本文旨在研究微重力环境对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响，并进一步探讨微重力环境下核因子 κB（NF-κB）信号通路对成骨细胞零重力的响应机制。将 MC3T3-E1 细胞分别进行正常培养（CON）和模拟微重力培养（SMG），培养期满后观察成骨性相关分子表达变化以及 NF-κB 信号通路变化情况。结果显示，在微重力条件下，碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、一型胶原（CoL-Ⅰ）的基因和蛋白水平表达下调；与此同时，NF-κB 信号抑制子 α（IκB-α）下调，p65 表达显著上调，且二者磷酸化水平升高，细胞培养液中 IL-6 含量增多。研究表明，微重力环境下 NF-κB 信号通路可激活并调控成骨细胞分化。
引用本文： 韩标, 张扬, 李昊, 韦淑萍, 李瑞欣, 张西正. 模拟微重力环境下核因子κB信号通路调节MC3T3-E1细胞成骨分化的实验研究. 生物医学工程学杂志, 2019, 36(3): 421-427. doi: 10.7507/1001-5515.201801019 复制
引言
骨骼是支撑和维持人类基本活动的重要器官之一，力学载荷在保持骨量和骨的完整性方面具有重要的作用。研究表明，骨组织对力学环境的改变极为敏感，能对环境的变化做出相应的改变来体现出自身的力学适应性[1-2]。随着航空航天技术的不断发展，空间飞行和长期的太空探索亦愈加频繁，然而来自太空复杂多变的环境诸如真空、极端温度、太空垃圾、宇宙射线和失重等是制约人类长期太空作业的重要原因[3]；近年来已证实太空飞行会造成机体的骨骼系统、心血管系统、肌肉系统以及免疫系统等不同程度的损害，尤其以骨骼系统损伤为重[4-6]。研究表明，骨骼系统在机体离开微重力环境到达地球表面后仍会继续产生病理性变化，微观方面主要表现在骨组织细胞结构和功能的破坏，宏观方面主要是股骨、脊柱等承重骨的骨质流失、骨脆性增加、骨折罹患率增高等。这些危害对太空作业人员的身体健康构成了严重的威胁，并影响太空任务圆满完成以及航天员返回地球再适应的能力。然而，目前对于失重环境下骨丢失的具体分子机制以及细胞间相互作用机制尚不完全清楚。
核因子 kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）在免疫炎症反应、细胞增殖、肿瘤的发生过程中起到至关重要的作用[7-8]。到目前为止，该家族共发现了 NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、Rel A（p65）、Rel B、cRel 共 5 种蛋白；其中，p50 与 p50、p52 与 p52 以及 p65 和 p50 可形成同源二聚体和异源二聚体，而且在该家族中，p65 与 p50 形成的异源二聚体数量最多，通常也用以代指 NF-κB。研究发现在 NF-κB 信号通路中，p65 的高表达会抑制多种成骨性相关基因的表达和细胞矿化[9]；另有研究表明[10-11]，抑制 NF-κB 信号通路活性可预防由雌激素缺乏导致的骨丢失，在发生雌激素缺乏型骨质疏松时，会形成“细胞分泌炎性因子→NF-κB 信号通路活化→促进炎性因子分泌”循环，最终 NF-κB 异常活化，抑制骨的形成。本课题组[12]前期研究表明，NF-κB 信号通路可以经力学刺激激活，Wang 等发现，对 MC3T3-E1 细胞施加 2 000 με 应变，可以激活 NF-κB 通路，促进成骨作用，可能是与 P38MAPK 信号通路共同作用于骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）有关。以上研究由于细胞的种类、研究因素等不同，NF-κB 信号通路的激活/抑制对骨组织代谢的影响也不尽相同，甚至出现了相反的结果，但可以肯定的是，力学环境的改变可以导致 NF-κB 信号通路的异常改变。
现有的研究发现 NF-κB 在骨组织形成与吸收过程中发挥着重要的作用，并可以对力学刺激进行响应，但其在失重环境下对骨组织细胞的代谢机制还尚未清楚。目前已知微重力环境下成骨分化会受到抑制，但是，微重力环境下 NF-κB 信号通路的变化是正向还是负向仍需进一步了解。在本研究中，我们主要探讨微重力环境下 NF-κB 信号通路对成骨细胞的力学信号响应机制，以深入了解 NF-κB 在微重力环境下对成骨细胞分化的调节作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
MC3T3-E1 细胞系由协和医科大学基础医学研究所提供，本实验室冻存。α-MEM 培养液、优级胎牛血清、0.25% 胰酶+EDTA 购于美国 Gibco 公司。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。PCR 引物购于生工生物工程（上海）股份有限公司。SYBR Premix Ex TaqTM II、TrizoL 购于日本 Takara 公司。High-capacity cDNA reverse transcription kits 购于美国 Invitrogen 公司。骨钙素（osteocalcin，OCN）、一型胶原（type Ⅰ collagen，CoL-Ⅰ）、骨形态发生蛋白 2 和 4（BMP-2，BMP-4）、Smad 1、Smad 5 等一抗购于美国 Santa Cruz 公司，二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。BCA 蛋白提取试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。干扰素 6（interleukin 6，IL-6）Elisa 试剂盒购于武汉默沙克生物科技有限公司。Cytodex 3 微载体购于美国 GE Healthcare 公司。旋转培养系统（rotary cell culture systems，RCCS）购于美国 Cell Tech 公司。
1.2 微重力环境建立
将复苏后的 MC3T3-E1 细胞按 1 × 105密度接种于 25 cm2 细胞培养瓶中，置于 5% CO2、37℃ 的恒温培养箱中培养，每 2 d 换液，待细胞铺满培养瓶底部 80%～90% 进行传代。
按操作说明书对 Cytodex 3 微载体及旋转培养系统进行预处理，将细胞按 1 × 105/mL 的密度接种于旋转培养系统内，而后陆续加入 5 mL 微载体溶液（5 mg/mL）、5 mL 优级胎牛血清，最后加入新鲜培养基（无血清和双抗）灌满，用注射器将系统内气泡排尽，以 20 r/min 转速匀速培养 3 d；期间若发现有气泡产生，立即将气泡赶尽；对照组置于细胞培养瓶中常规培养。
1.3 细胞获取
对照组（CON）：细胞培养 3 d 后，0.25% 的胰酶室温消化 2～3 min，加等量培养液终止消化，用移液枪轻轻吹打数次，将所有液体转入新的离心管中，1 000 r/min 离心 5 min 弃上清，再加入 1 mL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）轻轻吹打，再次离心，收集细胞。
微重力组（SMG）：微重力培养期满后，将旋转系统中细胞转移至 50 mL 离心管中以 1 000 r/min 离心 5 min，PBS 洗涤 2 次，收集微载体于 10 mL 离心管中，加入 3～5 mL 胰酶，反复吹打消化 5～10 min 后，加入 2 倍胰酶体积的培养液终止消化，用 200 目滤网过滤收集液体，而后以 1 000 r/min 离心 5 min，收集细胞。
1.4 扫描电镜观察 MC3T3-E1 细胞与微载体贴附生长情况
收集 SMG 组培养期满的细胞-微载体复合体及空白微载体，1 000 r/min 离心 5 min 弃上清，预冷的 PBS 清洗 3 次，再次离心，去上清，加入适量 2.5% 戊二醛 4℃ 过夜固定，弃上清，PBS 清洗 3 次，1% 锇酸常温固定 1 h，PBS 清洗 3 次，按照 30%、50%、75%、95%、100% 体积浓度的乙醇进行梯度脱水，临界点干燥仪中进行临界点干燥，最后进行 Pt 表面镀膜，置于扫描电镜下观察。
1.5 碱性磷酸酶活性检测
在收集的细胞中加入 0.5 mL 的 PBS 缓冲液，保证超声探头在液面以下，设置功率 300 W，冰水浴状态下进行蛋白超声裂解，每次超声 5 s，间隔 4 次，每次间隔时间为 30 s，BCA 方法将蛋白定量，按操作表将各试剂加入到 96 孔板，520 nm 处波长酶标仪测定各孔吸光度。
1.6 real-time PCR 检测成骨相关基因表达水平变化
收集各组细胞，用预冷的 PBS 清洗 3 次后加入 1 mL TrizoL 冰上充分裂解细胞，酚氯仿法提取细胞总 RNA，通过 OD260/280 计算 RNA 的纯度与浓度，将 RNA 浓度定量到 1 μg/μL。用 High-capacity cDNA reverse transcription kits 将 RNA 体系在 70℃ 10 min、37℃ 30 min、95℃ 5 min 逆转录成 cDNA，以 cDNA 为模板采用实时荧光定量 PCR 分别检测 ALP、OCN、COL-Ⅰ、BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 的基因表达水平（每个基因设置三次生物学重复）。引物序列见表 1。总反应体系为 25 μL：cDNA（稀释 20 倍）2.5 μL，Primer-F（10 mmol/L）1 μL，Primer-R（10 mmol/L）1 μL，SYBR® Premix Ex TaqTM II 12.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR 循环反应为：95℃ 预变性 10 min，95℃ 变性 15 s、60℃ 退火 1 min、72℃ 延伸 15 s 共 40 个循环，72℃ 终延伸 5 min。各组结果采用 
法[13]将对照组与 β-actin 标准化后进行比较。
表1
引物序列
Table1.
Sequences of primer used in this study
1.7 Western-blot 检测成骨相关蛋白表达水平变化
收集各组细胞，BCA 法提取并定量细胞蛋白，取定量后蛋白 30 μg，加入 5 × 上样缓冲液，沸水中煮 10 min，而后将样品加入含有配制好的含 10% 分离胶与 5% 浓缩胶的电泳系统内跑胶；切胶并转膜；转膜结束后，将聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜放入封闭袋中与 5% 脱脂奶粉室温下反应 1 h；封闭后的 PVDF 膜分别与兔抗 OCN、COL-Ⅰ、BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 等一抗（1∶500 稀释）4℃ 孵育过夜；取出 PVDF 膜，PBST 洗涤 5 次，与山羊抗兔的二抗（1∶5 000 稀释）常温孵育 1 h，PBST 洗涤 5 次；加入显影发光液，暗室显影定影，取出胶片应用 Image J 软件分析结果。
1.8 Elisa 检测 IL-6 含量变化
无菌管收集各组细胞培养上清液，2 000 r/min 离心 20 min，收集上清液，按说明书加入各组分，并执行相关步骤，450 nm 处波长测各组分 OD 值。
1.9 统计分析
实验数据均用均值 ± 标准差表示，采用单因素方差分析，P < 0.05 表示差异具有统计学意义，每组数据来源至少为 3 次独立实验结果。
2 结果
2.1 模拟微重力环境下细胞与微载体的贴附结果
MC3T3-E1 细胞与微载体贴附效率较高，一般情况下，旋转培养 12 h 内可完成较理想的贴附，而后随着时间增长，微载体表面的细胞会不断增殖。如图 1 所示，结果表明在模拟微重力环境下，MC3T3-E1 细胞能较好地贴附在微载体上，且生长状态良好。
图1
扫描电镜下不同倍数细胞贴附微载体结果图
Figure1.
The image of cell-microcarriers with scanning electron microscope in different magnification
2.2 模拟微重力对 MC3T3-E1 细胞成骨相关性基因和蛋白的表达水平影响
ALP、OCN、CoL-Ⅰ是反映成骨活性的主要标志性基因，为了验证微重力环境下这些成骨相关性基因和蛋白是否表达下调，我们检测了这些基因的表达。结果表明微重力培养成骨细胞 3 d 后，ALP、OCN 和 COL-Ⅰ基因的 mRNA 水平显著下调（见图 2a），ALP 活性检测及 western blot 结果显示蛋白水平的表达与 mRNA 改变相一致（见图 2b、2c）。
图2
模拟微重力环境对成骨细胞成骨相关蛋白和基因的影响
a. qRT-PCR 检测 ALP、OCN、CoL-Ⅰ mRNA 水平；b. Elisa 检测 MC3T3-E1 成骨细胞 ALP 活性；c. western blot 检测 OCN、CoL-Ⅰ蛋白表达水平。* 与 CON 组比较，
a. the expression of ALP, OCN and CoL-Ⅰ mRNA were investigated using qRT-PCR; b. the MC3T3-E1 cell ALP activity was measured using Elisa kits; c. the expression of OCN and CoL-Ⅰ protein were detected by western blot. *
2.3 模拟微重力环境下对 BMP/Smad 通路的调控
在前期的研究发现[12]，生理性动态力学载荷（2 000 με）能激活 NF-κB 信号通路，调节 BMPs，进而通过经典的 Smad 通路促进成骨分化。在本研究中，为了观察 BMPs 是否也对模拟微重力有相应的力学响应机制，我们检测了细胞在模拟微重力培养 3 d 后 BMP-2、BMP-4 的表达，如图 3 所示。与对照组相比，SMG 组 BMP-2 基因表达水平和蛋白表达水平无显著变化，BMP-4 的基因表达水平下调（见图 3a），但是蛋白表达水平无明显变化（见图 3b），说明 BMP-4 仅在转录水平发生了改变。为了明确 BMP-2、BMP-4 对微重力环境的力学响应，并确认 BMP-2、BMP-4 是否通过 Smads 蛋白对成骨分化进行调节，我们检测了 Smad 1、Smad 5 基因和蛋白表达水平的变化，结果显示 Smad 1、Smad 5 无论在基因表达水平还是蛋白表达水平与对照组相比均无显著差异（见图 3）。因此，在模拟微重力条件下，成骨细胞的分化并不是通过 BMPs 来调控的。
图3
模拟微重力环境对 BMP/Smad 信号通路的影响
a. qRT-PCR 检测 BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 mRNA 水平；b. western blot 检测 BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 蛋白表达水平。* 与 CON 组比较，
a. the expression of BMP-2, BMP-4, Smad 1 and Smad 5 mRNA were investigated using qRT-PCR; b. the expression of BMP-2, BMP-4, Smad 1 and Smad 5 protein were detected by western blot. *
2.4 NF-κB 信号通路对模拟微重力的响应
为了观察微重力环境下成骨细胞的分化是否与 NF-κB 信号通路相关，我们检测了微重力培养后的成骨细胞与 NF-κB 信号通路相关的信号分子变化，如 NF-κB 抑制蛋白（inhibitory nuclear factor-kappa B，IκB）α（IκB-α）及 p65 的蛋白总量变化及其磷酸化水平，来确定 NF-κB 信号通路是否激活或抑制。课题组前期实验表明 NF-κB 信号通路在给予力学刺激后，在 30 min 时被激活，并在 60 min 时达到最高峰[12，14-15]。因此本次实验在微重力培养成骨细胞 60 min 时检测了 IκB-α 及 p65 的磷酸化水平。结果如图 4 所示，微重力条件下，IκB-α 蛋白表达水平降低，磷酸化水平升高；p65 总蛋白表达显著上调，磷酸化水平亦显著升高。上述结果表明，微重力条件下 NF-κB 信号通路活性增强。
图4
western blot 检测模拟微重力对 NF-κB 信号分子 IκB-α、p65 蛋白及其磷酸化的影响
* 0 min 与 60 min 比较，
the expression of IκB-α, p65, p-IκB-α, p-p65 protein were detected by western blot. * 0 min
2.5 模拟微重力条件下细胞炎性因子 IL-6 的表达情况
为了深入了解 NF-κB 信号通路活性增强的原因，我们检测了细胞分泌炎性因子的情况，结果如图 5 所示，细胞在模拟微重力条件下培养 3 d 后，MC3T3-E1 细胞分泌的炎性因子 IL-6 显著增多。
图5
模拟微重力对 MC3T3-E1 细胞分泌 IL-6 的影响（* 与 CON 组比较，P < 0.05）
Figure5.
Effect of microgravity on IL-6 content in MC3T3-E1 cell culture media (* P < 0.05 vs. CON)
3 讨论
在地球表面，重力对维持骨的结构和功能具有重要的作用，重力缺失会导致骨组织大量流失，影响骨细胞的增殖、分化与凋亡，进而影响骨代谢与骨重建过程。Frost[16]的“应力-稳态理论”指出，骨组织在生长发育过程中，其形状、质量、结构、功能均受其所处的力学环境影响，并发生适应性改变。大量研究证明[17-23]，微重力环境下骨组织会严重流失，重力缺失所致宇航员骨质流失的量每月可高达 2%，相当于绝经期妇女由雌激素缺乏导致骨流失一年的量；失重还会使机体骨密度降低，骨质变稀薄，发生骨质疏松的概率增大；微重力条件下间充质干细胞向成骨分化、成骨细胞周期转化、成骨分化及活性均受到抑制，且破骨细胞功能显著增强。
成骨细胞由间充质干细胞分化而来，主要存在于骨组织（松质骨与皮质骨）表面，是骨组织感受力学刺激后作出响应的重要效应器之一。在本研究中，MC3T3-E1 细胞是小鼠源成骨贴壁细胞，不能直接在旋转培养系统的细胞培养器中旋转培养，需要附着于特定的微载体上才能悬浮生长。本研究选用的 Cytodex 3 是一种针对旋转培养细胞贴壁用微载体，其表面在交联葡聚糖基架上化学偶联了一层变性胶原，可以使 MC3T3-E1 较好地贴壁生长（见图 1）；当 RCCS 旋转速度达到匀速 20 r/min 时，由于细胞在一个不断变化的重力场中来不及对重力做出响应，因此可以很好地模拟失重环境。
ALP、OCN、CoL-Ⅰ是成骨细胞分化的主要标志物，在本研究中，模拟微重力培养成骨细胞 3 d 后，相比对照组，它们的表达明显下调，说明微重力条件下成骨细胞的分化受到抑制。BMPs 是转化生长因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的一员，该信号通路非常复杂，有多种蛋白分子参与信号传递过程[24]，其中 BMP-2、BMP-4 在骨形成与分化中发挥着重要的作用。细胞内 BMPs 信号的传递主要通过 Smad 蛋白完成，Smad 1 和 Smad 5 是传递 BMP-2 和 BMP-4 信号的重要信号分子，活化的 Smad 1 和 Smad 5 蛋白在 Smad 4 的协同作用下进入细胞核调节成骨细胞分化相关基因的表达[25]。模拟微重力条件下培养后，BMP-4 仅在转录水平发生了改变，蛋白表达水平并没有发生改变，而 BMP-2 不论在基因水平还是蛋白水平与对照组均无显著差异，同时，Smad 1 和 Smad 5 的基因与蛋白的表达水平在实验前后亦未发生显著改变，说明微重力条件下成骨分化的调控与 BMPs 并没有密切的关系。
NF-κB 信号通路主要包括三类：NF-κB、IκB 和 IκB 激酶（IκB kinase，IKK）。一般情况下，NF-κB 与抑制因子以三聚体的状态存在于细胞浆中，并不发挥生物学功能，当有诸如力学载荷、炎症反应、氧化毒物等外界因素刺激时，会使抑制因子从三聚体中游离出来，激活 NF-κB 的活性，进行相关的调控作用。有研究表明，持续激活 NF-κB 会导致多种疾病的发生，如骨关节炎、骨质疏松、骨肌肉营养不良等。Chang 等[9]研究发现当 p65 高表达时，会抑制 Runx 2、ALP、CoL-Ⅰ等成骨关键因子的表达。在切除卵巢的大鼠骨质疏松模型中，能观察到 NF-κB 活化异常，本研究发现，模拟微重力条件下培养细胞后，p-IκB-α、p-p65 磷酸化水平异常增高，说明 NF-κB 活性增强。课题组前期的研究表明[12，14]，生理性动态力学载荷（2 000 με）刺激小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞可激活 NF-κB 信号通路，并促进成骨分化；但是，本研究结果显示，模拟微重力条件下 NF-κB 信号通路同样被激活，却抑制成骨分化。在查阅相关文献后发现，Cazzaniga 等[26]在模拟微重力条件下，收集培养 72 h 后的微血管内皮细胞的培养液（含内皮细胞分泌较高的 IL-6），继续培养人成骨细胞，结果发现成骨细胞活性减弱。在本研究结果中，模拟微重力条件下，存在炎性因子 IL-6 分泌增加的现象，可能与前述中“细胞分泌炎性因子→NF-κB 信号通路活化→促进炎性因子分泌”的正反馈有关，导致 NF-κB 信号通路的持续激活，进而抑制成骨分化，这与上述研究结果相一致；而力学载荷刺激 NF-κB 信号通路激活促进成骨分化的原因是 NF-κB 信号通路与 p38MAPK 信号通路存在“cross-talk”，共同调控 BMPs，进而促进成骨分化。在本研究中，模拟微重力条件下，BMPs 表达水平无显著变化，因此可以推测出生理性力学载荷与模拟微重力条件下通过激活 NF-κB 信号通路对成骨分化的调控，属于不同的机制，后者可能是由于持续的炎性刺激导致 NF-κB 信号异常活化，从而抑制成骨分化。
综上所述，本研究提示在微重力条件下成骨细胞炎性因子 IL-6 增多，p65 蛋白表达及磷酸化水平升高，导致 NF-κB 通路异常活化，进而抑制成骨细胞的分化，这预示着 NF-κB 通路或许可以作为预防或临床治疗失重性骨质疏松/废用性骨质疏松潜在的靶标。
引言
骨骼是支撑和维持人类基本活动的重要器官之一，力学载荷在保持骨量和骨的完整性方面具有重要的作用。研究表明，骨组织对力学环境的改变极为敏感，能对环境的变化做出相应的改变来体现出自身的力学适应性[1-2]。随着航空航天技术的不断发展，空间飞行和长期的太空探索亦愈加频繁，然而来自太空复杂多变的环境诸如真空、极端温度、太空垃圾、宇宙射线和失重等是制约人类长期太空作业的重要原因[3]；近年来已证实太空飞行会造成机体的骨骼系统、心血管系统、肌肉系统以及免疫系统等不同程度的损害，尤其以骨骼系统损伤为重[4-6]。研究表明，骨骼系统在机体离开微重力环境到达地球表面后仍会继续产生病理性变化，微观方面主要表现在骨组织细胞结构和功能的破坏，宏观方面主要是股骨、脊柱等承重骨的骨质流失、骨脆性增加、骨折罹患率增高等。这些危害对太空作业人员的身体健康构成了严重的威胁，并影响太空任务圆满完成以及航天员返回地球再适应的能力。然而，目前对于失重环境下骨丢失的具体分子机制以及细胞间相互作用机制尚不完全清楚。
核因子 kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）在免疫炎症反应、细胞增殖、肿瘤的发生过程中起到至关重要的作用[7-8]。到目前为止，该家族共发现了 NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、Rel A（p65）、Rel B、cRel 共 5 种蛋白；其中，p50 与 p50、p52 与 p52 以及 p65 和 p50 可形成同源二聚体和异源二聚体，而且在该家族中，p65 与 p50 形成的异源二聚体数量最多，通常也用以代指 NF-κB。研究发现在 NF-κB 信号通路中，p65 的高表达会抑制多种成骨性相关基因的表达和细胞矿化[9]；另有研究表明[10-11]，抑制 NF-κB 信号通路活性可预防由雌激素缺乏导致的骨丢失，在发生雌激素缺乏型骨质疏松时，会形成“细胞分泌炎性因子→NF-κB 信号通路活化→促进炎性因子分泌”循环，最终 NF-κB 异常活化，抑制骨的形成。本课题组[12]前期研究表明，NF-κB 信号通路可以经力学刺激激活，Wang 等发现，对 MC3T3-E1 细胞施加 2 000 με 应变，可以激活 NF-κB 通路，促进成骨作用，可能是与 P38MAPK 信号通路共同作用于骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）有关。以上研究由于细胞的种类、研究因素等不同，NF-κB 信号通路的激活/抑制对骨组织代谢的影响也不尽相同，甚至出现了相反的结果，但可以肯定的是，力学环境的改变可以导致 NF-κB 信号通路的异常改变。
现有的研究发现 NF-κB 在骨组织形成与吸收过程中发挥着重要的作用，并可以对力学刺激进行响应，但其在失重环境下对骨组织细胞的代谢机制还尚未清楚。目前已知微重力环境下成骨分化会受到抑制，但是，微重力环境下 NF-κB 信号通路的变化是正向还是负向仍需进一步了解。在本研究中，我们主要探讨微重力环境下 NF-κB 信号通路对成骨细胞的力学信号响应机制，以深入了解 NF-κB 在微重力环境下对成骨细胞分化的调节作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
MC3T3-E1 细胞系由协和医科大学基础医学研究所提供，本实验室冻存。α-MEM 培养液、优级胎牛血清、0.25% 胰酶+EDTA 购于美国 Gibco 公司。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。PCR 引物购于生工生物工程（上海）股份有限公司。SYBR Premix Ex TaqTM II、TrizoL 购于日本 Takara 公司。High-capacity cDNA reverse transcription kits 购于美国 Invitrogen 公司。骨钙素（osteocalcin，OCN）、一型胶原（type Ⅰ collagen，CoL-Ⅰ）、骨形态发生蛋白 2 和 4（BMP-2，BMP-4）、Smad 1、Smad 5 等一抗购于美国 Santa Cruz 公司，二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。BCA 蛋白提取试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。干扰素 6（interleukin 6，IL-6）Elisa 试剂盒购于武汉默沙克生物科技有限公司。Cytodex 3 微载体购于美国 GE Healthcare 公司。旋转培养系统（rotary cell culture systems，RCCS）购于美国 Cell Tech 公司。
1.2 微重力环境建立
将复苏后的 MC3T3-E1 细胞按 1 × 105密度接种于 25 cm2 细胞培养瓶中，置于 5% CO2、37℃ 的恒温培养箱中培养，每 2 d 换液，待细胞铺满培养瓶底部 80%～90% 进行传代。
按操作说明书对 Cytodex 3 微载体及旋转培养系统进行预处理，将细胞按 1 × 105/mL 的密度接种于旋转培养系统内，而后陆续加入 5 mL 微载体溶液（5 mg/mL）、5 mL 优级胎牛血清，最后加入新鲜培养基（无血清和双抗）灌满，用注射器将系统内气泡排尽，以 20 r/min 转速匀速培养 3 d；期间若发现有气泡产生，立即将气泡赶尽；对照组置于细胞培养瓶中常规培养。
1.3 细胞获取
对照组（CON）：细胞培养 3 d 后，0.25% 的胰酶室温消化 2～3 min，加等量培养液终止消化，用移液枪轻轻吹打数次，将所有液体转入新的离心管中，1 000 r/min 离心 5 min 弃上清，再加入 1 mL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）轻轻吹打，再次离心，收集细胞。
微重力组（SMG）：微重力培养期满后，将旋转系统中细胞转移至 50 mL 离心管中以 1 000 r/min 离心 5 min，PBS 洗涤 2 次，收集微载体于 10 mL 离心管中，加入 3～5 mL 胰酶，反复吹打消化 5～10 min 后，加入 2 倍胰酶体积的培养液终止消化，用 200 目滤网过滤收集液体，而后以 1 000 r/min 离心 5 min，收集细胞。
1.4 扫描电镜观察 MC3T3-E1 细胞与微载体贴附生长情况
收集 SMG 组培养期满的细胞-微载体复合体及空白微载体，1 000 r/min 离心 5 min 弃上清，预冷的 PBS 清洗 3 次，再次离心，去上清，加入适量 2.5% 戊二醛 4℃ 过夜固定，弃上清，PBS 清洗 3 次，1% 锇酸常温固定 1 h，PBS 清洗 3 次，按照 30%、50%、75%、95%、100% 体积浓度的乙醇进行梯度脱水，临界点干燥仪中进行临界点干燥，最后进行 Pt 表面镀膜，置于扫描电镜下观察。
1.5 碱性磷酸酶活性检测
在收集的细胞中加入 0.5 mL 的 PBS 缓冲液，保证超声探头在液面以下，设置功率 300 W，冰水浴状态下进行蛋白超声裂解，每次超声 5 s，间隔 4 次，每次间隔时间为 30 s，BCA 方法将蛋白定量，按操作表将各试剂加入到 96 孔板，520 nm 处波长酶标仪测定各孔吸光度。
1.6 real-time PCR 检测成骨相关基因表达水平变化
收集各组细胞，用预冷的 PBS 清洗 3 次后加入 1 mL TrizoL 冰上充分裂解细胞，酚氯仿法提取细胞总 RNA，通过 OD260/280 计算 RNA 的纯度与浓度，将 RNA 浓度定量到 1 μg/μL。用 High-capacity cDNA reverse transcription kits 将 RNA 体系在 70℃ 10 min、37℃ 30 min、95℃ 5 min 逆转录成 cDNA，以 cDNA 为模板采用实时荧光定量 PCR 分别检测 ALP、OCN、COL-Ⅰ、BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 的基因表达水平（每个基因设置三次生物学重复）。引物序列见表 1。总反应体系为 25 μL：cDNA（稀释 20 倍）2.5 μL，Primer-F（10 mmol/L）1 μL，Primer-R（10 mmol/L）1 μL，SYBR® Premix Ex TaqTM II 12.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR 循环反应为：95℃ 预变性 10 min，95℃ 变性 15 s、60℃ 退火 1 min、72℃ 延伸 15 s 共 40 个循环，72℃ 终延伸 5 min。各组结果采用 法[13]将对照组与 β-actin 标准化后进行比较。
表1
引物序列
Table1.
Sequences of primer used in this study
1.7 Western-blot 检测成骨相关蛋白表达水平变化
收集各组细胞，BCA 法提取并定量细胞蛋白，取定量后蛋白 30 μg，加入 5 × 上样缓冲液，沸水中煮 10 min，而后将样品加入含有配制好的含 10% 分离胶与 5% 浓缩胶的电泳系统内跑胶；切胶并转膜；转膜结束后，将聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜放入封闭袋中与 5% 脱脂奶粉室温下反应 1 h；封闭后的 PVDF 膜分别与兔抗 OCN、COL-Ⅰ、BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 等一抗（1∶500 稀释）4℃ 孵育过夜；取出 PVDF 膜，PBST 洗涤 5 次，与山羊抗兔的二抗（1∶5 000 稀释）常温孵育 1 h，PBST 洗涤 5 次；加入显影发光液，暗室显影定影，取出胶片应用 Image J 软件分析结果。
1.8 Elisa 检测 IL-6 含量变化
无菌管收集各组细胞培养上清液，2 000 r/min 离心 20 min，收集上清液，按说明书加入各组分，并执行相关步骤，450 nm 处波长测各组分 OD 值。
1.9 统计分析
实验数据均用均值 ± 标准差表示，采用单因素方差分析，P < 0.05 表示差异具有统计学意义，每组数据来源至少为 3 次独立实验结果。
2 结果
2.1 模拟微重力环境下细胞与微载体的贴附结果
MC3T3-E1 细胞与微载体贴附效率较高，一般情况下，旋转培养 12 h 内可完成较理想的贴附，而后随着时间增长，微载体表面的细胞会不断增殖。如图 1 所示，结果表明在模拟微重力环境下，MC3T3-E1 细胞能较好地贴附在微载体上，且生长状态良好。
图1
扫描电镜下不同倍数细胞贴附微载体结果图
Figure1.
The image of cell-microcarriers with scanning electron microscope in different magnification
2.2 模拟微重力对 MC3T3-E1 细胞成骨相关性基因和蛋白的表达水平影响
ALP、OCN、CoL-Ⅰ是反映成骨活性的主要标志性基因，为了验证微重力环境下这些成骨相关性基因和蛋白是否表达下调，我们检测了这些基因的表达。结果表明微重力培养成骨细胞 3 d 后，ALP、OCN 和 COL-Ⅰ基因的 mRNA 水平显著下调（见图 2a），ALP 活性检测及 western blot 结果显示蛋白水平的表达与 mRNA 改变相一致（见图 2b、2c）。
图2
模拟微重力环境对成骨细胞成骨相关蛋白和基因的影响
a. qRT-PCR 检测 ALP、OCN、CoL-Ⅰ mRNA 水平；b. Elisa 检测 MC3T3-E1 成骨细胞 ALP 活性；c. western blot 检测 OCN、CoL-Ⅰ蛋白表达水平。* 与 CON 组比较，
a. the expression of ALP, OCN and CoL-Ⅰ mRNA were investigated using qRT-PCR; b. the MC3T3-E1 cell ALP activity was measured using Elisa kits; c. the expression of OCN and CoL-Ⅰ protein were detected by western blot. *
2.3 模拟微重力环境下对 BMP/Smad 通路的调控
在前期的研究发现[12]，生理性动态力学载荷（2 000 με）能激活 NF-κB 信号通路，调节 BMPs，进而通过经典的 Smad 通路促进成骨分化。在本研究中，为了观察 BMPs 是否也对模拟微重力有相应的力学响应机制，我们检测了细胞在模拟微重力培养 3 d 后 BMP-2、BMP-4 的表达，如图 3 所示。与对照组相比，SMG 组 BMP-2 基因表达水平和蛋白表达水平无显著变化，BMP-4 的基因表达水平下调（见图 3a），但是蛋白表达水平无明显变化（见图 3b），说明 BMP-4 仅在转录水平发生了改变。为了明确 BMP-2、BMP-4 对微重力环境的力学响应，并确认 BMP-2、BMP-4 是否通过 Smads 蛋白对成骨分化进行调节，我们检测了 Smad 1、Smad 5 基因和蛋白表达水平的变化，结果显示 Smad 1、Smad 5 无论在基因表达水平还是蛋白表达水平与对照组相比均无显著差异（见图 3）。因此，在模拟微重力条件下，成骨细胞的分化并不是通过 BMPs 来调控的。
图3
模拟微重力环境对 BMP/Smad 信号通路的影响
a. qRT-PCR 检测 BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 mRNA 水平；b. western blot 检测 BMP-2、BMP-4、Smad 1、Smad 5 蛋白表达水平。* 与 CON 组比较，
a. the expression of BMP-2, BMP-4, Smad 1 and Smad 5 mRNA were investigated using qRT-PCR; b. the expression of BMP-2, BMP-4, Smad 1 and Smad 5 protein were detected by western blot. *
2.4 NF-κB 信号通路对模拟微重力的响应
为了观察微重力环境下成骨细胞的分化是否与 NF-κB 信号通路相关，我们检测了微重力培养后的成骨细胞与 NF-κB 信号通路相关的信号分子变化，如 NF-κB 抑制蛋白（inhibitory nuclear factor-kappa B，IκB）α（IκB-α）及 p65 的蛋白总量变化及其磷酸化水平，来确定 NF-κB 信号通路是否激活或抑制。课题组前期实验表明 NF-κB 信号通路在给予力学刺激后，在 30 min 时被激活，并在 60 min 时达到最高峰[12，14-15]。因此本次实验在微重力培养成骨细胞 60 min 时检测了 IκB-α 及 p65 的磷酸化水平。结果如图 4 所示，微重力条件下，IκB-α 蛋白表达水平降低，磷酸化水平升高；p65 总蛋白表达显著上调，磷酸化水平亦显著升高。上述结果表明，微重力条件下 NF-κB 信号通路活性增强。
图4
western blot 检测模拟微重力对 NF-κB 信号分子 IκB-α、p65 蛋白及其磷酸化的影响
* 0 min 与 60 min 比较，
the expression of IκB-α, p65, p-IκB-α, p-p65 protein were detected by western blot. * 0 min
2.5 模拟微重力条件下细胞炎性因子 IL-6 的表达情况
为了深入了解 NF-κB 信号通路活性增强的原因，我们检测了细胞分泌炎性因子的情况，结果如图 5 所示，细胞在模拟微重力条件下培养 3 d 后，MC3T3-E1 细胞分泌的炎性因子 IL-6 显著增多。
图5
模拟微重力对 MC3T3-E1 细胞分泌 IL-6 的影响（* 与 CON 组比较，P < 0.05）
Figure5.
Effect of microgravity on IL-6 content in MC3T3-E1 cell culture media (* P < 0.05 vs. CON)
3 讨论
在地球表面，重力对维持骨的结构和功能具有重要的作用，重力缺失会导致骨组织大量流失，影响骨细胞的增殖、分化与凋亡，进而影响骨代谢与骨重建过程。Frost[16]的“应力-稳态理论”指出，骨组织在生长发育过程中，其形状、质量、结构、功能均受其所处的力学环境影响，并发生适应性改变。大量研究证明[17-23]，微重力环境下骨组织会严重流失，重力缺失所致宇航员骨质流失的量每月可高达 2%，相当于绝经期妇女由雌激素缺乏导致骨流失一年的量；失重还会使机体骨密度降低，骨质变稀薄，发生骨质疏松的概率增大；微重力条件下间充质干细胞向成骨分化、成骨细胞周期转化、成骨分化及活性均受到抑制，且破骨细胞功能显著增强。
成骨细胞由间充质干细胞分化而来，主要存在于骨组织（松质骨与皮质骨）表面，是骨组织感受力学刺激后作出响应的重要效应器之一。在本研究中，MC3T3-E1 细胞是小鼠源成骨贴壁细胞，不能直接在旋转培养系统的细胞培养器中旋转培养，需要附着于特定的微载体上才能悬浮生长。本研究选用的 Cytodex 3 是一种针对旋转培养细胞贴壁用微载体，其表面在交联葡聚糖基架上化学偶联了一层变性胶原，可以使 MC3T3-E1 较好地贴壁生长（见图 1）；当 RCCS 旋转速度达到匀速 20 r/min 时，由于细胞在一个不断变化的重力场中来不及对重力做出响应，因此可以很好地模拟失重环境。
ALP、OCN、CoL-Ⅰ是成骨细胞分化的主要标志物，在本研究中，模拟微重力培养成骨细胞 3 d 后，相比对照组，它们的表达明显下调，说明微重力条件下成骨细胞的分化受到抑制。BMPs 是转化生长因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的一员，该信号通路非常复杂，有多种蛋白分子参与信号传递过程[24]，其中 BMP-2、BMP-4 在骨形成与分化中发挥着重要的作用。细胞内 BMPs 信号的传递主要通过 Smad 蛋白完成，Smad 1 和 Smad 5 是传递 BMP-2 和 BMP-4 信号的重要信号分子，活化的 Smad 1 和 Smad 5 蛋白在 Smad 4 的协同作用下进入细胞核调节成骨细胞分化相关基因的表达[25]。模拟微重力条件下培养后，BMP-4 仅在转录水平发生了改变，蛋白表达水平并没有发生改变，而 BMP-2 不论在基因水平还是蛋白水平与对照组均无显著差异，同时，Smad 1 和 Smad 5 的基因与蛋白的表达水平在实验前后亦未发生显著改变，说明微重力条件下成骨分化的调控与 BMPs 并没有密切的关系。
NF-κB 信号通路主要包括三类：NF-κB、IκB 和 IκB 激酶（IκB kinase，IKK）。一般情况下，NF-κB 与抑制因子以三聚体的状态存在于细胞浆中，并不发挥生物学功能，当有诸如力学载荷、炎症反应、氧化毒物等外界因素刺激时，会使抑制因子从三聚体中游离出来，激活 NF-κB 的活性，进行相关的调控作用。有研究表明，持续激活 NF-κB 会导致多种疾病的发生，如骨关节炎、骨质疏松、骨肌肉营养不良等。Chang 等[9]研究发现当 p65 高表达时，会抑制 Runx 2、ALP、CoL-Ⅰ等成骨关键因子的表达。在切除卵巢的大鼠骨质疏松模型中，能观察到 NF-κB 活化异常，本研究发现，模拟微重力条件下培养细胞后，p-IκB-α、p-p65 磷酸化水平异常增高，说明 NF-κB 活性增强。课题组前期的研究表明[12，14]，生理性动态力学载荷（2 000 με）刺激小鼠 MC3T3-E1 成骨细胞可激活 NF-κB 信号通路，并促进成骨分化；但是，本研究结果显示，模拟微重力条件下 NF-κB 信号通路同样被激活，却抑制成骨分化。在查阅相关文献后发现，Cazzaniga 等[26]在模拟微重力条件下，收集培养 72 h 后的微血管内皮细胞的培养液（含内皮细胞分泌较高的 IL-6），继续培养人成骨细胞，结果发现成骨细胞活性减弱。在本研究结果中，模拟微重力条件下，存在炎性因子 IL-6 分泌增加的现象，可能与前述中“细胞分泌炎性因子→NF-κB 信号通路活化→促进炎性因子分泌”的正反馈有关，导致 NF-κB 信号通路的持续激活，进而抑制成骨分化，这与上述研究结果相一致；而力学载荷刺激 NF-κB 信号通路激活促进成骨分化的原因是 NF-κB 信号通路与 p38MAPK 信号通路存在“cross-talk”，共同调控 BMPs，进而促进成骨分化。在本研究中，模拟微重力条件下，BMPs 表达水平无显著变化，因此可以推测出生理性力学载荷与模拟微重力条件下通过激活 NF-κB 信号通路对成骨分化的调控，属于不同的机制，后者可能是由于持续的炎性刺激导致 NF-κB 信号异常活化，从而抑制成骨分化。
综上所述，本研究提示在微重力条件下成骨细胞炎性因子 IL-6 增多，p65 蛋白表达及磷酸化水平升高，导致 NF-κB 通路异常活化，进而抑制成骨细胞的分化，这预示着 NF-κB 通路或许可以作为预防或临床治疗失重性骨质疏松/废用性骨质疏松潜在的靶标。
