先塑形即可填充缺损的任意维度和形状，无疑是可供选择的良好支架材料。
SDSC自我更新能力高，且具有诱导成脂肪、骨及软骨的能力[16]。Pei等[16]利用聚羟基乙酸较好的力学支撑性能、纤维蛋白胶促进细胞的同质分布及促进体外成软骨作用，构建纤维胶+聚羟基乙酸双相支架，将SDSC种植于软骨相中，体外培养1个月后，检测到新生组织中硫酸糖胺多糖及Ⅱ型胶原的表达随时间递增，然后将细胞-支架复合物植入兔膝关节骨软骨缺损处，6个月后缺损被透明样软骨覆盖，显示出SDSC在软骨修复领域有一定的应用前景。
综上所述，骨软骨组织工程种子细胞有多种选择，考虑到自体软骨细胞来源有限，其实际应用受到一定限制，采用自体MSC既避免了免疫排斥反应、简化手术过程，又可以依托双相支架充分发掘其多向分化潜能，较之其他细胞更具应用前景。
1.3 生长因子与双相支架
骨软骨缺损的修复过程当中，除了有能够成骨和成软骨的细胞存在之外，还需要通过特定的细胞素或者生长因子进行调控，因此为进一步模拟人骨缺损修复所需的细胞外基质，创造适合的修复三维环境，研究者提出在双相支架内添加生长因子以调控种子细胞的分化和生长，促进和诱导目标组织的生成。血管内皮生长因子（VEGF）对软骨细胞存活有着重要的意义。Sakata等[25]通过可降解支架研究了骨软骨修复再生过程中VEGF的聚集分布，发现在骨软骨缺损修复过程中，支架植入后成骨部位的VEGF呈持续性表达，而成软骨部位的VEGF表达减弱，空白缺损部位VEGF则均匀分布，但软骨形成明显延迟。
转化生长因子（TGF-β）可调节骨代谢，目前发现有5个亚型[25]。Holland等[9]使用未种植细胞的水凝胶双相支架修复兔骨软骨缺损，术后4周和14周，添加TGF-β1组的标本O’Driscoll法组织学评分明显优于未添加组，提示TGF-β1可促进自体细胞修复骨缺损。Pei等[14]在SDSC-双相支架复合物中添加生长因子“鸡尾酒”[含不同浓度的TGF-β1、成纤维细胞生长因子（FGF）、类胰岛素一号增长因子（IGF-Ⅰ）]，体外三维培养1个月发现，这种生长因子混合液能为SDSC最大程度增殖和成软骨分化提供有效的化学信号，表明了将单一生长因子制成混合物后可发挥互补优势，更好地起到调控与促进作用。
目前针对体内骨软骨缺损修复过程中，各种生长因子的浓度和分布的研究已经成为研究骨软骨缺损修复中的重要组成部分。通过观察、监测和模拟生长因子的浓度和分布，能够提高骨软骨缺损修复的仿生学性质，有效促进成骨化和成软骨化的进程，达到良好的修复效果。
2 优势分析
关节软骨是功能复杂、细胞外基质高度有序排列的无血管组织，加之其有限的内在修复能力，发生病变可致关节退变及骨关节炎[26-28]。已经用于治疗关节软骨损伤的常见外科方法是软骨下骨钻孔术及软骨移植术，旨在刺激损伤部位的愈合反应或使用组织移植物填充损伤[27, 28]。随后的研究表明，手术制造的磨损或钻孔导致的修复组织主要是纤维软骨或纤维样组织[29]，而软骨移植后常会出现软骨内膜骨化，且其来源十分有限，此外，两种手术的长期疗效也非常有限[25, 30]。
组织工程途径修复骨软骨缺损如今已广泛开展。最初的支架以具有单一力学性质的单一材料为主，远期结果显示新生组织常常缺乏正常软骨由浅层向深层的渐进式结构，这便使处于表面的关节软骨缺乏正常的代谢及生物力学支持，后期出现缺损中心区域细胞的退变，致使软骨碎裂、塌陷[31-33]。随着对软骨自身结构特性及其修复机制认识的不断深入，研究者发现单纯依赖软骨-软骨界面微弱的连接，往往难以达到满意的修复效果，于是构建出组织工程双相支架，修复软骨的同时修复重建软骨下骨，以期较好地克服由于生物力学强度不足导致的术后远期关节面出现碎裂、塌陷的问题[8]。支架上层软骨相模拟具有润滑和减震功能的关节软骨，多孔的结构利于细胞的接种和成软骨分化，下层骨相类似于体内松质骨结构，支撑附于其上的软骨并与宿主骨形成良好整合。较之单层支架，双相支架不仅能集合不同类型生物材料的自身优势，并能通过调整两相结构中不同成分的生物降解速率，使得不同修复组织的修复时间相匹配，既不影响新生组织的长入，又可在每个时间段从整体上保证支架和新生组织的力学性能，这一效果也在前述一系列研究中得到了证实。
通过多个使用单纯双相支架修复骨软骨缺损的实验，研究者发现机体自身修复细胞爬行能力和增殖能力有限，以致关节面和缺损区中心往往难以有效修复[12]，为了克服这一难题，开始构建细胞-双相支架复合物，其中以MSC采用最多。事实表明，通过对双相支架合理的构建以及表面改性，便可利用各相不同的生物学特性诱导分化细胞，使得MSC向骨或软骨分化，结果是缩短了修复组织长入和缺损愈合的时间，加强了愈合效果[17, 19, 20]。生长因子的合理使用有利于细胞与支架的复合，并确保种子细胞在适应的微环境下定向分化，且不论是在添加种子细胞或未添加种子细胞的支架中，它们被证明可以促进修复[9, 16]。
3 存在问题及展望
尽管组织工程双相支架修复骨软骨缺损的研究取得了一定进展，但仍存在不少问题有待深入探索：比如许多动物实验选用的模型以年幼及年轻动物或者小型哺乳动物为主，其各项生理参数与人体实际情况差别较大[5, 8]；另外，尽管新生软骨已经出现透明软骨，但与宿主软骨的整合仍不够理想，其机制尚不十分明确[12, 22]；双相支架修复骨软骨缺损的更长期的疗效如何以及生长因子在支架中的作用机制，也需进一步的实验研究阐明[5, 27]。因此，要将组织工程双相支架修复骨软骨损伤的优越性应用于临床实践，造福关节软骨疾病患者，仍有诸多工作尚待完善。
而且，随着仿生学理念不断应用于再生医学领域，中间层组织工程学的概念也逐步成为重要的研究部分。随着双相支架研究的增多和深入，显示出了骨软骨修复中固有的缺陷，主要是软骨与软骨下骨区域结合部形成了一个截然分开的界线，这样容易导致两相间缺乏牢固的生物学锚定，干细胞在两相结合区定向分化不均一，及修复后产生一个较明显的“条带”区等[34-36]。已有诸多研究开始在双相支架的基础上设计多层支架，将软骨与软骨下骨间的结合带设计为一个“中间层”，使其过度更为仿生化[37-39]，未来的研究将进一步设计梯度式支架，更好地模拟体内的真实情况。
关节软骨是一个复杂有序的组织，现有的工程化软骨培养体系中，还不能有效地区分这些精细结构。但可以预见的是，未来软骨修复的发展会愈发重视组织工程学原则，并基于生理学、仿生学及其他生命科学的理念，来设计、构建和恢复关节软骨的功能。因此，通过骨软骨组织工程方法，采用更适宜的生物材料、更理想的种子细胞乃至生长因子，进一步构建仿生化的细胞-双相支架复合物，为细胞的生长、分化提供最近似于体内的微环境，采取合理的手术方式植入关节缺损处，一体化修复软骨及软骨下骨以确保远期效果，将成为今后骨软骨缺损修复研究的发展趋势。
外伤、炎症、退变等常见疾患均可造成关节软骨缺损，一旦缺损可产生疼痛、关节畸形等明显症状，晚期并发关节功能障碍，已日益成为影响国民健康状况和生活质量的专科问题。单纯软骨组织再生能力非常有限，有研究指出，通常＜2 cm2的缺损面积机体能自身修复[1]，且软骨缺损的同时往往伴有软骨下骨缺损。近来的研究表明其修复和重建对软骨修复的整体效果尤其是远期疗效有重要影响[2]。传统修复方法诸如软骨下骨钻孔术、软骨移植和软骨细胞移植等，存在新生软骨缺乏透明软骨特性、远期临床疗效欠佳等问题[3]，而关节置换则存在假体磨损、腐蚀及松动等问题，且适用人群有限[4]。因此，自从组织工程理念产生伊始，关节软骨的修复重建便成为这一领域研究的焦点与难点。
经过20余年的发展，软骨组织工程在基础研究、临床应用方面都取得了显著进展，其关注的焦点围绕在以下3个方面：① 理想种子细胞的选取；② 三维生物支架的构建；③ 细胞培养及与材料复合的合适环境和条件[5]。随着生物材料、细胞分子生物学的深入研究及再生医学技术的发展，组织工程软骨支架不仅需要为种子细胞提供仿生的三维细胞外基质结构，并具备细胞/分子调控能力，为细胞的黏附、生长、分化提供最近似于体内的微环境[6]。兼具骨相和软骨相修复作用的“双相支架”以及探索一体化修复软骨与软骨下骨缺损的新方法，对于明确骨软骨缺损修复的机制、进一步发现更为有效的修复途径非常有必要。
1 国内外研究现状
1.1 单纯双相支架
理想的组织工程支架应具有良好的生物相容性、表面活性、可塑性及适宜的生物降解性[7]，同时兼具力学强度，尤其在新生组织长入初期能为其提供一定的机械支撑作用十分必要[8]。
双相支架由软骨相和骨相构成。上层软骨相支架主要起临时细胞外基质的作用，为软骨细胞提供附着、增殖、分化和代谢的场所，故应具有良好的生物相容性、可降解吸收性和利于软骨细胞贴壁生长的表面特性；下层骨相材料应在结构及生物力学特性上近似于体内骨组织，并在功能上有利于成骨细胞的黏附、增殖或者种子细胞向成骨方向分化。Holland等[9]使用聚乙二醇富马酸水凝胶制备双层支架修复兔关节软骨缺损，术后4周和14周观察均未发现炎性细胞或关节肿胀，表明水凝胶材料及其降解产物具有良好的生物相容性；术后4周超过60%的支架降解，14周时软骨区由透明软骨填充，软骨细胞排列有序，并伴有大量糖胺多糖，骨区则由小梁骨填充，且未发现骨组织向上长入软骨区域的现象。表明该种水凝胶支架具有生物可降解性，其降解速率可与骨软骨缺损修复速率相匹配，并诱导生理状态下自体修复作用，是一种较适宜双相支架制备的原材料。Getgood等[10]采用胶原-糖胺聚糖（GAG）-磷酸钙制作新型双相支架并建立山羊膝关节骨软骨缺损模型，与传统聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）双相支架进行对比，评估该种新型双相支架诱导的新生组织的形态学、组织学和力学性质。力学测试显示，虽然浸润的新型胶原-GAG-磷酸钙支架硬度较低，且摆放时已出现不可逆的压缩，但12周和26周观察结果都显示两种支架组缺损处硬度均超过80%，说明细胞外基质在新型双相支架内沉积，加强了新型支架的力学性质。作者观察了12周和26周修复情况，发现组织学和形态学结果均显示新型胶原-GAG-磷酸钙双相支架产生的新生组织优于传统PLGA支架。植入26周观察发现，75%的新型胶原-GAG-磷酸钙双相支架出现透明软骨样新生组织，而仅50%的PLGA支架和17%的空白对照组出现透明软骨样组织，说明该种新型支架为软骨的修复提供了优渥的环境。另外，研究还提到胶原-GAG能被蛋白酶、软骨素酶等降解，其降解产物为低聚肽和糖类的片段，是骨软骨中自然存在的物质且对缺损部位无任何影响。因此胶原-GAG可作为骨软骨缺损的修复中软骨修复支架材料。
1.2 细胞-双相支架复合物
利用单纯双相支架修复骨软骨缺损组织的来源为自体成熟细胞或内源性干细胞；修复通过自体组织爬行至支架进行，此种途径面临的主要问题可能是细胞爬行距离不足或爬行受限导致修复时间延长甚至远期效果欠佳[1, 11]。随后有研究尝试将特定种子细胞与双相支架构建复合物修复骨软骨缺损，利用组织工程支架体内或者体外的诱导特性，为种子细胞的生长、分化提供更为优化的微环境[5, 12]。多项研究比较了细胞-支架复合物与单纯支架修复骨软骨缺损的能力，绝大部分发现前者具有更好的效果[11-17]，也有研究发现二者间差异无统计意义[18]。目前运用较多的是自体软骨细胞、间充质干细胞（MSC）以及脂肪源性干细胞（ADSC）。其他来源的干细胞，如骨髓来源祖细胞（BMPC）及滑膜来源干细胞（SDSC），脐带血干细胞（UCSC）和羊水源性干细胞（AFSC）也有相应的报道[16-23]。
自体软骨细胞具有分化程度高、分泌功能旺盛、不引起免疫排斥反应等优点，植入体内后可快速分泌细胞外基质替代软骨缺损[5, 19]。Jiang等[11]使用聚乳酸及PLGA/β-磷酸三钙构制备双相支架，实验组将自体软骨细胞种植在软骨相，植入猪股骨远端负重关节面骨软骨缺损，6个月后软骨相材料完全降解，新生软骨以透明软骨为主，并检测到同质性Ⅱ型胶原和硫酸糖胺多糖表达；而采用单纯支架修复的对照组则以纤维软骨或纤维组织为主要修复组织。表明经过添加成分和有效的构建，PLGA可成为骨软骨双相支架，并具备合适的软骨诱导特性，二组间比较结果也在一定程度上证明了自体内源性软骨细胞难以在生物支架长距离爬行的假说。
MSC具有来源广泛、易获取、增殖能力强、多向分化潜能等优势，是组织工程领域应用最为广泛的一类种子细胞[5, 22, 23]。张华亮等[17]将体外培养扩增的兔MSC种植于壳聚糖/羟基磷灰石双相支架修复其股骨远端关节面缺损，术后12周发现细胞-支架组软骨相被透明软骨修复，软骨细胞规律排列，周围有均一基质填充，骨相则被小梁骨填充，两相的修复组织与周围自体组织整合良好；而单纯支架组缺损处则被少量纤维样组织修复，且有大量炎性细胞。Shao等[18]将聚己内酯（PCL）作为骨相材料、纤维蛋白胶作为软骨相材料构建双相支架，并种植MSC修复兔膝关节骨软骨缺损，取得了类似效果。Ho等[15]较为创新地将MSC-PCL/PCL+磷酸三钙双相支架的表面进一步添加电纺丝PCL-胶原膜作为骨膜替代物，同时植入猪股骨髁间骨软骨缺损模型内，利用电纺丝膜选择性渗透功能及特定的孔径，促进来自滑膜间隙的营养物质的交换，防止种子细胞漏至关节腔，从而预防继发性软骨肥大。植入后6个月，新生软骨中含有少量纤维软骨和大量糖胺多糖，软骨下骨缺损处有新生骨组织长入，且矿化程度较高。上述研究以及其他同类比较研究揭示：在高分子材料基础上加入合适的天然材料或人工材料，可以发挥各种成分的优势，改善支架整体的生物相容性，是制备骨软骨双相支架的一种合理途径，而MSC在不同的诱导环境下既能促进透明软骨再生，也能形成类骨组织，也是一种理想的种子细胞[12, 24]。单纯植入支架更多依赖内源性MSC的自我修复，最终主要形成纤维软骨，而细胞-双相支架复合物的修复模式无疑更接近体内真实的修复过程，为种子细胞的爬行、生长和分化提供了合适的微环境。
ADSC实为间充质干细胞的一种，已经成为骨软骨组织工程学中种子细胞研究的热点。Jurgens等[13]通过建立山羊右膝关节骨软骨缺损模型，针对脂肪源性基质血管成分和脂肪源性干细胞种植的两种支架，分析研究和评估了其安全性、适用性和修复效果。研究以无细胞胶原Ⅰ/Ⅲ支架作为对照组，植入支架1和4个月后分别进行大体标本观察，免疫组织化学等结果测定和分析。支架植入1个月后3组均无不良反应，显微镜下观察3组无明显差异。4个月后发现，细胞种植支架组新生修复组织明显增多，Ⅱ型胶原、透明软骨样物质生成明显增多，且软骨层糖胺聚糖含量更接近宿主组织，缺损部位可见良好成熟的软骨下骨生成。脂肪源性干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，且ADSC来源广泛，获取容易，供体创伤小，易于临床操作等优势，为骨软骨缺损修复重建种子细胞的研究提供了另一种选择。
BMPC可由滑膜中获得，研究发现其具有形成软骨或骨的潜能[14]。Gao等[14]在透明质酸/磷酸三钙双相支架的软骨相接种BMPC，术后14周发现与空白支架组相比，细胞-支架组的新生软骨组织同质性更好，软骨细胞形态也更为典型，与周围软骨整合也更好。另外该研究使用的骨相材料——注射用磷酸三钙无需预先塑形即可填充缺损的任意维度和形状，无疑是可供选择的良好支架材料。
SDSC自我更新能力高，且具有诱导成脂肪、骨及软骨的能力[16]。Pei等[16]利用聚羟基乙酸较好的力学支撑性能、纤维蛋白胶促进细胞的同质分布及促进体外成软骨作用，构建纤维胶+聚羟基乙酸双相支架，将SDSC种植于软骨相中，体外培养1个月后，检测到新生组织中硫酸糖胺多糖及Ⅱ型胶原的表达随时间递增，然后将细胞-支架复合物植入兔膝关节骨软骨缺损处，6个月后缺损被透明样软骨覆盖，显示出SDSC在软骨修复领域有一定的应用前景。
综上所述，骨软骨组织工程种子细胞有多种选择，考虑到自体软骨细胞来源有限，其实际应用受到一定限制，采用自体MSC既避免了免疫排斥反应、简化手术过程，又可以依托双相支架充分发掘其多向分化潜能，较之其他细胞更具应用前景。
1.3 生长因子与双相支架
骨软骨缺损的修复过程当中，除了有能够成骨和成软骨的细胞存在之外，还需要通过特定的细胞素或者生长因子进行调控，因此为进一步模拟人骨缺损修复所需的细胞外基质，创造适合的修复三维环境，研究者提出在双相支架内添加生长因子以调控种子细胞的分化和生长，促进和诱导目标组织的生成。血管内皮生长因子（VEGF）对软骨细胞存活有着重要的意义。Sakata等[25]通过可降解支架研究了骨软骨修复再生过程中VEGF的聚集分布，发现在骨软骨缺损修复过程中，支架植入后成骨部位的VEGF呈持续性表达，而成软骨部位的VEGF表达减弱，空白缺损部位VEGF则均匀分布，但软骨形成明显延迟。
转化生长因子（TGF-β）可调节骨代谢，目前发现有5个亚型[25]。Holland等[9]使用未种植细胞的水凝胶双相支架修复兔骨软骨缺损，术后4周和14周，添加TGF-β1组的标本O’Driscoll法组织学评分明显优于未添加组，提示TGF-β1可促进自体细胞修复骨缺损。Pei等[14]在SDSC-双相支架复合物中添加生长因子“鸡尾酒”[含不同浓度的TGF-β1、成纤维细胞生长因子（FGF）、类胰岛素一号增长因子（IGF-Ⅰ）]，体外三维培养1个月发现，这种生长因子混合液能为SDSC最大程度增殖和成软骨分化提供有效的化学信号，表明了将单一生长因子制成混合物后可发挥互补优势，更好地起到调控与促进作用。
目前针对体内骨软骨缺损修复过程中，各种生长因子的浓度和分布的研究已经成为研究骨软骨缺损修复中的重要组成部分。通过观察、监测和模拟生长因子的浓度和分布，能够提高骨软骨缺损修复的仿生学性质，有效促进成骨化和成软骨化的进程，达到良好的修复效果。
2 优势分析
关节软骨是功能复杂、细胞外基质高度有序排列的无血管组织，加之其有限的内在修复能力，发生病变可致关节退变及骨关节炎[26-28]。已经用于治疗关节软骨损伤的常见外科方法是软骨下骨钻孔术及软骨移植术，旨在刺激损伤部位的愈合反应或使用组织移植物填充损伤[27, 28]。随后的研究表明，手术制造的磨损或钻孔导致的修复组织主要是纤维软骨或纤维样组织[29]，而软骨移植后常会出现软骨内膜骨化，且其来源十分有限，此外，两种手术的长期疗效也非常有限[25, 30]。
组织工程途径修复骨软骨缺损如今已广泛开展。最初的支架以具有单一力学性质的单一材料为主，远期结果显示新生组织常常缺乏正常软骨由浅层向深层的渐进式结构，这便使处于表面的关节软骨缺乏正常的代谢及生物力学支持，后期出现缺损中心区域细胞的退变，致使软骨碎裂、塌陷[31-33]。随着对软骨自身结构特性及其修复机制认识的不断深入，研究者发现单纯依赖软骨-软骨界面微弱的连接，往往难以达到满意的修复效果，于是构建出组织工程双相支架，修复软骨的同时修复重建软骨下骨，以期较好地克服由于生物力学强度不足导致的术后远期关节面出现碎裂、塌陷的问题[8]。支架上层软骨相模拟具有润滑和减震功能的关节软骨，多孔的结构利于细胞的接种和成软骨分化，下层骨相类似于体内松质骨结构，支撑附于其上的软骨并与宿主骨形成良好整合。较之单层支架，双相支架不仅能集合不同类型生物材料的自身优势，并能通过调整两相结构中不同成分的生物降解速率，使得不同修复组织的修复时间相匹配，既不影响新生组织的长入，又可在每个时间段从整体上保证支架和新生组织的力学性能，这一效果也在前述一系列研究中得到了证实。
通过多个使用单纯双相支架修复骨软骨缺损的实验，研究者发现机体自身修复细胞爬行能力和增殖能力有限，以致关节面和缺损区中心往往难以有效修复[12]，为了克服这一难题，开始构建细胞-双相支架复合物，其中以MSC采用最多。事实表明，通过对双相支架合理的构建以及表面改性，便可利用各相不同的生物学特性诱导分化细胞，使得MSC向骨或软骨分化，结果是缩短了修复组织长入和缺损愈合的时间，加强了愈合效果[17, 19, 20]。生长因子的合理使用有利于细胞与支架的复合，并确保种子细胞在适应的微环境下定向分化，且不论是在添加种子细胞或未添加种子细胞的支架中，它们被证明可以促进修复[9, 16]。
3 存在问题及展望
尽管组织工程双相支架修复骨软骨缺损的研究取得了一定进展，但仍存在不少问题有待深入探索：比如许多动物实验选用的模型以年幼及年轻动物或者小型哺乳动物为主，其各项生理参数与人体实际情况差别较大[5, 8]；另外，尽管新生软骨已经出现透明软骨，但与宿主软骨的整合仍不够理想，其机制尚不十分明确[12, 22]；双相支架修复骨软骨缺损的更长期的疗效如何以及生长因子在支架中的作用机制，也需进一步的实验研究阐明[5, 27]。因此，要将组织工程双相支架修复骨软骨损伤的优越性应用于临床实践，造福关节软骨疾病患者，仍有诸多工作尚待完善。
而且，随着仿生学理念不断应用于再生医学领域，中间层组织工程学的概念也逐步成为重要的研究部分。随着双相支架研究的增多和深入，显示出了骨软骨修复中固有的缺陷，主要是软骨与软骨下骨区域结合部形成了一个截然分开的界线，这样容易导致两相间缺乏牢固的生物学锚定，干细胞在两相结合区定向分化不均一，及修复后产生一个较明显的“条带”区等[34-36]。已有诸多研究开始在双相支架的基础上设计多层支架，将软骨与软骨下骨间的结合带设计为一个“中间层”，使其过度更为仿生化[37-39]，未来的研究将进一步设计梯度式支架，更好地模拟体内的真实情况。
关节软骨是一个复杂有序的组织，现有的工程化软骨培养体系中，还不能有效地区分这些精细结构。但可以预见的是，未来软骨修复的发展会愈发重视组织工程学原则，并基于生理学、仿生学及其他生命科学的理念，来设计、构建和恢复关节软骨的功能。因此，通过骨软骨组织工程方法，采用更适宜的生物材料、更理想的种子细胞乃至生长因子，进一步构建仿生化的细胞-双相支架复合物，为细胞的生长、分化提供最近似于体内的微环境，采取合理的手术方式植入关节缺损处，一体化修复软骨及软骨下骨以确保远期效果，将成为今后骨软骨缺损修复研究的发展趋势。