本文采用静电纺丝制备了负载王不留行黄酮苷的聚乙烯醇苯乙烯吡啶盐（PVA-SbQ）/玉米醇溶蛋白（Zein）纳米纤维，对纳米纤维的表面形貌和结构进行了观察，并对其进行了生物相容性评价。将负载王不留行黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维作为实验组，以凡士林纱布为对照组，建立小鼠皮肤损伤模型，对两种敷料在小鼠皮肤上的修复作用进行组织切片观察。实验结果表明，成功制备了负载王不留行黄酮苷的纳米纤维并呈现良好的形貌；负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维对 L929 细胞无毒害作用，且黄酮苷的存在可以促进细胞黏附生长。基于 PVA-SbQ/Zein/黄酮苷纳米纤维膜的创伤愈合材料对小鼠伤口愈合的效果要优于凡士林纱布。
引用本文： 邱玉宇, 蔡维维, 邱丽颖, 王清清, 魏取福. 负载王不留行黄酮苷纳米纤维作为创伤敷料的研究. 生物医学工程学杂志, 2017, 34(3): 394-400. doi: 10.7507/1001-5515.201603001 复制
引言
伤口愈合是当机体遭受外力作用后皮肤表皮层或皮下组织断裂或缺损后的愈合过程。理想的创伤敷料可以加速此过程，并且可以防止感染和保持皮肤正常的结构和功能[1]。近年来，纳米纤维在创伤愈合领域具有巨大潜力而引起广泛关注[2]。目前，静电纺丝工艺是制备组织工程纳米纤维支架材料最有效的方法之一，静电纺纳米纤维可以模拟细胞外基质促进上皮细胞的黏附、增殖和新组织的形成。此外，纳米纤维的高比表面积和高孔隙度可以促进液体的吸收、细胞的呼吸和气体的渗透[3-5]。而静电纺载药纳米纤维将纳米纤维和药物的优势相结合，作为伤口愈合材料的基材，是一个新的研究热点[6]。
本研究中应用的王不留行黄酮苷（vaccarin）是一种淡黄色颗粒状结晶[7]，它能促进内皮细胞的生成，具有促进血管新生的作用从而促进创面愈合[8]。应用的聚乙烯醇-苯乙烯吡啶盐（polymer poly（vinyl alcohol）-stilbazole quaternized，PVA-SbQ）和玉米醇溶蛋白（Zein）均具有良好的生物相容性，通过静电纺丝的形式将两种聚合物复合作为药物黄酮苷的载体，可增大药物表面积，使药物逐渐释放，从而达到不断促进内皮细胞增殖以加速创面愈合的目的[9-10]，这不仅具有重要的科学意义，而且在将来有望产生较大的实际应用价值。
1 材料与方法
1.1 实验材料
玉米醇溶蛋白（Zein），Mw=35 000，Sigma-Aldrich（St. Louis，MO）Company；冰乙酸，分析纯（AR），上海申翔化学试剂有限公司；聚乙烯醇-苯乙烯吡啶盐（PVA-SbQ），168-H 型，上海光毅印刷器材科技有限公司；王不留行黄酮苷（Vaccarin），实验室用级，上海士峰生物科技有限公司；DMEM 培养液、优等胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶、谷氨酰胺，GIBCO 公司；L929 小鼠成纤维细胞，中国科学院细胞库；四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），Sigma 公司；酒精、戊二醛、生理盐水，国药集团化学试剂有限公司；凡士林纱布，新乡市华西卫材有限公司；ICR（Institute of Cancer Research）雄性小鼠，上海实验动物研究中心。
AL204 型电子天平、pH 计，Mettler Toledo 公司；85-2A 数显测速恒温磁力搅拌器，江苏金坛荣华仪器制造有限公司；自制静电纺丝装置；DZF-6210 真空干燥箱，南京沃环科技实业有限公司；医用超净工作台，青岛丹佳净化设备有限公司；全自动酶标仪，长沙键源医疗科技有限公司；细胞培养瓶、细胞培养板，CORNING 公司；SY18-WJ2/3 CO2 细胞培养箱，Thermo Format 公司。
1.2 静电纺载药纳米纤维膜的制备
将 PVA-SbQ、Zein 质量比为 1∶1 的混合体系 4 g 加入到 12 g 冰乙酸中，常温下搅拌 1 h 后再加入药物黄酮苷 0.05 g，制得包含药物的 PVA-SbQ/Zein 前驱体溶液。将前驱体溶液倒入 20 mL 的注射器内，常温下进行静电纺丝，滚筒转速 200 r/min，纺丝条件为：电压 15 kV，速度 1 mL/h，接收距离 20 cm[11]。后将样品在 60℃ 下干燥 12 h，即得到 PVA-SbQ/Zein 载药复合纳米纤维膜。
1.3 评价方法
1.3.1 表面形貌观察 剪取小块 PVA-SbQ/Zein 载药复合纳米纤维膜制样，经喷金处理后，使用扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）（HITACHT SU1510）对其表面形貌进行观察。利用 Adobe Acro-bat 7.0 Professional 软件测量纤维直径，每个样品随机选取 100～200 根纤维测量，最后计算纤维的平均直径和标准差系数（CV 值）从而得到纤维直径分布。
1.3.2 傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectrum，FTIR） 取纯 Zein、PVA-SbQ、黄酮苷和复合纳米纤维膜，以压片法和衰减全反射分别制样，采用 FTIR（Nicoletis10）测其红外光谱从而对样品表面进行结构分析。
1.3.3 生物相容性评价 ① 细胞活性实验：选取 DMEM 培养基作为浸提介质，根据《GB/T 16886.12-2005/ISO 10993-12:2002 医疗器械生物学评价第 12 部分：样品制备与参照样品》标准，将灭菌（酒精浸泡 1 h 和紫外照射 2 h）后的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维膜和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维膜按 3、6、9 cm2/mL 裁剪分别浸入 DMEM 培养基，置 5% CO2、37℃ 培养箱中浸提 24 h 和 72 h，制备低浓度、中浓度、高浓度的材料浸提液。将两组实验材料 24 h、72 h 的浸提液作为实验材料组，DMEM 培养基作为阴性对照组，进行 L929 细胞培养，在倒置显微镜下观察细胞生长情况。根据《GB/T 16175-1996，医用有机硅材料生物评价实验方法》，采用 MTT 法进行细胞毒性检测，使用全自动酶标仪以 570 nm 为测定波长，测量各孔的光密度（optical density，OD）值，实验数据采用 SPSS13.0 统计软件包进行数据处理分析，以均数±标准差表示。采用 t 检验进行统计学差异比较，P<0.05 为有统计学意义。计算得到的相对生长速率（relative growth rate，RGR）来评定材料的细胞毒性等级[12]，使用 Origin 软件绘制相对生长速率图，RGR 的计算如下：RGR（%）=实验材料组均值/阴性对照组均值×100%。② 细胞黏附实验：PVA-SbQ/Zein 纳米纤维膜和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维膜经酒精熏蒸过夜，紫外正反面照射 2 h，平铺于 24 孔板内，每组设置 4 个复孔。经传代的 L929 细胞以 1×104 个细胞/孔，种于铺有纤维膜的 24 孔板内培养 24 h 后，将处理后的材料-细胞取出，经喷金处理，在扫描电镜下观察 L929 细胞在纳米纤维膜上的生长情况。
1.3.4 动物评价 ICR 雄性小鼠 60 只，6～8 周，体重 20～25 g，随机分为 6 组，每组 10 只。将负载黄酮苷药物的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维作为实验组材料，以无菌凡士林纱布为对照组材料。实验组材料用 75% 酒精正反面熏蒸 24 h，并用紫外照射 2 h。实验鼠腹腔注射 3% 戊巴比妥钠（80 mg/kg）生理盐水溶液麻醉。背部皮肤备皮，安尔碘消毒后组织剪剪取背部全层皮肤及深筋膜层，制成直径为 1.5 cm 的圆形创面，将相应大小的实验组材料和对照组材料敷于创面。术毕创面用自粘绷带包扎固定，分别于第 3、7、14 天大体观察愈合情况。采用乙醚麻醉法将小鼠致死，取下局部皮肤组织，投入 10% 甲醛固定液，浸泡 48 h 后进行石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，在光镜下观察。
2 结果与讨论
2.1 表面形貌
图 1 所示为未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维膜的扫描电镜图和直径分布图。未载药纳米纤维直径为（145±59）nm，纤维表面光滑，没有串珠。在此基础上负载黄酮苷得到静电纺载药 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维，虽然肉眼观察到的纤维膜平整光滑，但放大后看到纤维形貌改变，出现溶胀现象，直径为（378±71）nm。负载药物后纤维表面形貌变化很大，这可能是由于负载药物后纺丝液的黏度和电导率不同导致的[11]。
图1
未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维的扫描电镜与直径分布图
Figure1.
SEM and diameter distribution images of PVA-SbQ/Zein composite nanofibers with and without drug vaccarin
2.2 红外光谱分析
图 2 为负载黄酮苷纳米纤维的红外光谱分析图。a 是药物黄酮苷的红外光谱图，3 303、1 614 和 1 450 cm—1处分别为 O-H、酰基键（C=O）和 C=C 的弹性振动峰。b 为 Zein 纳米纤维红外光谱图，1 651、1 542、3 298 和 1 247 cm—1 处分别为 C=O 在酰胺 Ⅰ 带的伸缩振动峰，N-H、O-H 在酰胺 Ⅱ 带的伸缩振动峰和 C-N 在酰胺 Ⅲ 带的伸缩振动峰 7[13]。c 中 1 374 cm—1 处为 PVA-SbQ 中 SbQ 基团链末端 δ（–CH3）吸收峰，1 247 cm—1 处为 δ（O-H）吸收峰，835 cm—1 处的吸收峰是 SbQ 基团上苯环的面外弯曲振动峰 8[14]。d 是未载药的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维的红外光谱图，e 为负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维膜的红外光谱图，可以看出酰胺 Ⅱ 带处的峰红移至 1 532 cm—1，这些结果表明，稳定的二级结构被软化，这是由于 Zein、黄酮苷中的氨基和羰基基团形成的氢键作用减弱导致的，这可以证明药物与复合纤维具有较好的相容性。
图2
药物黄酮苷（a）、Zein（b）、PVA-SbQ（c）、未载药（d）和负载黄酮苷（e）PVA-SbQ/Zein纳米纤维的红外光谱图
Figure2.
FTIR of vaccarin (a), Zein (b), PVA-SbQ (c), PVA-SbQ/Zein nanofibers without (d) and with drug drug vaccarin (e)
2.3 生物相容性评价
2.3.1 细胞活性实验（见图 3） 伤口愈合的材料必须具有良好的生物相容性，这是材料在特定环境下使用时必须具备的条件[15]。细胞毒性实验是检测材料和器械接触机体组织后生物学反应的体外实验，它是生物学评价体系中最重要的检测指标之一[16]。其中，MTT 比色法是定量测定细胞毒性的首选方法之一，可以全面、客观地反映被测材料对细胞生长及活性的影响，计算细胞 RGR，反映材料的细胞毒性。一般认为，RGR>75% 的生物材料对细胞没有毒性影响[17]。如图 3 所示，倒置光学显微镜下观察，L929 细胞在未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维浸提液中均表现为较好的增殖和形貌。同时，未载药和 PVA-SbQ/Zein/黄酮苷纳米纤维 RGR 均>75%，提示未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维均无细胞毒性。表 1 为 PVA-SbQ/Zein 和 PVA-SbQ/Zein/黄酮苷纳米纤维不同浓度浸提液在细胞培养 24 h 和 72 h 后的吸光值比较，从表中可看出，细胞培养 24 h 各浓度和培养 72 h 后中浓度的两组间吸光值差异无统计学意义（P>0.05）。细胞培养 72 h 后，与未载药组相比，载药组低浓度组、高浓度组吸光值均有明显差异（P<0.01），这可能是由于黄酮苷的释放可以促进细胞增殖，而不同浓度的材料浸提液所释放的药物含量为细胞的生长提供了不同的生存条件。
图3
未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维不同浓度浸提液培养 24 h 和 72 h 镜下细胞形态图和 RGR 结果统计
Figure3.
Microphotographs and RGR of L929 cells with different concentrations of extract from PVA-SbQ/Zein nanofibers and PVA-SbQ/Zein/vaccarin nanofibers cultured for 24 h and 72 h respectively
表1
未载药组与负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维组不同浓度浸提液中细胞 OD 值
Table1.
OD value of PVA-SbQ/Zein nanofibers and PVA-SbQ/Zein/vaccarin nanofibers with different concentrations of DMEM
2.3.2 细胞黏附实验 未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维对细胞的直接接触试验结果如图 4 所示。左图为 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维的细胞黏附扫描电镜图，从图中可以看出细胞黏附生长于纤维表面并呈现良好的形态结构。右图是 PVA-SbQ/Zein/黄酮苷纳米纤维的细胞黏附扫描电镜图，可以看出细胞黏附生长于纤维表面，部分已生长于纤维内部，且细胞数量较多，这可能是因为药物黄酮苷的存在可以促进细胞的黏附生长。
图4
未载药和负载黄酮苷 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维表面细胞的黏附生长扫描电镜图
Figure4.
SEM of cell attachment on PVA-SbQ/Zein nano-fibers with and without drug vaccarin
从材料浸提液和直接接触试验结果中可以看到未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维均具有良好的生物相容性，而负载黄酮苷的纳米纤维浸提液中 L929 细胞生长活性更好，细胞黏附生长的数量也更多，可以说明黄酮苷载药成功并发挥了其药物释放的作用，可以作为创伤愈合材料使用[11]。
2.4 动物评价
2.4.1 伤口愈合观察 图 5 是小鼠伤口愈合情况大体观察图。实验组（PVA-SbQ/Zein/黄酮苷组）3 天后伤口开始缩小，表面平整、湿润，创面无分泌物。7 天时实验组创面明显缩小，创面干燥，无明显伤口渗出，伤口边缘和周围皮肤组织颜色浅红、弹性好。对照组（凡士林纱布组）7 天时，当新生组织长入纱布后，直接取出纱布出现伤口的再次损伤。从图中可看到经去除凡士林纱布的伤口有轻度脓性及血性分泌物黏附。14 天时实验组出现结痂，伤口基本愈合。
图5
负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维组（实验组）与无菌凡士林纱布组（对照组）不同时间肉眼观察小鼠皮肤伤口愈合
Figure5.
Macroscopic observation of rat skin wound healing by PVA-SbQ/Zein/vaccarin (trial group) and petrolatum gauze (control group)
2.4.2 组织切片观察 图 6 是 200 倍显微镜下观察到的小鼠伤口组织切片图。从图中可以看到，在第 3 天时，对照组（凡士林纱布组）和实验组（PVA-SbQ/Zein/黄酮苷组）伤口均有明显的炎症反应，中性粒细胞是早期进入损伤部位的主要炎症细胞。在第 7 天时，从图中可以明显看到实验组出现较多的新生血管和成纤维细胞，创面胶原纤维增生明显，而对照组也会有新生血管的形成，但相对较少。而在第 14 天时，新生复层扁平上皮，皮下组织致密，胶原纤维出现，纤维结缔组织增生，小鼠损伤皮肤已基本愈合[18]。
图6
负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维组（实验组）与无菌凡士林纱布组（对照组）小鼠损伤皮肤组织切片观察（HE染色，200×）
Figure6.
Histological observation of skin traumatism by PVA-SbQ/Zein/vaccarin (trial group) and petrolatum gauze (control group) (HE, 200×)
实验结果表明，实验组 PVA-SbQ/Zein/黄酮苷纳米纤维对小鼠损伤皮肤的愈合效果更好，随着时间的推移，小鼠伤口周围细胞、纤维组织和血管逐渐形成。一方面是因为纳米纤维结构可以模拟细胞外基质从而促进上皮细胞的增殖和新组织的形成，并且纳米纤维的高比表面积和高孔隙度可以促进液体的吸收、细胞的代谢和气体的渗透从而利于伤口的愈合；另一方面是由于药物黄酮苷的作用，它可以通过促进内皮细胞的生成和血管新生从而促进创面愈合[4，11]。
3 结论
负载王不留行黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维具有良好的生物相容性，对小鼠伤口愈合效果比普通凡士林纱布类敷料好，伤口愈合速度快，说明药物黄酮苷和纳米纤维的结合对伤口愈合有促进作用，且不会对伤口造成再次损伤，是理想的创伤敷料，有望将来用作医用敷料。
引言
伤口愈合是当机体遭受外力作用后皮肤表皮层或皮下组织断裂或缺损后的愈合过程。理想的创伤敷料可以加速此过程，并且可以防止感染和保持皮肤正常的结构和功能[1]。近年来，纳米纤维在创伤愈合领域具有巨大潜力而引起广泛关注[2]。目前，静电纺丝工艺是制备组织工程纳米纤维支架材料最有效的方法之一，静电纺纳米纤维可以模拟细胞外基质促进上皮细胞的黏附、增殖和新组织的形成。此外，纳米纤维的高比表面积和高孔隙度可以促进液体的吸收、细胞的呼吸和气体的渗透[3-5]。而静电纺载药纳米纤维将纳米纤维和药物的优势相结合，作为伤口愈合材料的基材，是一个新的研究热点[6]。
本研究中应用的王不留行黄酮苷（vaccarin）是一种淡黄色颗粒状结晶[7]，它能促进内皮细胞的生成，具有促进血管新生的作用从而促进创面愈合[8]。应用的聚乙烯醇-苯乙烯吡啶盐（polymer poly（vinyl alcohol）-stilbazole quaternized，PVA-SbQ）和玉米醇溶蛋白（Zein）均具有良好的生物相容性，通过静电纺丝的形式将两种聚合物复合作为药物黄酮苷的载体，可增大药物表面积，使药物逐渐释放，从而达到不断促进内皮细胞增殖以加速创面愈合的目的[9-10]，这不仅具有重要的科学意义，而且在将来有望产生较大的实际应用价值。
1 材料与方法
1.1 实验材料
玉米醇溶蛋白（Zein），Mw=35 000，Sigma-Aldrich（St. Louis，MO）Company；冰乙酸，分析纯（AR），上海申翔化学试剂有限公司；聚乙烯醇-苯乙烯吡啶盐（PVA-SbQ），168-H 型，上海光毅印刷器材科技有限公司；王不留行黄酮苷（Vaccarin），实验室用级，上海士峰生物科技有限公司；DMEM 培养液、优等胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶、谷氨酰胺，GIBCO 公司；L929 小鼠成纤维细胞，中国科学院细胞库；四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），Sigma 公司；酒精、戊二醛、生理盐水，国药集团化学试剂有限公司；凡士林纱布，新乡市华西卫材有限公司；ICR（Institute of Cancer Research）雄性小鼠，上海实验动物研究中心。
AL204 型电子天平、pH 计，Mettler Toledo 公司；85-2A 数显测速恒温磁力搅拌器，江苏金坛荣华仪器制造有限公司；自制静电纺丝装置；DZF-6210 真空干燥箱，南京沃环科技实业有限公司；医用超净工作台，青岛丹佳净化设备有限公司；全自动酶标仪，长沙键源医疗科技有限公司；细胞培养瓶、细胞培养板，CORNING 公司；SY18-WJ2/3 CO2 细胞培养箱，Thermo Format 公司。
1.2 静电纺载药纳米纤维膜的制备
将 PVA-SbQ、Zein 质量比为 1∶1 的混合体系 4 g 加入到 12 g 冰乙酸中，常温下搅拌 1 h 后再加入药物黄酮苷 0.05 g，制得包含药物的 PVA-SbQ/Zein 前驱体溶液。将前驱体溶液倒入 20 mL 的注射器内，常温下进行静电纺丝，滚筒转速 200 r/min，纺丝条件为：电压 15 kV，速度 1 mL/h，接收距离 20 cm[11]。后将样品在 60℃ 下干燥 12 h，即得到 PVA-SbQ/Zein 载药复合纳米纤维膜。
1.3 评价方法
1.3.1 表面形貌观察 剪取小块 PVA-SbQ/Zein 载药复合纳米纤维膜制样，经喷金处理后，使用扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）（HITACHT SU1510）对其表面形貌进行观察。利用 Adobe Acro-bat 7.0 Professional 软件测量纤维直径，每个样品随机选取 100～200 根纤维测量，最后计算纤维的平均直径和标准差系数（CV 值）从而得到纤维直径分布。
1.3.2 傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectrum，FTIR） 取纯 Zein、PVA-SbQ、黄酮苷和复合纳米纤维膜，以压片法和衰减全反射分别制样，采用 FTIR（Nicoletis10）测其红外光谱从而对样品表面进行结构分析。
1.3.3 生物相容性评价 ① 细胞活性实验：选取 DMEM 培养基作为浸提介质，根据《GB/T 16886.12-2005/ISO 10993-12:2002 医疗器械生物学评价第 12 部分：样品制备与参照样品》标准，将灭菌（酒精浸泡 1 h 和紫外照射 2 h）后的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维膜和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维膜按 3、6、9 cm2/mL 裁剪分别浸入 DMEM 培养基，置 5% CO2、37℃ 培养箱中浸提 24 h 和 72 h，制备低浓度、中浓度、高浓度的材料浸提液。将两组实验材料 24 h、72 h 的浸提液作为实验材料组，DMEM 培养基作为阴性对照组，进行 L929 细胞培养，在倒置显微镜下观察细胞生长情况。根据《GB/T 16175-1996，医用有机硅材料生物评价实验方法》，采用 MTT 法进行细胞毒性检测，使用全自动酶标仪以 570 nm 为测定波长，测量各孔的光密度（optical density，OD）值，实验数据采用 SPSS13.0 统计软件包进行数据处理分析，以均数±标准差表示。采用 t 检验进行统计学差异比较，P<0.05 为有统计学意义。计算得到的相对生长速率（relative growth rate，RGR）来评定材料的细胞毒性等级[12]，使用 Origin 软件绘制相对生长速率图，RGR 的计算如下：RGR（%）=实验材料组均值/阴性对照组均值×100%。② 细胞黏附实验：PVA-SbQ/Zein 纳米纤维膜和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维膜经酒精熏蒸过夜，紫外正反面照射 2 h，平铺于 24 孔板内，每组设置 4 个复孔。经传代的 L929 细胞以 1×104 个细胞/孔，种于铺有纤维膜的 24 孔板内培养 24 h 后，将处理后的材料-细胞取出，经喷金处理，在扫描电镜下观察 L929 细胞在纳米纤维膜上的生长情况。
1.3.4 动物评价 ICR 雄性小鼠 60 只，6～8 周，体重 20～25 g，随机分为 6 组，每组 10 只。将负载黄酮苷药物的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维作为实验组材料，以无菌凡士林纱布为对照组材料。实验组材料用 75% 酒精正反面熏蒸 24 h，并用紫外照射 2 h。实验鼠腹腔注射 3% 戊巴比妥钠（80 mg/kg）生理盐水溶液麻醉。背部皮肤备皮，安尔碘消毒后组织剪剪取背部全层皮肤及深筋膜层，制成直径为 1.5 cm 的圆形创面，将相应大小的实验组材料和对照组材料敷于创面。术毕创面用自粘绷带包扎固定，分别于第 3、7、14 天大体观察愈合情况。采用乙醚麻醉法将小鼠致死，取下局部皮肤组织，投入 10% 甲醛固定液，浸泡 48 h 后进行石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，在光镜下观察。
2 结果与讨论
2.1 表面形貌
图 1 所示为未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维膜的扫描电镜图和直径分布图。未载药纳米纤维直径为（145±59）nm，纤维表面光滑，没有串珠。在此基础上负载黄酮苷得到静电纺载药 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维，虽然肉眼观察到的纤维膜平整光滑，但放大后看到纤维形貌改变，出现溶胀现象，直径为（378±71）nm。负载药物后纤维表面形貌变化很大，这可能是由于负载药物后纺丝液的黏度和电导率不同导致的[11]。
图1
未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维的扫描电镜与直径分布图
Figure1.
SEM and diameter distribution images of PVA-SbQ/Zein composite nanofibers with and without drug vaccarin
2.2 红外光谱分析
图 2 为负载黄酮苷纳米纤维的红外光谱分析图。a 是药物黄酮苷的红外光谱图，3 303、1 614 和 1 450 cm—1处分别为 O-H、酰基键（C=O）和 C=C 的弹性振动峰。b 为 Zein 纳米纤维红外光谱图，1 651、1 542、3 298 和 1 247 cm—1 处分别为 C=O 在酰胺 Ⅰ 带的伸缩振动峰，N-H、O-H 在酰胺 Ⅱ 带的伸缩振动峰和 C-N 在酰胺 Ⅲ 带的伸缩振动峰 7[13]。c 中 1 374 cm—1 处为 PVA-SbQ 中 SbQ 基团链末端 δ（–CH3）吸收峰，1 247 cm—1 处为 δ（O-H）吸收峰，835 cm—1 处的吸收峰是 SbQ 基团上苯环的面外弯曲振动峰 8[14]。d 是未载药的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维的红外光谱图，e 为负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维膜的红外光谱图，可以看出酰胺 Ⅱ 带处的峰红移至 1 532 cm—1，这些结果表明，稳定的二级结构被软化，这是由于 Zein、黄酮苷中的氨基和羰基基团形成的氢键作用减弱导致的，这可以证明药物与复合纤维具有较好的相容性。
图2
药物黄酮苷（a）、Zein（b）、PVA-SbQ（c）、未载药（d）和负载黄酮苷（e）PVA-SbQ/Zein纳米纤维的红外光谱图
Figure2.
FTIR of vaccarin (a), Zein (b), PVA-SbQ (c), PVA-SbQ/Zein nanofibers without (d) and with drug drug vaccarin (e)
2.3 生物相容性评价
2.3.1 细胞活性实验（见图 3） 伤口愈合的材料必须具有良好的生物相容性，这是材料在特定环境下使用时必须具备的条件[15]。细胞毒性实验是检测材料和器械接触机体组织后生物学反应的体外实验，它是生物学评价体系中最重要的检测指标之一[16]。其中，MTT 比色法是定量测定细胞毒性的首选方法之一，可以全面、客观地反映被测材料对细胞生长及活性的影响，计算细胞 RGR，反映材料的细胞毒性。一般认为，RGR>75% 的生物材料对细胞没有毒性影响[17]。如图 3 所示，倒置光学显微镜下观察，L929 细胞在未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维浸提液中均表现为较好的增殖和形貌。同时，未载药和 PVA-SbQ/Zein/黄酮苷纳米纤维 RGR 均>75%，提示未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维均无细胞毒性。表 1 为 PVA-SbQ/Zein 和 PVA-SbQ/Zein/黄酮苷纳米纤维不同浓度浸提液在细胞培养 24 h 和 72 h 后的吸光值比较，从表中可看出，细胞培养 24 h 各浓度和培养 72 h 后中浓度的两组间吸光值差异无统计学意义（P>0.05）。细胞培养 72 h 后，与未载药组相比，载药组低浓度组、高浓度组吸光值均有明显差异（P<0.01），这可能是由于黄酮苷的释放可以促进细胞增殖，而不同浓度的材料浸提液所释放的药物含量为细胞的生长提供了不同的生存条件。
图3
未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维不同浓度浸提液培养 24 h 和 72 h 镜下细胞形态图和 RGR 结果统计
Figure3.
Microphotographs and RGR of L929 cells with different concentrations of extract from PVA-SbQ/Zein nanofibers and PVA-SbQ/Zein/vaccarin nanofibers cultured for 24 h and 72 h respectively
表1
未载药组与负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维组不同浓度浸提液中细胞 OD 值
Table1.
OD value of PVA-SbQ/Zein nanofibers and PVA-SbQ/Zein/vaccarin nanofibers with different concentrations of DMEM
2.3.2 细胞黏附实验 未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维对细胞的直接接触试验结果如图 4 所示。左图为 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维的细胞黏附扫描电镜图，从图中可以看出细胞黏附生长于纤维表面并呈现良好的形态结构。右图是 PVA-SbQ/Zein/黄酮苷纳米纤维的细胞黏附扫描电镜图，可以看出细胞黏附生长于纤维表面，部分已生长于纤维内部，且细胞数量较多，这可能是因为药物黄酮苷的存在可以促进细胞的黏附生长。
图4
未载药和负载黄酮苷 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维表面细胞的黏附生长扫描电镜图
Figure4.
SEM of cell attachment on PVA-SbQ/Zein nano-fibers with and without drug vaccarin
从材料浸提液和直接接触试验结果中可以看到未载药和负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维均具有良好的生物相容性，而负载黄酮苷的纳米纤维浸提液中 L929 细胞生长活性更好，细胞黏附生长的数量也更多，可以说明黄酮苷载药成功并发挥了其药物释放的作用，可以作为创伤愈合材料使用[11]。
2.4 动物评价
2.4.1 伤口愈合观察 图 5 是小鼠伤口愈合情况大体观察图。实验组（PVA-SbQ/Zein/黄酮苷组）3 天后伤口开始缩小，表面平整、湿润，创面无分泌物。7 天时实验组创面明显缩小，创面干燥，无明显伤口渗出，伤口边缘和周围皮肤组织颜色浅红、弹性好。对照组（凡士林纱布组）7 天时，当新生组织长入纱布后，直接取出纱布出现伤口的再次损伤。从图中可看到经去除凡士林纱布的伤口有轻度脓性及血性分泌物黏附。14 天时实验组出现结痂，伤口基本愈合。
图5
负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维组（实验组）与无菌凡士林纱布组（对照组）不同时间肉眼观察小鼠皮肤伤口愈合
Figure5.
Macroscopic observation of rat skin wound healing by PVA-SbQ/Zein/vaccarin (trial group) and petrolatum gauze (control group)
2.4.2 组织切片观察 图 6 是 200 倍显微镜下观察到的小鼠伤口组织切片图。从图中可以看到，在第 3 天时，对照组（凡士林纱布组）和实验组（PVA-SbQ/Zein/黄酮苷组）伤口均有明显的炎症反应，中性粒细胞是早期进入损伤部位的主要炎症细胞。在第 7 天时，从图中可以明显看到实验组出现较多的新生血管和成纤维细胞，创面胶原纤维增生明显，而对照组也会有新生血管的形成，但相对较少。而在第 14 天时，新生复层扁平上皮，皮下组织致密，胶原纤维出现，纤维结缔组织增生，小鼠损伤皮肤已基本愈合[18]。
图6
负载黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维组（实验组）与无菌凡士林纱布组（对照组）小鼠损伤皮肤组织切片观察（HE染色，200×）
Figure6.
Histological observation of skin traumatism by PVA-SbQ/Zein/vaccarin (trial group) and petrolatum gauze (control group) (HE, 200×)
实验结果表明，实验组 PVA-SbQ/Zein/黄酮苷纳米纤维对小鼠损伤皮肤的愈合效果更好，随着时间的推移，小鼠伤口周围细胞、纤维组织和血管逐渐形成。一方面是因为纳米纤维结构可以模拟细胞外基质从而促进上皮细胞的增殖和新组织的形成，并且纳米纤维的高比表面积和高孔隙度可以促进液体的吸收、细胞的代谢和气体的渗透从而利于伤口的愈合；另一方面是由于药物黄酮苷的作用，它可以通过促进内皮细胞的生成和血管新生从而促进创面愈合[4，11]。
3 结论
负载王不留行黄酮苷的 PVA-SbQ/Zein 纳米纤维具有良好的生物相容性，对小鼠伤口愈合效果比普通凡士林纱布类敷料好，伤口愈合速度快，说明药物黄酮苷和纳米纤维的结合对伤口愈合有促进作用，且不会对伤口造成再次损伤，是理想的创伤敷料，有望将来用作医用敷料。
