本文旨在探究三氧化二砷（As2O3）对肝癌细胞 HepG2 作用的最佳浓度，以及此浓度 As2O3 对 HepG2 细胞迁移、侵袭和凋亡的影响。本研究采用 CCK-8 法检验 0、1、2、4、8、16、32 μmol/L As2O3 处理后 HepG2 细胞活力，计算半抑制浓度（IC50），并且观察 IC50 浓度 As2O3 作用 12、24、48 h 后 HepG2 细胞形态变化。通过伤口愈合实验和 Transwell 侵袭实验验证 As2O3 对细胞迁移侵袭能力的影响。Western blot 和 qRT-PCR 实验检测 As2O3 对细胞迁移、侵袭及凋亡相关蛋白和基因表达水平的影响。结果显示，与对照组相比，HepG2 细胞活力随 As2O3 处理浓度的升高而降低，呈现剂量依懒性，其 IC50 为 7.3 μmol/L；8 μmol/L As2O3 处理 24 h 后，HepG2 细胞发生明显凋亡，且其迁移和侵袭能力显著降低；此外，细胞中 RhoA、Cdc42、Rac1、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表达水平下调，抑凋亡基因 Bcl-2 的蛋白和 mRNA 表达水平显著下调，而促凋亡基因 Bax、Caspase-3 的蛋白和 mRNA 表达水平显著上调。以上结果说明一定浓度的 As2O3 能够抑制肝癌细胞迁移和侵袭，促进肝癌细胞凋亡。
引用本文： 何佳, 许博闻, 高文博, 苏冠月, 余泓池, 沈阳, 刘肖珩. 三氧化二砷对肝癌细胞HepG2迁移、侵袭和凋亡的影响. 生物医学工程学杂志, 2020, 37(1): 105-111. doi: 10.7507/1001-5515.201907044 复制
引言
原发性肝癌是一种严重威胁人们健康并造成大量死亡的恶性肿瘤，具有发展快、预后差、易复发和病死率高等特点[1-2]。据统计数据显示，在我国，每年有 40 多万人死于肝癌，其病死率仅次于肺癌和胃癌[3-4]。由于肝癌细胞极易发生迁移和侵袭，手术切除、介入治疗、局部消融及肝移植等目前常见的肝癌治疗方法，其治疗效果差且术后易复发[5-6]。因此，抑制肝癌侵袭转移是当前肝癌治疗的主攻方向之一。
肿瘤治疗最大的障碍就是肿瘤细胞容易发生侵袭转移[7]。肿瘤细胞侵袭转移的发生是一个非常复杂的过程，是多基因、多因素、多步骤的生物学行为。在肿瘤细胞发生浸润侵袭的过程中，其胞外基底膜的降解是一个重要环节[8]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一组含 Zn2+的能降解细胞外基质的蛋白酶，在正常组织中，MMPs 表达极少，在损伤和各种癌变组织中变得活跃[9]。研究表明，在多种具有侵袭性和高转移性的肿瘤中都观察到基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表达增高，其通过参与肿瘤黏附、血管侵入等过程促进肿瘤细胞发生侵袭[10]。在肿瘤细胞发生转移的过程中，其细胞骨架的重构发挥重要作用[11]。研究表明，Rho GTPases（Rac1、RhoA、Cdc42）蛋白通过诱导局部肌动蛋白聚集从而分别促进应力纤维、板状伪足和丝状伪足的形成，进而调控细胞的迁移行为[12]。其中，Rac1 促进板状伪足和膜皱褶的形成，给细胞提供一个向前的牵引力；RhoA 主要通过调控细胞尾部应力纤维的形成和黏着斑的解聚，促进细胞收缩从而促进细胞迁移；Cdc42 则与丝状伪足的形成密切相关，进而调控细胞极性和迁移方向[11, 13]。故而抑制金属蛋白酶和 Rho GTPases 能有效降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力，从而能够有效抑制肿瘤细胞的转移，控制肿瘤的进展。
三氧化二砷（As2O3）是一种有效的白血病及其他实体瘤的治疗药物，具有广泛的抗肿瘤效应[14]。有研究表明，As2O3 可以通过改变肿瘤细胞活性氧生成以及抑制肿瘤血管生成等途径诱导肺癌、胃癌、骨肉瘤等肿瘤细胞的凋亡，并抑制乳腺癌、淋巴瘤等肿瘤细胞的增殖[15-17]。肝脏作为有毒物质的代谢场所，亦是As2O3甲基化代谢的主要场所[18]，故而 As2O3 对肝癌是否有抑制作用及其相关的分子机制是一个值得深入探索的问题。已有大量研究表明 As2O3 可促进肝癌细胞凋亡[19]，但鲜少有 As2O3 对肝癌细胞迁移、侵袭及其相关分子机制的研究探索。本文全面探讨了 As2O3 对肝癌 HepG2 细胞迁移、侵袭和凋亡的影响并进一步探索了其可能的分子机制，以期为临床肝癌的治疗和联合用药提供新的更为有效的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
人肝细胞肝癌细胞株 HepG2 购自中科院生物化学与细胞生物学研究所；RPMI 1640 培养基和胰蛋白酶购自美国 Hyclone 公司；胎牛血清购自上海复蒙生物科技有限公司；As2O3 购自美国 Sigma 公司；CCK-8 细胞活性检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒和荧光定量 PCR 试剂盒购自日本 Takara 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒和超敏 ECL 化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所。Cdc42、Rac1、RhoA、MMP-9 和 Caspase-3 兔单克隆抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司；Bcl-2 和 Bax 兔单克隆抗体购自美国 Abcam 公司；GAPDH 鼠单克隆抗体购自北京中杉金桥有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人肝癌细胞株 HepG2 细胞，用 5 mL 含 10% 胎牛血清的 1640 培养基于 37℃、饱和湿度、5% CO2 的恒温细胞培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，取状态良好的对数期细胞进行后续实验。
1.2.2 CCK-8 法检测 As2O3 对 HepG2 半抑制浓度（IC50）
将对数生长期的 HepG2 细胞制成细胞悬液（1 × 106个/mL），以每孔 200 μL 加入 96 孔板中，在 37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养 24 h 后，弃去培养液，每孔分别加入终浓度为 0、1、2、4、8、16、32 μmol/L As2O3 的 1640 完全培养基，并设置阴性对照组和只加培养基的空白对照组，每组设置 6 个平行孔，培养 24 h 后每孔加入 10 μL CCK-8 试剂，震荡 10 min 后于细胞培养箱中继续培养 2 h，酶标仪检测 450 nm 波长处各孔 OD 值，并按以下公式计算 IC50：IC50 =（实验组 − 空白对照组）/（阴性对照组 − 空白对照组）× 100%。根据 IC50 计算所得结果，我们选取 8 μmol/L As2O3 浓度进行后续实验。
1.2.3 As2O3 作用不同时间对细胞形态学影响
以 1 × 106个/孔接种 HepG2 细胞于 6 孔板中，于 37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养 24 h 后，弃去培养液，各孔加入 2 mL 终浓度为 8 μmol/L As2O3 的 1640 完全培养基，分别培养 12、24、48 h 后，置于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化并拍照。
1.2.4 划痕实验检测迁移能力
接种 HepG2 细胞于六孔板中，加入 1640 完全培养基培养，待细胞融合度达 90% 时，对照组换成无血清 1640 培养基，实验组更换成含终浓度为 8 μmol/L As2O3 的无血清 1640 培养基分别培养 24 h。用黄枪尖在单层细胞上划出一个垂直损伤区，PBS 漂洗 3 次，洗掉刮下的细胞，将培养基更换成新鲜无血清 1640 培养基。分别于 0 h 和 48 h 在倒置相差显微镜下观察划痕愈合情况并拍照。
1.2.5 Transwell 检测侵袭能力
取对数生长期 HepG2 细胞饥饿过夜，分别用无血清 1640 培养基和含 As2O3 的无血清 1640 培养基重悬制成单细胞悬液，各取 200 μL 单细胞悬液加入已铺基底膜基质的 Transwell 上室中，下室加入 600 μL 含 10% 胎牛血清的 1640 完全培养基。37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养 24 h 后，取出 Transwell 小室，PBS 漂洗 3 次后，加入 4% 多聚甲醛固定 10 min，用 1% 结晶紫染色 30 min。用棉签轻轻擦去小室内部残留细胞，倒置相差显微镜下拍照，随机选取 5 个视野拍照，计数小室底面细胞个数。实验重复 3 次。
1.2.6 Western blot 检测细迁移、侵袭和凋亡相关蛋白表达
取对数生长期 HepG2 细胞，使用含终浓度为 8 μmol/L As2O3 的完全培养基培养 24 h，PBS 洗 3 次，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的 RIPA 细胞裂解液，收集裂解液并置于冰上 30 min 使其充分裂解，12 000 g 冷冻离心 10 min，吸取上清于干净的 EP 管中。BCA 法测定蛋白质浓度，后加入 Loading buffer 煮沸 8 min 使其充分变性。取等量蛋白（30 μg）加入上样孔，SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质，电泳结束后将蛋白转印到 PVDF 膜上，用 5% 脱脂牛奶封闭 2 h 后孵育一抗，4℃ 过夜。TBST 洗 3 次，室温孵育二抗 2 h，TBST 洗 3 次后 ECL 显色，灰度分析处理并进行统计分析。
1.2.7 qRT-PCR 检测细侵袭和凋亡相关基因表达
取对数生长期 HepG2 细胞，用含终浓度 8 μmol/L As2O3 的完全培养基培养 24 h，PBS 清洗 3 次后，按照试剂盒的操作步骤，提取细胞总 RNA，将其反转录为 cDNA（37℃ 15 min，85℃ 5 s）后完成 PCR 荧光定量（Step 1：95℃ 30 s；Step 2：95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 个循环；Step 3：溶解曲线）。所用引物序列见表 1。
表1
qRT-PCR 所用引物信息
Table1.
Oligonucleotide primers used in qRT-PCR
1.3 统计学处理
实验所有数据以均数 ± 标准差表示，采用 SSPS17.0 和 Graphpad prism 5 软件进行统计学分析，P < 0.05 则认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 As2O3 对 HepG2 细胞 IC50 测定
我们采用 CCK-8 细胞活力实验检测细胞活力变化，结果如图 1 所示。随着 As2O3 浓度升高，细胞活力逐步下降，As2O3 对 HepG2 细胞活力的影响呈现剂量依赖性，其 IC50 为 7.3 μmol/L。根据本实验结果，我们选取 8 μmol/L As2O3 进行后续实验。
图1
As2O3 对 HepG2 细胞活力的影响
Figure1.
Effect of As2O3 on HepG2 cell activity
2.2 As2O3 对 HepG2 细胞凋亡的影响
用含终浓度 8 μmol/L As2O3 的完全培养基分别培养 HepG2 细胞 12、24、48 h 后，采用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。如图 2 所示，随着 As2O3 作用时间的延长，细胞的凋亡程度也逐渐增强，呈现一定的时间依赖性。HepG2 细胞的存活数目与对照组相比明显降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。24 h 时 HepG2 细胞出现显著凋亡；在 48 h 时细胞基本完全凋亡。据此，我们采用 8 μmol/L As2O3 作用 24 h 进行后续实验，探索 As2O3 对肝癌细胞 HepG2 迁移和侵袭的影响。
图2
As2O3 不同作用时间对 HepG2 细胞凋亡的影响（* P < 0.05）
Figure2.
Effect of As2O3 on HepG2 cell apoptosis (* P < 0.05)
2.3 As2O3 对 HepG2 细胞迁移能力的影响
利用细胞划痕实验检测 As2O3 对 HepG2 细胞迁移能力的影响。如图 3 所示，与对照组相比，使用 8 μmol/L As2O3 提前处理 HepG2 细胞，48 h 后，其迁移距离与对照组相比明显降低，差异具有统计学意义（P < 0.05），说明一定浓度的 As2O3 可以抑制肝癌细胞 HepG2 迁移。为了进一步验证 As2O3 对于肝癌细胞迁移能力的影响。我们采用 Western blot 实验检测了迁移相关蛋白的表达。如图 4 所示，使用 8 μmol/L As2O3 作用 24 h 后，与对照组相比，HepG2 细胞中迁移相关蛋白 Cdc42、RhoA、Rac1 的表达水平均显著下调（P < 0.05），进一步说明 As2O3 可以抑制肝癌细胞迁移。
图3
As2O3 抑制 HepG2 细胞迁移（* P < 0.05）
Figure3.
Inhibition of HepG2 cell migration by As2O3 (* P < 0.05)
图4
As2O3 抑制 Cdc42、RhoA、Rac1 蛋白表达（* P < 0.05）
Figure4.
Inhibition of Cdc42, RhoA and Rac1 protein expression by As2O3 (* P < 0.05)
2.4 As2O3 对 HepG2 细胞侵袭能力的影响
我们分别采用 Western blot 实验和 qRT-PCR 实验检测了各组细胞中侵袭相关蛋白 MMP-9 的蛋白和基因表达。结果如图 5 显示，与对照组相比，MMP-9 蛋白和 mRNA 表达水平均显著下调（P < 0.05）。利用 Transwell 实验检测 As2O3 对 HepG2 细胞侵袭能力的影响。结果如图 6 所示，8 μmol/L As2O3 作用 24 h 后，HepG2 细胞的侵袭数目与对照组相比明显降低，差异具有统计学意义（P < 0.05），说明一定浓度的 As2O3 可以抑制肝癌细胞 HepG2 的侵袭能力。
图5
As2O3 抑制 MMP-9 蛋白和 mRNA 表达量（* P < 0.05）
Figure5.
Inhibition of MMP-9 protein and mRNA expression by As2O3 (* P < 0.05)
图6
As2O3 抑制 HepG2 细胞侵袭（* P < 0.05）
Figure6.
Inhibition of HepG2 cell invasion by As2O3 (* P < 0.05)
2.5 As2O3 对 HepG2 细胞凋亡相关蛋白和 mRNA 表达的影响
根据前述实验结果，我们已知 As2O3 可以诱导肝癌细胞发生凋亡。为进一步验证该结论，我们采用 qRT-PCR 和 Western blot 实验分别检测了 As2O3 作用前后肝癌细胞中凋亡相关基因和蛋白表达水平的变化情况。如图 7 所示，用 8 μmol/L As2O3 处理 24 h 后，与对照组比，HepG2 细胞中促凋亡基因 Caspase-3、Bax 的 mRNA 表达水平均显著上调（P < 0.05），而抑凋亡基因 Bcl-2 的 mRNA 表达水平则出现显著下调（P < 0.05）。图 8 是 HepG2 细胞中 Caspase-3、Bax、Bcl-2 的蛋白表达水平及统计图，其结果与 mRNA 表达水平一致，说明 As2O3 可以促进肝癌细胞 HepG2 发生凋亡。
图7
As2O3 抑制 Caspase-3、Bax、Bcl-2 的 mRNA 表达水平 （*P < 0.05）
Figure7.
Inhibition of Caspase-3, Bax and Bcl-2 mRNA expression levels by As2O3 (* P < 0.05)
图8
As2O3 抑制 Caspase-3、Bax、Bcl-2 的蛋白表达水平（* P < 0.05）
Figure8.
Inhibition of Caspase-3, Bax and Bcl-2 protein expression levels by As2O3 (* P < 0.05)
3 讨论
肿瘤的发生发展是一个极其复杂的过程，单就基因或者信号传递的角度去理解和治疗肿瘤相对比较困难，故而本研究侧重于关注天然药物对肿瘤的抑制和治疗作用。众所周知，肿瘤治疗中的最大障碍在于肿瘤细胞容易发生侵袭和转移[20-21]。肿瘤细胞的迁移、侵袭、转移是一个非常复杂的多步骤的生物学过程，受到多基因、多因素、多行为的调控，而降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力则能够有效抑制肿瘤细胞的转移，进而控制肿瘤的进展。
近年来研究表明，As2O3 不仅对白血病疗效显著，对肺癌、胃癌、骨肉瘤等亦有明显疗效[14-16, 22]。肝脏作为有毒物质的代谢场所，亦是 As2O3 甲基化代谢的主要场所，故而 As2O3 对肝癌是否有抑制作用及其相关的分子机制是我们深入探索的问题。本研究中，我们发现 As2O3 能够显著降低 HepG2 细胞的迁移能力（见图 3），且下调 HepG2 细胞中 Rac1、RhoA 及 Cdc42 的蛋白表达水平（见图 4），说明 As2O3 有利于抑制肝癌细胞 HepG2 的迁移。而 Lu 等[23]研究认为 As2O3 是通过抑制 RhoC 蛋白的表达抑制肝癌细胞 HepG2 的迁移，而 RhoA 和 RhoC 同属于 Rho GTP 酶超家族中的 Rho 亚家族，具有序列同源性，因此我们结论具有相似性，认为 As2O3 可能是通过抑制 Rho GTPases 表达从而抑制细胞迁移。细胞外基质的改变是肿瘤细胞发生浸润和侵袭的重要环节，而基质金属蛋白酶在该过程中发挥至关重要的作用。本研究结果发现 As2O3 处理后，肝癌细胞中侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶家族成员 MMP-9 的基因和蛋白表达水平均出现明显下调（见图 5），且 Transwell 实验中侵袭细胞数量明显减少（见图 6），说明 As2O3 可以抑制肝癌细胞 HepG2 发生侵袭，而 Zheng 等[24]的文章中也提到 MMP-9 下调导致肝癌细胞 SMMC-7721 迁移侵袭能力降低。在细胞凋亡过程中，其主要信号通路均与 Caspase-3 的激活相关[25]。此外，Bcl-2 和 Bax 也是调节细胞凋亡的重要基因，正常情况下，促凋亡蛋白 Bax 与抑凋亡蛋白 Bcl-2 可形成同源或者异源二聚体并处于一个平衡状态，若由于各类刺激因素打破此平衡，机体细胞凋亡就发生了。本研究中，我们发现 As2O3 使 Caspase-3 和 Bax 的蛋白和 mRNA 表达上调，同时也使 Bcl-2 蛋白和 mRNA 表达下调，此结果表明 As2O3 可诱导 HepG2 细胞凋亡（见图 7、图 8）。
综上所述，本研究发现一定浓度的 As2O3 可以抑制肝癌细胞 HepG2 的迁移和侵袭，并促进其发生凋亡，其可见机制如图 9 所示，有望为肝癌的药物治疗以及联合用药提供一定的指导意义。
图9
As2O3 抑制迁移侵袭并诱导凋亡示意图
Figure9.
Schematic diagram of inhibition of migration and invasion and induction of apoptosis by As2O3
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
引言
原发性肝癌是一种严重威胁人们健康并造成大量死亡的恶性肿瘤，具有发展快、预后差、易复发和病死率高等特点[1-2]。据统计数据显示，在我国，每年有 40 多万人死于肝癌，其病死率仅次于肺癌和胃癌[3-4]。由于肝癌细胞极易发生迁移和侵袭，手术切除、介入治疗、局部消融及肝移植等目前常见的肝癌治疗方法，其治疗效果差且术后易复发[5-6]。因此，抑制肝癌侵袭转移是当前肝癌治疗的主攻方向之一。
肿瘤治疗最大的障碍就是肿瘤细胞容易发生侵袭转移[7]。肿瘤细胞侵袭转移的发生是一个非常复杂的过程，是多基因、多因素、多步骤的生物学行为。在肿瘤细胞发生浸润侵袭的过程中，其胞外基底膜的降解是一个重要环节[8]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一组含 Zn2+的能降解细胞外基质的蛋白酶，在正常组织中，MMPs 表达极少，在损伤和各种癌变组织中变得活跃[9]。研究表明，在多种具有侵袭性和高转移性的肿瘤中都观察到基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表达增高，其通过参与肿瘤黏附、血管侵入等过程促进肿瘤细胞发生侵袭[10]。在肿瘤细胞发生转移的过程中，其细胞骨架的重构发挥重要作用[11]。研究表明，Rho GTPases（Rac1、RhoA、Cdc42）蛋白通过诱导局部肌动蛋白聚集从而分别促进应力纤维、板状伪足和丝状伪足的形成，进而调控细胞的迁移行为[12]。其中，Rac1 促进板状伪足和膜皱褶的形成，给细胞提供一个向前的牵引力；RhoA 主要通过调控细胞尾部应力纤维的形成和黏着斑的解聚，促进细胞收缩从而促进细胞迁移；Cdc42 则与丝状伪足的形成密切相关，进而调控细胞极性和迁移方向[11, 13]。故而抑制金属蛋白酶和 Rho GTPases 能有效降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力，从而能够有效抑制肿瘤细胞的转移，控制肿瘤的进展。
三氧化二砷（As2O3）是一种有效的白血病及其他实体瘤的治疗药物，具有广泛的抗肿瘤效应[14]。有研究表明，As2O3 可以通过改变肿瘤细胞活性氧生成以及抑制肿瘤血管生成等途径诱导肺癌、胃癌、骨肉瘤等肿瘤细胞的凋亡，并抑制乳腺癌、淋巴瘤等肿瘤细胞的增殖[15-17]。肝脏作为有毒物质的代谢场所，亦是As2O3甲基化代谢的主要场所[18]，故而 As2O3 对肝癌是否有抑制作用及其相关的分子机制是一个值得深入探索的问题。已有大量研究表明 As2O3 可促进肝癌细胞凋亡[19]，但鲜少有 As2O3 对肝癌细胞迁移、侵袭及其相关分子机制的研究探索。本文全面探讨了 As2O3 对肝癌 HepG2 细胞迁移、侵袭和凋亡的影响并进一步探索了其可能的分子机制，以期为临床肝癌的治疗和联合用药提供新的更为有效的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
人肝细胞肝癌细胞株 HepG2 购自中科院生物化学与细胞生物学研究所；RPMI 1640 培养基和胰蛋白酶购自美国 Hyclone 公司；胎牛血清购自上海复蒙生物科技有限公司；As2O3 购自美国 Sigma 公司；CCK-8 细胞活性检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒和荧光定量 PCR 试剂盒购自日本 Takara 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒和超敏 ECL 化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所。Cdc42、Rac1、RhoA、MMP-9 和 Caspase-3 兔单克隆抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司；Bcl-2 和 Bax 兔单克隆抗体购自美国 Abcam 公司；GAPDH 鼠单克隆抗体购自北京中杉金桥有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人肝癌细胞株 HepG2 细胞，用 5 mL 含 10% 胎牛血清的 1640 培养基于 37℃、饱和湿度、5% CO2 的恒温细胞培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，取状态良好的对数期细胞进行后续实验。
1.2.2 CCK-8 法检测 As2O3 对 HepG2 半抑制浓度（IC50）
将对数生长期的 HepG2 细胞制成细胞悬液（1 × 106个/mL），以每孔 200 μL 加入 96 孔板中，在 37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养 24 h 后，弃去培养液，每孔分别加入终浓度为 0、1、2、4、8、16、32 μmol/L As2O3 的 1640 完全培养基，并设置阴性对照组和只加培养基的空白对照组，每组设置 6 个平行孔，培养 24 h 后每孔加入 10 μL CCK-8 试剂，震荡 10 min 后于细胞培养箱中继续培养 2 h，酶标仪检测 450 nm 波长处各孔 OD 值，并按以下公式计算 IC50：IC50 =（实验组 − 空白对照组）/（阴性对照组 − 空白对照组）× 100%。根据 IC50 计算所得结果，我们选取 8 μmol/L As2O3 浓度进行后续实验。
1.2.3 As2O3 作用不同时间对细胞形态学影响
以 1 × 106个/孔接种 HepG2 细胞于 6 孔板中，于 37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养 24 h 后，弃去培养液，各孔加入 2 mL 终浓度为 8 μmol/L As2O3 的 1640 完全培养基，分别培养 12、24、48 h 后，置于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化并拍照。
1.2.4 划痕实验检测迁移能力
接种 HepG2 细胞于六孔板中，加入 1640 完全培养基培养，待细胞融合度达 90% 时，对照组换成无血清 1640 培养基，实验组更换成含终浓度为 8 μmol/L As2O3 的无血清 1640 培养基分别培养 24 h。用黄枪尖在单层细胞上划出一个垂直损伤区，PBS 漂洗 3 次，洗掉刮下的细胞，将培养基更换成新鲜无血清 1640 培养基。分别于 0 h 和 48 h 在倒置相差显微镜下观察划痕愈合情况并拍照。
1.2.5 Transwell 检测侵袭能力
取对数生长期 HepG2 细胞饥饿过夜，分别用无血清 1640 培养基和含 As2O3 的无血清 1640 培养基重悬制成单细胞悬液，各取 200 μL 单细胞悬液加入已铺基底膜基质的 Transwell 上室中，下室加入 600 μL 含 10% 胎牛血清的 1640 完全培养基。37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养 24 h 后，取出 Transwell 小室，PBS 漂洗 3 次后，加入 4% 多聚甲醛固定 10 min，用 1% 结晶紫染色 30 min。用棉签轻轻擦去小室内部残留细胞，倒置相差显微镜下拍照，随机选取 5 个视野拍照，计数小室底面细胞个数。实验重复 3 次。
1.2.6 Western blot 检测细迁移、侵袭和凋亡相关蛋白表达
取对数生长期 HepG2 细胞，使用含终浓度为 8 μmol/L As2O3 的完全培养基培养 24 h，PBS 洗 3 次，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的 RIPA 细胞裂解液，收集裂解液并置于冰上 30 min 使其充分裂解，12 000 g 冷冻离心 10 min，吸取上清于干净的 EP 管中。BCA 法测定蛋白质浓度，后加入 Loading buffer 煮沸 8 min 使其充分变性。取等量蛋白（30 μg）加入上样孔，SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质，电泳结束后将蛋白转印到 PVDF 膜上，用 5% 脱脂牛奶封闭 2 h 后孵育一抗，4℃ 过夜。TBST 洗 3 次，室温孵育二抗 2 h，TBST 洗 3 次后 ECL 显色，灰度分析处理并进行统计分析。
1.2.7 qRT-PCR 检测细侵袭和凋亡相关基因表达
取对数生长期 HepG2 细胞，用含终浓度 8 μmol/L As2O3 的完全培养基培养 24 h，PBS 清洗 3 次后，按照试剂盒的操作步骤，提取细胞总 RNA，将其反转录为 cDNA（37℃ 15 min，85℃ 5 s）后完成 PCR 荧光定量（Step 1：95℃ 30 s；Step 2：95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 个循环；Step 3：溶解曲线）。所用引物序列见表 1。
表1
qRT-PCR 所用引物信息
Table1.
Oligonucleotide primers used in qRT-PCR
1.3 统计学处理
实验所有数据以均数 ± 标准差表示，采用 SSPS17.0 和 Graphpad prism 5 软件进行统计学分析，P < 0.05 则认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 As2O3 对 HepG2 细胞 IC50 测定
我们采用 CCK-8 细胞活力实验检测细胞活力变化，结果如图 1 所示。随着 As2O3 浓度升高，细胞活力逐步下降，As2O3 对 HepG2 细胞活力的影响呈现剂量依赖性，其 IC50 为 7.3 μmol/L。根据本实验结果，我们选取 8 μmol/L As2O3 进行后续实验。
图1
As2O3 对 HepG2 细胞活力的影响
Figure1.
Effect of As2O3 on HepG2 cell activity
2.2 As2O3 对 HepG2 细胞凋亡的影响
用含终浓度 8 μmol/L As2O3 的完全培养基分别培养 HepG2 细胞 12、24、48 h 后，采用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。如图 2 所示，随着 As2O3 作用时间的延长，细胞的凋亡程度也逐渐增强，呈现一定的时间依赖性。HepG2 细胞的存活数目与对照组相比明显降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。24 h 时 HepG2 细胞出现显著凋亡；在 48 h 时细胞基本完全凋亡。据此，我们采用 8 μmol/L As2O3 作用 24 h 进行后续实验，探索 As2O3 对肝癌细胞 HepG2 迁移和侵袭的影响。
图2
As2O3 不同作用时间对 HepG2 细胞凋亡的影响（* P < 0.05）
Figure2.
Effect of As2O3 on HepG2 cell apoptosis (* P < 0.05)
2.3 As2O3 对 HepG2 细胞迁移能力的影响
利用细胞划痕实验检测 As2O3 对 HepG2 细胞迁移能力的影响。如图 3 所示，与对照组相比，使用 8 μmol/L As2O3 提前处理 HepG2 细胞，48 h 后，其迁移距离与对照组相比明显降低，差异具有统计学意义（P < 0.05），说明一定浓度的 As2O3 可以抑制肝癌细胞 HepG2 迁移。为了进一步验证 As2O3 对于肝癌细胞迁移能力的影响。我们采用 Western blot 实验检测了迁移相关蛋白的表达。如图 4 所示，使用 8 μmol/L As2O3 作用 24 h 后，与对照组相比，HepG2 细胞中迁移相关蛋白 Cdc42、RhoA、Rac1 的表达水平均显著下调（P < 0.05），进一步说明 As2O3 可以抑制肝癌细胞迁移。
图3
As2O3 抑制 HepG2 细胞迁移（* P < 0.05）
Figure3.
Inhibition of HepG2 cell migration by As2O3 (* P < 0.05)
图4
As2O3 抑制 Cdc42、RhoA、Rac1 蛋白表达（* P < 0.05）
Figure4.
Inhibition of Cdc42, RhoA and Rac1 protein expression by As2O3 (* P < 0.05)
2.4 As2O3 对 HepG2 细胞侵袭能力的影响
我们分别采用 Western blot 实验和 qRT-PCR 实验检测了各组细胞中侵袭相关蛋白 MMP-9 的蛋白和基因表达。结果如图 5 显示，与对照组相比，MMP-9 蛋白和 mRNA 表达水平均显著下调（P < 0.05）。利用 Transwell 实验检测 As2O3 对 HepG2 细胞侵袭能力的影响。结果如图 6 所示，8 μmol/L As2O3 作用 24 h 后，HepG2 细胞的侵袭数目与对照组相比明显降低，差异具有统计学意义（P < 0.05），说明一定浓度的 As2O3 可以抑制肝癌细胞 HepG2 的侵袭能力。
图5
As2O3 抑制 MMP-9 蛋白和 mRNA 表达量（* P < 0.05）
Figure5.
Inhibition of MMP-9 protein and mRNA expression by As2O3 (* P < 0.05)
图6
As2O3 抑制 HepG2 细胞侵袭（* P < 0.05）
Figure6.
Inhibition of HepG2 cell invasion by As2O3 (* P < 0.05)
2.5 As2O3 对 HepG2 细胞凋亡相关蛋白和 mRNA 表达的影响
根据前述实验结果，我们已知 As2O3 可以诱导肝癌细胞发生凋亡。为进一步验证该结论，我们采用 qRT-PCR 和 Western blot 实验分别检测了 As2O3 作用前后肝癌细胞中凋亡相关基因和蛋白表达水平的变化情况。如图 7 所示，用 8 μmol/L As2O3 处理 24 h 后，与对照组比，HepG2 细胞中促凋亡基因 Caspase-3、Bax 的 mRNA 表达水平均显著上调（P < 0.05），而抑凋亡基因 Bcl-2 的 mRNA 表达水平则出现显著下调（P < 0.05）。图 8 是 HepG2 细胞中 Caspase-3、Bax、Bcl-2 的蛋白表达水平及统计图，其结果与 mRNA 表达水平一致，说明 As2O3 可以促进肝癌细胞 HepG2 发生凋亡。
图7
As2O3 抑制 Caspase-3、Bax、Bcl-2 的 mRNA 表达水平 （*P < 0.05）
Figure7.
Inhibition of Caspase-3, Bax and Bcl-2 mRNA expression levels by As2O3 (* P < 0.05)
图8
As2O3 抑制 Caspase-3、Bax、Bcl-2 的蛋白表达水平（* P < 0.05）
Figure8.
Inhibition of Caspase-3, Bax and Bcl-2 protein expression levels by As2O3 (* P < 0.05)
3 讨论
肿瘤的发生发展是一个极其复杂的过程，单就基因或者信号传递的角度去理解和治疗肿瘤相对比较困难，故而本研究侧重于关注天然药物对肿瘤的抑制和治疗作用。众所周知，肿瘤治疗中的最大障碍在于肿瘤细胞容易发生侵袭和转移[20-21]。肿瘤细胞的迁移、侵袭、转移是一个非常复杂的多步骤的生物学过程，受到多基因、多因素、多行为的调控，而降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力则能够有效抑制肿瘤细胞的转移，进而控制肿瘤的进展。
近年来研究表明，As2O3 不仅对白血病疗效显著，对肺癌、胃癌、骨肉瘤等亦有明显疗效[14-16, 22]。肝脏作为有毒物质的代谢场所，亦是 As2O3 甲基化代谢的主要场所，故而 As2O3 对肝癌是否有抑制作用及其相关的分子机制是我们深入探索的问题。本研究中，我们发现 As2O3 能够显著降低 HepG2 细胞的迁移能力（见图 3），且下调 HepG2 细胞中 Rac1、RhoA 及 Cdc42 的蛋白表达水平（见图 4），说明 As2O3 有利于抑制肝癌细胞 HepG2 的迁移。而 Lu 等[23]研究认为 As2O3 是通过抑制 RhoC 蛋白的表达抑制肝癌细胞 HepG2 的迁移，而 RhoA 和 RhoC 同属于 Rho GTP 酶超家族中的 Rho 亚家族，具有序列同源性，因此我们结论具有相似性，认为 As2O3 可能是通过抑制 Rho GTPases 表达从而抑制细胞迁移。细胞外基质的改变是肿瘤细胞发生浸润和侵袭的重要环节，而基质金属蛋白酶在该过程中发挥至关重要的作用。本研究结果发现 As2O3 处理后，肝癌细胞中侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶家族成员 MMP-9 的基因和蛋白表达水平均出现明显下调（见图 5），且 Transwell 实验中侵袭细胞数量明显减少（见图 6），说明 As2O3 可以抑制肝癌细胞 HepG2 发生侵袭，而 Zheng 等[24]的文章中也提到 MMP-9 下调导致肝癌细胞 SMMC-7721 迁移侵袭能力降低。在细胞凋亡过程中，其主要信号通路均与 Caspase-3 的激活相关[25]。此外，Bcl-2 和 Bax 也是调节细胞凋亡的重要基因，正常情况下，促凋亡蛋白 Bax 与抑凋亡蛋白 Bcl-2 可形成同源或者异源二聚体并处于一个平衡状态，若由于各类刺激因素打破此平衡，机体细胞凋亡就发生了。本研究中，我们发现 As2O3 使 Caspase-3 和 Bax 的蛋白和 mRNA 表达上调，同时也使 Bcl-2 蛋白和 mRNA 表达下调，此结果表明 As2O3 可诱导 HepG2 细胞凋亡（见图 7、图 8）。
综上所述，本研究发现一定浓度的 As2O3 可以抑制肝癌细胞 HepG2 的迁移和侵袭，并促进其发生凋亡，其可见机制如图 9 所示，有望为肝癌的药物治疗以及联合用药提供一定的指导意义。
图9
As2O3 抑制迁移侵袭并诱导凋亡示意图
Figure9.
Schematic diagram of inhibition of migration and invasion and induction of apoptosis by As2O3
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
