引用本文： 冯宁, 高海德, 刘文志, 陈希, 伍晓汀. 胃癌中钙黏附分子启动子甲基化与幽门螺杆菌感染及肿瘤生物学特性的关系. 华西医学, 2014, 29(1): 43-46. doi: 10.7507/1002-0179.20140012 复制
近年肿瘤分子生物学领域的研究表明，原癌基因和（或）抑癌基因遗传学和表观遗传学的异常共同参与了癌症的发生[1, 2]。而DNA的甲基化是表观遗传学改变的一种最主要的形式。有文献报道，抑癌基因启动子的甲基化似乎是导致其失活的主要机制，而这一变化则可能是导致肿瘤发生的直接分子因素[1]。钙黏附分子（CDH1）基因位于染色体16q22.1，编码一种表达于上皮细胞内的嗜同种跨膜细胞黏附蛋白表皮钙黏附分子（E-cadherin）。此种蛋白在建立并维持细胞间连接、细胞极性及组织构架方面起重要作用。CDH1基因被认为在人类肿瘤中是关键的肿瘤浸润抑制基因。E-cadherin蛋白的失活或下调被发现与肿瘤的侵犯和转移潜能有关。近年研究发现，CDH1基因启动子的甲基化是在胃癌中导致这一抑癌基因沉默的最普遍机制[1, 2]。本研究旨在建立甲基化特异性聚合酶链式反应（MS-PCR）法检测胃癌手术标本中的CDH1基因启动子的甲基化情况，分析胃癌人群中CDH1基因启动子的甲基化水平，并探讨CDH1基因在胃癌组织与对照组织中可能的甲基化程度的差异及胃癌中CDH1基因启动子的甲基化程度与肿瘤生物学特性之间的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取大连大学附属中山医院2008年1月－2009年12月不同年龄、性别、病理类型、TNM分期的40例胃癌的肿瘤组织，以40例手术切缘正常黏膜组织作为对照组。设计患者资料采集卡，收集内容包括：住院号、病理号、性别、年龄、组织分型、肿瘤部位、肿瘤大小、TNM分期、分化程度、幽门螺杆菌感染等情况。
1.2 主要试剂
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技北京有限公司，甲基化检测试剂盒（EZ DNA Methylation-Gold Kit）购自美国ZYMO公司，分子标记（фX174-Hae Ⅲ digest DNA Marker）、合成引物及聚合酶链式反应试剂盒（PerfectShotTM Ex Taq）均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.3 引物设计
根据查阅文献所得引物序列，通过比对基因库中CDH1基因启动子序列配对无误，两对引物序列及各自扩增片段长度如下：
甲基化DNA：正向引物：5’GGTGAATTTTTAGT TAATTAGCGGTAC3’，反向引物：5’CATAACTAA CCGAAAACGCCG3’，扩增所得204 bp产物；非甲基化DNA：正向引物：5’GGTAGGTGAATTTTTAGTTAATTAGTGGTA3，反向引物：’5’ACCCATAACTAA CCAAAAACACCA3’，扩增所得211 bp产物。
1.4 实验方法
按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒的说明书对组织的基因组DNA进行提取。按照甲基化检测试剂盒的说明对所得DNA甲基化基因进行转化处理。然后按照PCR反应试剂盒的说明书对目的基因片段进行扩增，每一例标本均分别进行甲基化和非甲基化片段扩增，以正常胃黏膜组织经甲基化基因的转化处理所得DNA作为对照，同时扩增β-actin基因为内参照。取扩增产物10 μL点样于2%的琼脂糖凝胶100 V下电泳20 min至条带跑开。紫外凝胶成像系统下观察目的条带，甲基化扩增结果出现204 bp条带为甲基化阳性条带，非甲基化扩增结果出现211 bp条带为甲基化阴性条带。结果判定标准为：① 甲基化阳性：甲基化特异性引物扩增出相应长度的片段，但非甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片段，则判断该基因启动子区5’CpG岛甲基化阳性；② 甲基化阴性：非甲基化特异性引物扩增出相应长度的片段，但甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片段，则判断该基因启动子区5’CpG岛甲基化阴性。
1.5 统计学方法
统计各例胃癌标本及对照组的甲基化数据建立数据库。采用SPSS 19.0软件进行分析，定性资料以率或构成比表示，组间比较采用χ2检验，P值＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 MS-PCR法检测胃癌细胞中CDH1基因甲基化程度
胃癌组CDH1基因甲基化阳性27例，阳性率67.5%；对照组阳性5例，阳性率12.5%，两组差异有统计学意义（χ2=25.208，P=0.000）。
2.2 胃癌组织CDH1基因甲基化程度与肿瘤生物学特性的关系
胃癌组CDH1基因甲基化阳性率与性别、肿瘤浸润程度、淋巴转移、远处转移无关，与肿瘤分化程度、幽门螺杆菌感染有关，见表 1。
表1
胃癌组织CDH1基因甲基化程度与肿瘤生物学特性的关系[n=40，例（%）]
3 讨论
编码E-cadherin蛋白的CDH1基因是一种抑癌基因，位于染色体16q22.1上，包含2.6 kb的编码序列和16个外显子。成熟的E-cadherin蛋白属于细胞间黏附分子家族，是一种位于细胞表面连接处的同型二聚体，它在保持细胞分化和维持正常上皮组织结构方面起重要作用。在胃癌中存在两种重要的E-cadherin蛋白的下调机制：种系或散发的基因突变以及启动子区域5’CpG岛的甲基化，后者可能引起CDH1基因转录的中止。在胚胎发生中，CpG岛的甲基化存在于处于细胞分化生长过程中的正常组织中。而在几种肿瘤中已经发现引起异常甲基化的甲基转移酶的活性异常，这种现象可以导致异常的CpG岛的甲基化及人类抑制基因的转录沉默。在胃癌中，CDH1启动子区域的异常甲基化可能是在E-cadherin失活中最常见的“二次打击“抑制机制。而幽门螺杆菌感染可能与这种基因沉默机制起协同作用[1-7]。
本研究发现在我国胃癌人群中也存在着与国外的报道类似的CDH1启动子甲基化现象，并发现此现象与胃癌进展密切相关（P＜0.05）。另外，本研究还发现CDH1启动子甲基化现象与肿瘤的较低分化程度及幽门螺杆菌感染存在密切关联（P＜0.05）。但在对CDH1启动子甲基化与肿瘤浸润程度、淋巴结转移及远处转移之间关系的研究中虽未得出明确的统计学关联，但可看到CDH1启动子甲基化有趋势更多地发生在有淋巴转移的患者中，其结果未获得统计学意义的原因可能由于研究的样本数尚不充足，统计效能不足。这亦提示我们在以后的研究中进一步增加纳入研究的样本例数，使结果更具代表性。在对CDH1启动子甲基化与肿瘤远处转移的关联的研究中亦存在上述问题，由于临床上对许多术前即明确发生远处转移的胃癌患者采取放射、化学疗法等保守治疗方法，仅少数患者采取手术治疗或是术中探查获知的远处转移，故疾病治疗模式的限制决定了纳入研究的远处转移的胃癌患者十分有限，最终影响了统计学的真实性。关于本研究的相关结果在国外亦有部分研究报告给予了支持[1, 2, 4, 5]，但关于CDH1启动子甲基化的分子机制及其对肿瘤生物学特性产生影响的机制的研究结论尚存不同程度的差异。
CDH1启动子甲基化导致的E-cadherin基因转录沉默可能在胃癌发展中扮演着重要的角色。Grabiano等[8]对胃癌标本检测中预计有40%和80%的基因甲基化概率。而本研究中所获得的CDH1启动子甲基化率与其他多项研究所得的结果近似[8-10]。Monika等[2]的研究中尚未发现CDH1启动子甲基化与弥漫型胃癌或肠型胃癌的分型具有统计学意义。而有些研究发现CDH1启动子甲基化与弥漫型胃癌有显著关联[8, 9, 11]，而在其他研究者的实验中未获得此种结论[10]。Monika等[2]的研究还得出胃癌中CDH1启动子甲基化与日本Goseki分型有显著关联。而Goseki分型是基于综合两种形态学特征而作出的，即肿瘤腺管的分化程度和细胞质内黏液的量。Goseki分型将胃癌分为4型：Ⅰ型：腺管分化好，细胞质内黏液少；Ⅱ型：腺管分化好，细胞质内黏液多；Ⅲ型：腺管分化差，细胞质内黏液少；Ⅳ型：腺管分化差，细胞质内黏液多[12]。有研究提示CDH1启动子甲基化更多地出现在GosekiⅢ型中（83%），包括含有少量细胞内黏液的低分化肿瘤[9]。而在GosekiⅡ型和Ⅳ型中观察到的CDH1启动子甲基化低发生率的现象可以用细胞质内黏液的保护作用来解释。同样，CDH1启动子甲基化更多地出现在GosekiⅢ型中的现象提示其可能因为黏液少而缺乏相关保护造成的。在Maekita等[13]的研究中发现CDH1启动子甲基化更多地出现在原发性胃癌中，尤其是未分化弥漫型胃癌中，而这种现象可能与E-cadherin表达降低有关。他们的发现印证了之前有关在未分化型胃癌中进行的E-cadherin免疫组织化学检测的结果，之前的发现是E-cadherin表达降低发生在54%～100%的未分化型胃癌中[14]。日本的Oka等[15]对日本胃癌患者的研究中也发现了在85%的未分化型胃癌中有E-cadherin表达降低，而在分化型胃癌中仅有30%的患者存在此种现象。而上述发现与本研究中所得出的结果基本相符，说明在中国胃癌人群中亦存在E-cadherin表达降低的现象，并且其可能与肿瘤的分化和进展有关联。
在未分化弥漫型胃癌中以经典的“二次打击”学说来解释CDH1失活已经被广为接受，这种现象出现在此种胃癌的近半数患者中。CDH1基因的甲基化及E-cadherin表达降低的高发生率与此种组织变异类型的高发生率之间存在密切关联，这强烈提示了E-cadherin表达的失活可能在未分化/弥漫型胃癌的发生和发展中起到关键性的作用[16-18]。Graff等[19]在对CDH1启动子甲基化机制的体外实验研究中发现，在时间依赖性的CDH1基因CpG岛甲基化起始于高密度CpG岛的侧翼部分，并沿细胞通道最终延伸到CpG岛的核心区域。而上述模式可能是由于特异性β1糖蛋白的保护作用使然。近年来出现了在胃癌中人类错配修复基因（hMLH1）启动子甲基化的相关报道[19]。这些现象是在进展期胃癌中发现的，尚未在原位癌及不典型增生组织中发现，提示甲基化可能出现肿瘤发育的较晚的时候。另外，还有研究提示这种甲基化早期是以部分甲基化或单等位基因的形式出现的，只是在后期才发展成双等位基因[19, 20]。
综上所述，本研究采用免疫组织化学方法研究了胃癌的CDH1基因甲基化程度，并回顾性分析了上述改变与肿瘤分化、浸润、淋巴转移及远处转移之间的统计学关联，发现CDH1基因甲基化可能参与了胃癌的发展过程，并且CDH1基因甲基化可能导致了肿瘤分化程度的降低。虽然在实验中发现CDH1基因甲基化更多地出现在有淋巴转移的患者中，但两者之间差异无统计学意义，提示后续的研究可能需要增加相关胃癌手术标本的例数以求获得满意的统计学效能。同时我们还发现CDH1基因甲基化与胃癌患者的幽门螺杆菌感染之间可能存在密切关系，提示幽门螺杆菌感染可能参与了抑癌基因甲基化失活及肿瘤演变的发展过程，而其中涉及的确切细胞信号转导通路等机制需要后续的相关研究进一步揭示。
近年肿瘤分子生物学领域的研究表明，原癌基因和（或）抑癌基因遗传学和表观遗传学的异常共同参与了癌症的发生[1, 2]。而DNA的甲基化是表观遗传学改变的一种最主要的形式。有文献报道，抑癌基因启动子的甲基化似乎是导致其失活的主要机制，而这一变化则可能是导致肿瘤发生的直接分子因素[1]。钙黏附分子（CDH1）基因位于染色体16q22.1，编码一种表达于上皮细胞内的嗜同种跨膜细胞黏附蛋白表皮钙黏附分子（E-cadherin）。此种蛋白在建立并维持细胞间连接、细胞极性及组织构架方面起重要作用。CDH1基因被认为在人类肿瘤中是关键的肿瘤浸润抑制基因。E-cadherin蛋白的失活或下调被发现与肿瘤的侵犯和转移潜能有关。近年研究发现，CDH1基因启动子的甲基化是在胃癌中导致这一抑癌基因沉默的最普遍机制[1, 2]。本研究旨在建立甲基化特异性聚合酶链式反应（MS-PCR）法检测胃癌手术标本中的CDH1基因启动子的甲基化情况，分析胃癌人群中CDH1基因启动子的甲基化水平，并探讨CDH1基因在胃癌组织与对照组织中可能的甲基化程度的差异及胃癌中CDH1基因启动子的甲基化程度与肿瘤生物学特性之间的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取大连大学附属中山医院2008年1月－2009年12月不同年龄、性别、病理类型、TNM分期的40例胃癌的肿瘤组织，以40例手术切缘正常黏膜组织作为对照组。设计患者资料采集卡，收集内容包括：住院号、病理号、性别、年龄、组织分型、肿瘤部位、肿瘤大小、TNM分期、分化程度、幽门螺杆菌感染等情况。
1.2 主要试剂
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技北京有限公司，甲基化检测试剂盒（EZ DNA Methylation-Gold Kit）购自美国ZYMO公司，分子标记（фX174-Hae Ⅲ digest DNA Marker）、合成引物及聚合酶链式反应试剂盒（PerfectShotTM Ex Taq）均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.3 引物设计
根据查阅文献所得引物序列，通过比对基因库中CDH1基因启动子序列配对无误，两对引物序列及各自扩增片段长度如下：
甲基化DNA：正向引物：5’GGTGAATTTTTAGT TAATTAGCGGTAC3’，反向引物：5’CATAACTAA CCGAAAACGCCG3’，扩增所得204 bp产物；非甲基化DNA：正向引物：5’GGTAGGTGAATTTTTAGTTAATTAGTGGTA3，反向引物：’5’ACCCATAACTAA CCAAAAACACCA3’，扩增所得211 bp产物。
1.4 实验方法
按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒的说明书对组织的基因组DNA进行提取。按照甲基化检测试剂盒的说明对所得DNA甲基化基因进行转化处理。然后按照PCR反应试剂盒的说明书对目的基因片段进行扩增，每一例标本均分别进行甲基化和非甲基化片段扩增，以正常胃黏膜组织经甲基化基因的转化处理所得DNA作为对照，同时扩增β-actin基因为内参照。取扩增产物10 μL点样于2%的琼脂糖凝胶100 V下电泳20 min至条带跑开。紫外凝胶成像系统下观察目的条带，甲基化扩增结果出现204 bp条带为甲基化阳性条带，非甲基化扩增结果出现211 bp条带为甲基化阴性条带。结果判定标准为：① 甲基化阳性：甲基化特异性引物扩增出相应长度的片段，但非甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片段，则判断该基因启动子区5’CpG岛甲基化阳性；② 甲基化阴性：非甲基化特异性引物扩增出相应长度的片段，但甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片段，则判断该基因启动子区5’CpG岛甲基化阴性。
1.5 统计学方法
统计各例胃癌标本及对照组的甲基化数据建立数据库。采用SPSS 19.0软件进行分析，定性资料以率或构成比表示，组间比较采用χ2检验，P值＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 MS-PCR法检测胃癌细胞中CDH1基因甲基化程度
胃癌组CDH1基因甲基化阳性27例，阳性率67.5%；对照组阳性5例，阳性率12.5%，两组差异有统计学意义（χ2=25.208，P=0.000）。
2.2 胃癌组织CDH1基因甲基化程度与肿瘤生物学特性的关系
胃癌组CDH1基因甲基化阳性率与性别、肿瘤浸润程度、淋巴转移、远处转移无关，与肿瘤分化程度、幽门螺杆菌感染有关，见表 1。
表1
胃癌组织CDH1基因甲基化程度与肿瘤生物学特性的关系[n=40，例（%）]
3 讨论
编码E-cadherin蛋白的CDH1基因是一种抑癌基因，位于染色体16q22.1上，包含2.6 kb的编码序列和16个外显子。成熟的E-cadherin蛋白属于细胞间黏附分子家族，是一种位于细胞表面连接处的同型二聚体，它在保持细胞分化和维持正常上皮组织结构方面起重要作用。在胃癌中存在两种重要的E-cadherin蛋白的下调机制：种系或散发的基因突变以及启动子区域5’CpG岛的甲基化，后者可能引起CDH1基因转录的中止。在胚胎发生中，CpG岛的甲基化存在于处于细胞分化生长过程中的正常组织中。而在几种肿瘤中已经发现引起异常甲基化的甲基转移酶的活性异常，这种现象可以导致异常的CpG岛的甲基化及人类抑制基因的转录沉默。在胃癌中，CDH1启动子区域的异常甲基化可能是在E-cadherin失活中最常见的“二次打击“抑制机制。而幽门螺杆菌感染可能与这种基因沉默机制起协同作用[1-7]。
本研究发现在我国胃癌人群中也存在着与国外的报道类似的CDH1启动子甲基化现象，并发现此现象与胃癌进展密切相关（P＜0.05）。另外，本研究还发现CDH1启动子甲基化现象与肿瘤的较低分化程度及幽门螺杆菌感染存在密切关联（P＜0.05）。但在对CDH1启动子甲基化与肿瘤浸润程度、淋巴结转移及远处转移之间关系的研究中虽未得出明确的统计学关联，但可看到CDH1启动子甲基化有趋势更多地发生在有淋巴转移的患者中，其结果未获得统计学意义的原因可能由于研究的样本数尚不充足，统计效能不足。这亦提示我们在以后的研究中进一步增加纳入研究的样本例数，使结果更具代表性。在对CDH1启动子甲基化与肿瘤远处转移的关联的研究中亦存在上述问题，由于临床上对许多术前即明确发生远处转移的胃癌患者采取放射、化学疗法等保守治疗方法，仅少数患者采取手术治疗或是术中探查获知的远处转移，故疾病治疗模式的限制决定了纳入研究的远处转移的胃癌患者十分有限，最终影响了统计学的真实性。关于本研究的相关结果在国外亦有部分研究报告给予了支持[1, 2, 4, 5]，但关于CDH1启动子甲基化的分子机制及其对肿瘤生物学特性产生影响的机制的研究结论尚存不同程度的差异。
CDH1启动子甲基化导致的E-cadherin基因转录沉默可能在胃癌发展中扮演着重要的角色。Grabiano等[8]对胃癌标本检测中预计有40%和80%的基因甲基化概率。而本研究中所获得的CDH1启动子甲基化率与其他多项研究所得的结果近似[8-10]。Monika等[2]的研究中尚未发现CDH1启动子甲基化与弥漫型胃癌或肠型胃癌的分型具有统计学意义。而有些研究发现CDH1启动子甲基化与弥漫型胃癌有显著关联[8, 9, 11]，而在其他研究者的实验中未获得此种结论[10]。Monika等[2]的研究还得出胃癌中CDH1启动子甲基化与日本Goseki分型有显著关联。而Goseki分型是基于综合两种形态学特征而作出的，即肿瘤腺管的分化程度和细胞质内黏液的量。Goseki分型将胃癌分为4型：Ⅰ型：腺管分化好，细胞质内黏液少；Ⅱ型：腺管分化好，细胞质内黏液多；Ⅲ型：腺管分化差，细胞质内黏液少；Ⅳ型：腺管分化差，细胞质内黏液多[12]。有研究提示CDH1启动子甲基化更多地出现在GosekiⅢ型中（83%），包括含有少量细胞内黏液的低分化肿瘤[9]。而在GosekiⅡ型和Ⅳ型中观察到的CDH1启动子甲基化低发生率的现象可以用细胞质内黏液的保护作用来解释。同样，CDH1启动子甲基化更多地出现在GosekiⅢ型中的现象提示其可能因为黏液少而缺乏相关保护造成的。在Maekita等[13]的研究中发现CDH1启动子甲基化更多地出现在原发性胃癌中，尤其是未分化弥漫型胃癌中，而这种现象可能与E-cadherin表达降低有关。他们的发现印证了之前有关在未分化型胃癌中进行的E-cadherin免疫组织化学检测的结果，之前的发现是E-cadherin表达降低发生在54%～100%的未分化型胃癌中[14]。日本的Oka等[15]对日本胃癌患者的研究中也发现了在85%的未分化型胃癌中有E-cadherin表达降低，而在分化型胃癌中仅有30%的患者存在此种现象。而上述发现与本研究中所得出的结果基本相符，说明在中国胃癌人群中亦存在E-cadherin表达降低的现象，并且其可能与肿瘤的分化和进展有关联。
在未分化弥漫型胃癌中以经典的“二次打击”学说来解释CDH1失活已经被广为接受，这种现象出现在此种胃癌的近半数患者中。CDH1基因的甲基化及E-cadherin表达降低的高发生率与此种组织变异类型的高发生率之间存在密切关联，这强烈提示了E-cadherin表达的失活可能在未分化/弥漫型胃癌的发生和发展中起到关键性的作用[16-18]。Graff等[19]在对CDH1启动子甲基化机制的体外实验研究中发现，在时间依赖性的CDH1基因CpG岛甲基化起始于高密度CpG岛的侧翼部分，并沿细胞通道最终延伸到CpG岛的核心区域。而上述模式可能是由于特异性β1糖蛋白的保护作用使然。近年来出现了在胃癌中人类错配修复基因（hMLH1）启动子甲基化的相关报道[19]。这些现象是在进展期胃癌中发现的，尚未在原位癌及不典型增生组织中发现，提示甲基化可能出现肿瘤发育的较晚的时候。另外，还有研究提示这种甲基化早期是以部分甲基化或单等位基因的形式出现的，只是在后期才发展成双等位基因[19, 20]。
综上所述，本研究采用免疫组织化学方法研究了胃癌的CDH1基因甲基化程度，并回顾性分析了上述改变与肿瘤分化、浸润、淋巴转移及远处转移之间的统计学关联，发现CDH1基因甲基化可能参与了胃癌的发展过程，并且CDH1基因甲基化可能导致了肿瘤分化程度的降低。虽然在实验中发现CDH1基因甲基化更多地出现在有淋巴转移的患者中，但两者之间差异无统计学意义，提示后续的研究可能需要增加相关胃癌手术标本的例数以求获得满意的统计学效能。同时我们还发现CDH1基因甲基化与胃癌患者的幽门螺杆菌感染之间可能存在密切关系，提示幽门螺杆菌感染可能参与了抑癌基因甲基化失活及肿瘤演变的发展过程，而其中涉及的确切细胞信号转导通路等机制需要后续的相关研究进一步揭示。
