本文为研究 Snail1 基因对喉鳞癌细胞株 Hep-2 紧密连接蛋白表达及迁移能力的影响，将含有 Snail1 基因的短发夹 RNA（Sh-RNA）的质粒转染喉鳞癌细胞株 Hep-2，培养出可稳定传代的 Snail1 基因沉默的细胞（命名为 Sh-snail1 细胞）。课题组以蛋白免疫印迹技术检测紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表达是否发生变化。然后设计伤口愈合实验检测其迁移能力，再以蛋白免疫印迹技术检测与细胞迁移能力密切相关的 RhoGTP 酶家族重要成员 RhoA、Cdc42 蛋白的表达变化。结果表明，Sh-snail1 细胞紧密连接关键蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表达明显上调，迁移能力明显减弱，且 RhoA、Cdc42 蛋白表达下调。该研究表明，喉鳞癌 Hep-2 细胞通过下调 Snail1 基因的表达使细胞间连接更加紧密，同时抑制 Hep-2 细胞的迁移能力，下调 RhoA、Cdc42 蛋白的表达。本文研究结果证实，Snail1 基因与 Hep-2 细胞转移过程中的细胞间紧密连接打开以及细胞迁移能力增强密切相关，为靶向治疗喉鳞癌提供分子机制的研究依据。
引用本文： 刘双凤, 沈阳, 冯唐, 刘肖珩. Snail1 基因沉默对喉鳞癌 Hep-2 细胞紧密连接蛋白表达及迁移能力的影响 . 生物医学工程学杂志, 2017, 34(4): 591-596. doi: 10.7507/1001-5515.201702005 复制
引言
喉部鳞状细胞癌（简称：喉鳞癌）是喉颈部最常见的恶性肿瘤，其发病率逐年上升。随着医疗技术的发展，喉鳞癌的预后有所改善，但是 5 年生存率仍仅有 60% 左右[1]。喉鳞癌是否发生转移是决定预后的重要指标[2]。由于癌细胞转移的机制非常复杂，但其细胞间连接打开及细胞迁移速度加快是转移的必要步骤，有效阻断该过程对肿瘤的治疗非常必要。
研究表明，转录因子 Snail1 在包括喉鳞癌在内的多种恶性肿瘤组织中高表达[3]，癌细胞中高表达的转录因子 Snail1 可以促进癌细胞迁移[4-5]，但目前国内在 Snail1 基因对细胞间连接的影响及其迁移机制方面的研究较少。另一方面，紧密连接是细胞间连接的重要组成部分，主要由闭锁小带（Zonula occludens-1，ZO-1）、咬合蛋白（Occludin）和闭合蛋白（Claudin）组成，它们避免了细胞表面的顶端和底端膜蛋白的紊乱，作为栅栏或屏障维持上皮细胞的极性[6]。文献报道，RhoGTP 酶超家族是肌动蛋白细胞骨架的重要调节因子，与细胞运动密切相关，至少由 14 个亚族组成，其中 RhoA 和 Cdc42 是 RhoGTP 酶的核心成员[7]。RhoA 和 Cdc42 可直接触发并参与肌动蛋白组装形成细胞的应力纤维和丝状伪足，并可进一步通过调节细胞骨架蛋白、膜运动和细胞黏附促使细胞运动[8]。
RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术，是将与目的基因 mRNA 关键位点序列一致的小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）或短发卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）导入细胞内，引起目的基因 mRNA 降解，从而促使基因沉默，相应蛋白表达下调。shRNA 是一段具有紧密发卡环的 RNA 序列，通过质粒等载体导入细胞内后可被传递到子代细胞中，在细胞内持续生成 siRNA，使目的基因持续沉默。为进一步研究阻断 Snail1 基因对喉鳞癌细胞的细胞间连接及癌细胞迁移的影响，我们将装载有 Snail1 基因 shRNA 的质粒转入喉鳞癌细胞株 Hep-2 细胞中，筛选并培养出可稳定传代的 Snail1 基因表达下调的 Hep-2 细胞，命名为 Sh-snail 细胞，观察其对喉鳞癌细胞间紧密连接主要成分 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白表达的影响，以及对喉鳞癌细胞迁移能力、迁移相关蛋白 RhoA 和 Cdc42 蛋白表达的调控作用，进一步为喉鳞癌患者靶向治疗提供分子机制的研究依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株来源
人喉鳞癌细胞株 Hep-2 购自中国科学院细胞库（目录号：TCHu21）。
1.2 仪器与试剂
装载有 Snail 基因 shRNA 的质粒由美国 Genecoperia 公司构建，质粒转染试剂盒、RNA 提取试剂盒、定量反转录试剂盒、荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒均购买于德国 QIAGEN 公司；Snail1 抗体、ZO-1 抗体、Occludin 抗体、Claudin-5 抗体、Cdc42 抗体、RhoA 抗体均购自美国 Santa Cruz 公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京鼎国生物科技有限公司；Western blot 及细胞培养常规试剂均购自上海碧云天生物科技有限公司；CK2 型倒置相差显微镜购自日本 Olympus 公司；TE2000 型荧光显微镜购自日本 Nikon 公司；酶标仪、蛋白垂直电泳仪、凝胶成像系统购自美国 Bio-Rad 公司。
1.3 研究方法
1.3.1 实验分组 本课题组取对数生长期的 Hep-2 细胞为对照组；同时，为排除质粒自身对 Hep-2 细胞各指标的影响，我们将空载质粒转染入 Hep-2 细胞，设立并命名为 Sh-mock 细胞组；将装载有 Snail1 基因 shRNA 的质粒转入喉鳞癌细胞株 Hep-2 细胞中，筛选并培养出可稳定传代的 Snail1 基因表达下调的 Hep-2 细胞，命名为 Sh-snail1 细胞，作为实验组。
1.3.2 培养稳定转染的 Sh-snail1 细胞及 Sh-mock 细胞 将对数生长期的 Hep-2 细胞种于 6 孔板中，高糖杜氏改良培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）（含 10% 胎牛血清）培养细胞长至 80% 融合度时（37℃，5%CO2），加入装载有 Snail1 基因 shRNA 的质粒（靶序列为 GAGTAAT GGCTGTCACTTG）或空载质粒（靶序列为 GCTT CGCGCCGTAGTCTTA）、质粒转染试剂（QIAGEN 公司的一种非脂质体高效脂类转染试剂）、培养液混合液等。转染 24 h 后，加入含 0.4 μg/mL 嘌呤霉素的 DMEM 高糖培养基，于 37℃，5%CO2 条件下培养，至稳定转染的细胞簇形成。胰蛋白酶消化并收集 Sh-snail1 细胞及 Sh-mock 细胞，移入培养瓶中，再以 0.2 μg/mL 嘌呤霉素的 DMEM 高糖培养基培养至 2 种细胞各自生长融合达 100%，备用。
1.3.3 荧光定量 PCR 定量检测 Snail1 mRNA 表达水平 分别对 Hep-2 细胞（对照组）、Sh-mock 细胞、Sh-snail1 细胞进行总 RNA 提取，根据说明书将 RNA 逆转录合成 cDNA。采用 SYBR Green 荧光染料法，取 2 μL 反转录产物扩增合成 Snail mRNA 基因片段。引物参照文献[9]设计，委托四川甲骨基因科技有限公司合成。GAPDH 为内参，所用引物序列分别为：Snail1 上游引物：5’-TATGCTGCCT TCCCAGGCTTG-3’；Snail1 下游引物：5’-ATGTGCATCTTGAGGGCACCC-3’。GAPDH 上游引物：5’-GGCGTTTTGCAATGCAGATGTAG-3’；GAPDH 下游引物：5’-CACAGGAGCCG TCACTTCTCTTG-3’。PCR 条件：95.0℃ 变性 3 min，再按下列热循环参数：95.0℃ 下 10 s，57.0℃ 下 30 s、72.0℃ 下 30 s，共 40 个循环。从荧光定量 PCR 动力学曲线中判读荧光阈值循环数（cycle threshod，Ct）值，计算∆∆Ct，∆∆Ct=[未知样品 Ct 值–GAPDH 的 Ct 值]–[校正样品 Ct 值–校正样品 GAPDH 的 Ct 值]，根据 2–∆∆Ct 计算相对表达量，每组重复三次，利用数据分析作图软件 Origin8.0 计算出均值及标准差，并汇出柱状图。
1.3.4 Western blot 检测蛋白表达水平 Hep-2 细胞、Sh-mock 细胞、Sh-snail1 细胞于细胞培养瓶中培养至细胞融合度达 100%，加入细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂），裂解后用细胞刮子刮取细胞，震荡后离心取上清，采用 2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。蛋白每孔上样 50 μg 后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。电泳结束后取胶，并将胶上的蛋白湿转至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。分别于膜上孵育一抗，4℃ 过夜；然后以磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后孵育二抗，室温下处理 1 h；漂洗后，滴加电化学发光曝光液，凝胶成像系统中曝光，再采用图像处理软件 Image J 进行灰度分析，将目的条带与内参的比值作为半定量指标，用 Origin8.0 分析数据并汇出柱状图。
1.3.5 伤口愈合实验 将 Hep-2 细胞、Sh-mock 细胞、Sh-snail1 细胞种于 6 孔板中，当细胞融合度达 90% 时，用无血清 DMEM 培养基培养过夜，用 100 μL 的枪头在单层细胞上做“十”字形划痕。PBS 清洗 3 次。分别于 0 h、24 h，在倒置显微镜下拍照。
1.3.6 统计学处理 上述实验采用 SPSS17.0 软件进行单因素方差分析或 t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 稳定转染的 Hep-2 细胞 Snail1 mRNA 及 Snail1 蛋白表达情况
2.1.1 荧光定量 PCR 验证 Sh-snail1 细胞 Snail1 基因的 mRNA 表达情况 荧光定量 PCR 检测对照组细胞、Sh-mock 细胞及 Sh-snail1 细胞 Snail1 基因的 mRNA 表达情况。结果证实，Sh-snail1 细胞 Snail1 mRNA 水平明显低于对照组，干扰后 Snail1 mRNA 下调（P<0.05）。而 Sh-mock 细胞组与对照组相比，Snail1 mRNA 的表达量差异没有统计学意义（P>0.05），如图 1 所示。
图1
PCR 检测 Snail1 基因沉默效率（n=3）
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2.1.2 Western blot 验证 Sh-snail1 细胞 Snail1 蛋白表达情况 Western blot 检测对照组、Sh-mock 组及 Sh-snail1 细胞 Snail1 蛋白表达情况。如图 2 所示，Sh-snail1 细胞的 Snail1 蛋白水平明显低于对照组，说明 Sh-snail1 细胞的 Snail1 基因表达被成功干扰，与对照组相比，Snail1 蛋白表达下降的差异存在统计学意义（P<0.05）。而 Sh-mock 组与对照组的 Snail1 蛋白表达水平的差异没有统计学意义（P>0.05）。
图2
Western blot 检测 Snail1 基因沉默效率（n=3）
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2.2 Snail1 基因沉默对 Hep-2 细胞紧密连接相关蛋白的影响
本文采用 Western blot 技术检测 Snail1 基因沉默对 3 组细胞的 ZO-1、Occludin，Claudin-5 蛋白表达的影响。如图 3 所示，Sh-snail1 细胞的 ZO-1、Occludin，Claudin-5 蛋白表达水平均明显高于对照组（P<0.05）。而 Sh-mock 组与对照组相比，ZO-1、Occludin，Claudin-5 蛋白水平差异没有统计学意义（P>0.05）。
图3
Snail1 基因沉默后紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表达变化（n=3）
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2.3 Snail1 基因沉默对 Hep-2 细胞迁移能力的影响
本文的伤口愈合实验是为了研究 Snail1 基因沉默后 Sh-snail1 细胞的迁移能力。我们分别将对照组、Sh-mock 细胞、Sh-snail1 细胞做标准化划痕处理，24 h 后倒置显微镜下观察细胞迁移距离。如图 4 所示，Sh-snail1 细胞 24 h 迁移距离明显小于对照组（P<0.05），证实 Sh-snail1 细胞迁能力明显减弱。Sh-mock 细胞 24 h 迁移距离与对照组的差异无统计学意义（P>0.05）。
图4
Snail1 基因沉默对 Hep-2 细胞迁移能力的影响（n=3）
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2.4 Snail1 基因沉默对 Hep-2 细胞迁移相关蛋白 RhoA 和 Cdc42 表达的影响
RhoGTP 酶在细胞迁移中发挥重要作用，RhoA 蛋白和 Cdc42 蛋白是其重要组成成分。本文以 Western blot 技术检测 RhoA 蛋白和 Cdc42 蛋白在 3 组细胞中的表达，发现 Snail1 基因沉默后，Sh-snail1 细胞的 RhoA 蛋白和 Cdc42 蛋白水平明显下调，低于对照组（P<0.05）。而 Sh-mock 组与对照组相比，RhoA 和 Cdc42 蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），如图 5 所示。
图5
Snail1 基因沉默后 RhoA 和 Cdc42 的表达变化（n=3）
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3 讨论
Occludins、Claudins 和连接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs），3 种蛋白形成紧密连接的顶端和底端区域。ZO-1 在紧密连接中起中枢作用，调控紧密连接的组装。各种紧密连接蛋白的稳定表达避免了细胞表面的顶端和底端膜蛋白的紊乱，它们作为栅栏或屏障维持上皮细胞的极性[10]。在本研究中，Snail1 基因的沉默上调了 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表达，使 Hep-2 细胞间连接变得更加紧密，有利于维持细胞形态及极性不变。
RhoGTP 酶超家族在细胞运动中起着非常重要的作用。它们可参与调节肌动蛋白动力和控制肌动蛋白重组，其中 RhoA 可促进肌动蛋白应力纤维的形成，Cdc42 则主要促进丝状伪足的形成[11]。另外，Cdc42 可直接激活 p21 激活激酶 1（p21 activated kinase，PAK1）参与细胞运动[12]。我们在实验中发现 Sh-snail1 细胞的 RhoA 和 Cdc42 表达减弱，说明阻断 Snail1 基因表达可下调 RhoA 和 Cdc42，这极有可能是 Snail1 基因沉默导致细胞迁移能力减弱的重要原因。
Snail 家族成员作为锌指转录因子参与胚胎发育等多种机体发育过程，其家族成员 Snail1 蛋白在哺乳动物的发育早期非常重要[13]，大量研究证实转录因子 Snail1 通过下调 E-cad 蛋白，促发癌细胞由上皮样细胞转化为间充质样细胞（epithelial-mesenchymal transition，EMT），从而促进肿瘤细胞转移[14]。可是对于 Snail1 蛋白与紧密连接蛋白和 RhoGTP 酶超家族之间的关系研究较少。由于细胞紧密间连接的打开和细胞迁移速度的加快是细胞迁移的必要因素，我们的研究初步阐明了抑制 Snail1 基因的表达可以上调紧密连接关键蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白表达水平；同时可以下调 RhoA 和 Cdc42 并抑制 Hep-2 细胞的迁移，从而减弱癌细胞的转移能力。因此，本文研究结果证实 Snail1 基因与 Hep-2 细胞转移过程中的细胞间紧密连接打开、细胞迁移能力增强密切相关，为进一步证实 Snail1 基因作为预防肿瘤发展转移的重要靶点提供分子机制的研究依据。
引言
喉部鳞状细胞癌（简称：喉鳞癌）是喉颈部最常见的恶性肿瘤，其发病率逐年上升。随着医疗技术的发展，喉鳞癌的预后有所改善，但是 5 年生存率仍仅有 60% 左右[1]。喉鳞癌是否发生转移是决定预后的重要指标[2]。由于癌细胞转移的机制非常复杂，但其细胞间连接打开及细胞迁移速度加快是转移的必要步骤，有效阻断该过程对肿瘤的治疗非常必要。
研究表明，转录因子 Snail1 在包括喉鳞癌在内的多种恶性肿瘤组织中高表达[3]，癌细胞中高表达的转录因子 Snail1 可以促进癌细胞迁移[4-5]，但目前国内在 Snail1 基因对细胞间连接的影响及其迁移机制方面的研究较少。另一方面，紧密连接是细胞间连接的重要组成部分，主要由闭锁小带（Zonula occludens-1，ZO-1）、咬合蛋白（Occludin）和闭合蛋白（Claudin）组成，它们避免了细胞表面的顶端和底端膜蛋白的紊乱，作为栅栏或屏障维持上皮细胞的极性[6]。文献报道，RhoGTP 酶超家族是肌动蛋白细胞骨架的重要调节因子，与细胞运动密切相关，至少由 14 个亚族组成，其中 RhoA 和 Cdc42 是 RhoGTP 酶的核心成员[7]。RhoA 和 Cdc42 可直接触发并参与肌动蛋白组装形成细胞的应力纤维和丝状伪足，并可进一步通过调节细胞骨架蛋白、膜运动和细胞黏附促使细胞运动[8]。
RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术，是将与目的基因 mRNA 关键位点序列一致的小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）或短发卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）导入细胞内，引起目的基因 mRNA 降解，从而促使基因沉默，相应蛋白表达下调。shRNA 是一段具有紧密发卡环的 RNA 序列，通过质粒等载体导入细胞内后可被传递到子代细胞中，在细胞内持续生成 siRNA，使目的基因持续沉默。为进一步研究阻断 Snail1 基因对喉鳞癌细胞的细胞间连接及癌细胞迁移的影响，我们将装载有 Snail1 基因 shRNA 的质粒转入喉鳞癌细胞株 Hep-2 细胞中，筛选并培养出可稳定传代的 Snail1 基因表达下调的 Hep-2 细胞，命名为 Sh-snail 细胞，观察其对喉鳞癌细胞间紧密连接主要成分 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白表达的影响，以及对喉鳞癌细胞迁移能力、迁移相关蛋白 RhoA 和 Cdc42 蛋白表达的调控作用，进一步为喉鳞癌患者靶向治疗提供分子机制的研究依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株来源
人喉鳞癌细胞株 Hep-2 购自中国科学院细胞库（目录号：TCHu21）。
1.2 仪器与试剂
装载有 Snail 基因 shRNA 的质粒由美国 Genecoperia 公司构建，质粒转染试剂盒、RNA 提取试剂盒、定量反转录试剂盒、荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒均购买于德国 QIAGEN 公司；Snail1 抗体、ZO-1 抗体、Occludin 抗体、Claudin-5 抗体、Cdc42 抗体、RhoA 抗体均购自美国 Santa Cruz 公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京鼎国生物科技有限公司；Western blot 及细胞培养常规试剂均购自上海碧云天生物科技有限公司；CK2 型倒置相差显微镜购自日本 Olympus 公司；TE2000 型荧光显微镜购自日本 Nikon 公司；酶标仪、蛋白垂直电泳仪、凝胶成像系统购自美国 Bio-Rad 公司。
1.3 研究方法
1.3.1 实验分组 本课题组取对数生长期的 Hep-2 细胞为对照组；同时，为排除质粒自身对 Hep-2 细胞各指标的影响，我们将空载质粒转染入 Hep-2 细胞，设立并命名为 Sh-mock 细胞组；将装载有 Snail1 基因 shRNA 的质粒转入喉鳞癌细胞株 Hep-2 细胞中，筛选并培养出可稳定传代的 Snail1 基因表达下调的 Hep-2 细胞，命名为 Sh-snail1 细胞，作为实验组。
1.3.2 培养稳定转染的 Sh-snail1 细胞及 Sh-mock 细胞 将对数生长期的 Hep-2 细胞种于 6 孔板中，高糖杜氏改良培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）（含 10% 胎牛血清）培养细胞长至 80% 融合度时（37℃，5%CO2），加入装载有 Snail1 基因 shRNA 的质粒（靶序列为 GAGTAAT GGCTGTCACTTG）或空载质粒（靶序列为 GCTT CGCGCCGTAGTCTTA）、质粒转染试剂（QIAGEN 公司的一种非脂质体高效脂类转染试剂）、培养液混合液等。转染 24 h 后，加入含 0.4 μg/mL 嘌呤霉素的 DMEM 高糖培养基，于 37℃，5%CO2 条件下培养，至稳定转染的细胞簇形成。胰蛋白酶消化并收集 Sh-snail1 细胞及 Sh-mock 细胞，移入培养瓶中，再以 0.2 μg/mL 嘌呤霉素的 DMEM 高糖培养基培养至 2 种细胞各自生长融合达 100%，备用。
1.3.3 荧光定量 PCR 定量检测 Snail1 mRNA 表达水平 分别对 Hep-2 细胞（对照组）、Sh-mock 细胞、Sh-snail1 细胞进行总 RNA 提取，根据说明书将 RNA 逆转录合成 cDNA。采用 SYBR Green 荧光染料法，取 2 μL 反转录产物扩增合成 Snail mRNA 基因片段。引物参照文献[9]设计，委托四川甲骨基因科技有限公司合成。GAPDH 为内参，所用引物序列分别为：Snail1 上游引物：5’-TATGCTGCCT TCCCAGGCTTG-3’；Snail1 下游引物：5’-ATGTGCATCTTGAGGGCACCC-3’。GAPDH 上游引物：5’-GGCGTTTTGCAATGCAGATGTAG-3’；GAPDH 下游引物：5’-CACAGGAGCCG TCACTTCTCTTG-3’。PCR 条件：95.0℃ 变性 3 min，再按下列热循环参数：95.0℃ 下 10 s，57.0℃ 下 30 s、72.0℃ 下 30 s，共 40 个循环。从荧光定量 PCR 动力学曲线中判读荧光阈值循环数（cycle threshod，Ct）值，计算∆∆Ct，∆∆Ct=[未知样品 Ct 值–GAPDH 的 Ct 值]–[校正样品 Ct 值–校正样品 GAPDH 的 Ct 值]，根据 2–∆∆Ct 计算相对表达量，每组重复三次，利用数据分析作图软件 Origin8.0 计算出均值及标准差，并汇出柱状图。
1.3.4 Western blot 检测蛋白表达水平 Hep-2 细胞、Sh-mock 细胞、Sh-snail1 细胞于细胞培养瓶中培养至细胞融合度达 100%，加入细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂），裂解后用细胞刮子刮取细胞，震荡后离心取上清，采用 2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。蛋白每孔上样 50 μg 后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。电泳结束后取胶，并将胶上的蛋白湿转至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。分别于膜上孵育一抗，4℃ 过夜；然后以磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后孵育二抗，室温下处理 1 h；漂洗后，滴加电化学发光曝光液，凝胶成像系统中曝光，再采用图像处理软件 Image J 进行灰度分析，将目的条带与内参的比值作为半定量指标，用 Origin8.0 分析数据并汇出柱状图。
1.3.5 伤口愈合实验 将 Hep-2 细胞、Sh-mock 细胞、Sh-snail1 细胞种于 6 孔板中，当细胞融合度达 90% 时，用无血清 DMEM 培养基培养过夜，用 100 μL 的枪头在单层细胞上做“十”字形划痕。PBS 清洗 3 次。分别于 0 h、24 h，在倒置显微镜下拍照。
1.3.6 统计学处理 上述实验采用 SPSS17.0 软件进行单因素方差分析或 t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 稳定转染的 Hep-2 细胞 Snail1 mRNA 及 Snail1 蛋白表达情况
2.1.1 荧光定量 PCR 验证 Sh-snail1 细胞 Snail1 基因的 mRNA 表达情况 荧光定量 PCR 检测对照组细胞、Sh-mock 细胞及 Sh-snail1 细胞 Snail1 基因的 mRNA 表达情况。结果证实，Sh-snail1 细胞 Snail1 mRNA 水平明显低于对照组，干扰后 Snail1 mRNA 下调（P<0.05）。而 Sh-mock 细胞组与对照组相比，Snail1 mRNA 的表达量差异没有统计学意义（P>0.05），如图 1 所示。
图1
PCR 检测 Snail1 基因沉默效率（n=3）
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2.1.2 Western blot 验证 Sh-snail1 细胞 Snail1 蛋白表达情况 Western blot 检测对照组、Sh-mock 组及 Sh-snail1 细胞 Snail1 蛋白表达情况。如图 2 所示，Sh-snail1 细胞的 Snail1 蛋白水平明显低于对照组，说明 Sh-snail1 细胞的 Snail1 基因表达被成功干扰，与对照组相比，Snail1 蛋白表达下降的差异存在统计学意义（P<0.05）。而 Sh-mock 组与对照组的 Snail1 蛋白表达水平的差异没有统计学意义（P>0.05）。
图2
Western blot 检测 Snail1 基因沉默效率（n=3）
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2.2 Snail1 基因沉默对 Hep-2 细胞紧密连接相关蛋白的影响
本文采用 Western blot 技术检测 Snail1 基因沉默对 3 组细胞的 ZO-1、Occludin，Claudin-5 蛋白表达的影响。如图 3 所示，Sh-snail1 细胞的 ZO-1、Occludin，Claudin-5 蛋白表达水平均明显高于对照组（P<0.05）。而 Sh-mock 组与对照组相比，ZO-1、Occludin，Claudin-5 蛋白水平差异没有统计学意义（P>0.05）。
图3
Snail1 基因沉默后紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表达变化（n=3）
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2.3 Snail1 基因沉默对 Hep-2 细胞迁移能力的影响
本文的伤口愈合实验是为了研究 Snail1 基因沉默后 Sh-snail1 细胞的迁移能力。我们分别将对照组、Sh-mock 细胞、Sh-snail1 细胞做标准化划痕处理，24 h 后倒置显微镜下观察细胞迁移距离。如图 4 所示，Sh-snail1 细胞 24 h 迁移距离明显小于对照组（P<0.05），证实 Sh-snail1 细胞迁能力明显减弱。Sh-mock 细胞 24 h 迁移距离与对照组的差异无统计学意义（P>0.05）。
图4
Snail1 基因沉默对 Hep-2 细胞迁移能力的影响（n=3）
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2.4 Snail1 基因沉默对 Hep-2 细胞迁移相关蛋白 RhoA 和 Cdc42 表达的影响
RhoGTP 酶在细胞迁移中发挥重要作用，RhoA 蛋白和 Cdc42 蛋白是其重要组成成分。本文以 Western blot 技术检测 RhoA 蛋白和 Cdc42 蛋白在 3 组细胞中的表达，发现 Snail1 基因沉默后，Sh-snail1 细胞的 RhoA 蛋白和 Cdc42 蛋白水平明显下调，低于对照组（P<0.05）。而 Sh-mock 组与对照组相比，RhoA 和 Cdc42 蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），如图 5 所示。
图5
Snail1 基因沉默后 RhoA 和 Cdc42 的表达变化（n=3）
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3 讨论
Occludins、Claudins 和连接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs），3 种蛋白形成紧密连接的顶端和底端区域。ZO-1 在紧密连接中起中枢作用，调控紧密连接的组装。各种紧密连接蛋白的稳定表达避免了细胞表面的顶端和底端膜蛋白的紊乱，它们作为栅栏或屏障维持上皮细胞的极性[10]。在本研究中，Snail1 基因的沉默上调了 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表达，使 Hep-2 细胞间连接变得更加紧密，有利于维持细胞形态及极性不变。
RhoGTP 酶超家族在细胞运动中起着非常重要的作用。它们可参与调节肌动蛋白动力和控制肌动蛋白重组，其中 RhoA 可促进肌动蛋白应力纤维的形成，Cdc42 则主要促进丝状伪足的形成[11]。另外，Cdc42 可直接激活 p21 激活激酶 1（p21 activated kinase，PAK1）参与细胞运动[12]。我们在实验中发现 Sh-snail1 细胞的 RhoA 和 Cdc42 表达减弱，说明阻断 Snail1 基因表达可下调 RhoA 和 Cdc42，这极有可能是 Snail1 基因沉默导致细胞迁移能力减弱的重要原因。
Snail 家族成员作为锌指转录因子参与胚胎发育等多种机体发育过程，其家族成员 Snail1 蛋白在哺乳动物的发育早期非常重要[13]，大量研究证实转录因子 Snail1 通过下调 E-cad 蛋白，促发癌细胞由上皮样细胞转化为间充质样细胞（epithelial-mesenchymal transition，EMT），从而促进肿瘤细胞转移[14]。可是对于 Snail1 蛋白与紧密连接蛋白和 RhoGTP 酶超家族之间的关系研究较少。由于细胞紧密间连接的打开和细胞迁移速度的加快是细胞迁移的必要因素，我们的研究初步阐明了抑制 Snail1 基因的表达可以上调紧密连接关键蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白表达水平；同时可以下调 RhoA 和 Cdc42 并抑制 Hep-2 细胞的迁移，从而减弱癌细胞的转移能力。因此，本文研究结果证实 Snail1 基因与 Hep-2 细胞转移过程中的细胞间紧密连接打开、细胞迁移能力增强密切相关，为进一步证实 Snail1 基因作为预防肿瘤发展转移的重要靶点提供分子机制的研究依据。
