生物起搏器是治疗严重缓慢性心律失常的一个新策略, 而寻找合适的起搏细胞是其首要问题。本文综述了通过转染基因、化学诱导、共培养以及特定培养基培养的方法将骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞诱导为起搏样细胞的研究进展, 分析了它们作为生物心脏起搏器种子细胞尚需解决的问题。
引用本文： 黄超, 杨向群. 间充质干细胞向起搏样细胞的诱导分化. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(2): 378-381, 387. doi: 10.7507/1001-5515.20160064 复制
引言
心脏及其传导系统病变可诱发威胁生命的心律失常，往往需要药物、手术或者电子起搏器植入等治疗[1]。虽然电子起搏器日臻完善，仍存在对体内体液调节不敏感、可能发生感染以及电池使用寿命有限等不足[2]。随着干细胞、组织工程、再生医学等学科的发展，生物起搏器的研究逐渐成为研究的热点。所谓生物起搏器，是指运用生物学原理和相关技术，利用具有起搏功能的细胞或组织来替代病损的起搏或传导组织，以达到重建、恢复心脏起搏和传导功能目的。
构建生物起搏器的策略包括对原位心肌细胞的基因转染、起搏细胞移植及组织工程构建等[3]，目前的研究主要集中在以下两个方面：一是通过基因操作、重编程使原有心肌细胞转变为起搏细胞；二是寻找有起搏功能的种子细胞以进行细胞移植，尤其是将干细胞诱导为起搏细胞，包括胚胎干细胞、诱导性多能干细胞和成体干细胞。由于骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)来源比较广泛，取材较方便、容易，且没有伦理学限制，更有可能应用于临床，因此具有潜在的应用前景。本文主要对BMSCs和ADSCs向起搏样细胞的诱导分化进行综述。
1 骨髓间充质干细胞
间充质干细胞是一种非造血基质细胞，国际细胞治疗协会推荐用以下标准来鉴定间充质干细胞：①可差速贴壁；②在体外标准诱导环境下可诱导成软骨、骨和脂肪组织；③表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19和HLA-DR[4]。BMSCs由Friedenstein等[5]在1976年首次从小鼠骨髓中发现，此后对其分离、纯化和培养等进行了更进一步的深入研究，证实BMSCs具有成骨[6]、成软骨[7]、成肌[8]、成脂肪[9]等多向分化的能力。
1.1 BMSCs的免疫细胞表型
BMSCs的免疫细胞表型比较复杂，许多研究结果不尽相同，Russo等[10]认为BMSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105以及CD166，而在新鲜分离出来时不表达CD34、CD73；在培养过程中表达CD106、CD49f、PODXL，不表达CD49d、CD54。Minteer等[11]认为BMSCs还表达CD13、MHCⅠ，HLA-ABC，不表达CD34、CD38、CD45、HLA-DR、DP、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40、CD40L(CD154)等。
1.2 BMSCs向起搏样细胞的诱导分化
1.2.1 转染起搏基因
存在于起搏细胞的超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cation channel,HCN)在超极化时能够激活，并受cAMP调控，能够产生If电流，从而产生其动作电位的4期自动去极化，进而自发产生新的动作电位，达到起搏心脏的作用。HCN通道有4种，分别是HCN1、HCN2、HCN3、HCN4，其中存在于心脏中的有HCN1、HCN2、HCN4。Potapova等[12]首次应用电穿孔的方法将小鼠HCN2基因转染进人BMSCs中，随后将其与大鼠心肌细胞共培养或移植到犬左室心外膜下，记录到自动去极化的动作电位，并在心外膜下形成异位起搏点，与邻近心肌细胞产生缝隙连接。其后研究发现，移植细胞数量必须大于700 000个才能够发挥作用。Cheng等[13]通过慢病毒将小鼠HCN4转染进犬的BMSCs中，可产生If电流，注射至犬右心室壁中，在刺激犬迷走神经时，发现右室有其特定频率的自主搏动。Wei等[14]通过慢病毒转染小鼠HCN4进入犬BMSCs中，并注射至完全房室传导阻滞的犬左室前壁，发现犬的最大心率快于正常组，运动后的心率变异高于正常组。Zhou等[15]体外研究证实，通过慢病毒转染人HCN1的兔BMSCs，可产生IHCN1，可使与其共培养的新生兔心肌细胞跳动频率加快。Nong等[16]最近的研究表明，移植细胞的连接蛋白43表达低，可能是影响起搏效果的重要原因。这些研究表明向BMSCs中转染起搏基因，BMSCs可以产生If，体外和体内都能使得周围的心肌细胞产生跳动。但BMSCs本身并不具备起搏细胞的结构基础，仅用单一的基因转染无法成为起搏细胞。此外，基因转染后的BMSCs在体内的长时间效果尚需进一步研究。
1.2.2 化学诱导
在干细胞的研究过程中，5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-AZA)作为诱导剂，经常被用来诱导干细胞向心肌细胞的定向分化。研究发现，小鼠BMSCs经过5-AZA诱导后，部分能够自发跳动，并能检测到窦房结样和心室肌样的动作电位。Yang等[17]发现用10μmol/L 5-AZA诱导人BMSCs，4周后开始表达起搏基因HCN2、HCN4。用5-AZA和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导大鼠BMSCs 24 h后，与新生大鼠心肌细胞间接共培养，可分化成球状和杆状的细胞，检测到其窦房结样、心室肌样的动作电位，同时表达HCN4、Tbx3等和起搏细胞密切相关的基因，并进一步证实神经调节蛋白-1/酪氨酸蛋白激酶受体通路对大鼠BMSCs的这种分化起促进作用[18]。然而，由于5-AZA的细胞毒性及其致突变作用，目前没有报道使用5-AZA对BMSCs向起搏细胞诱导的动物实验，也限制了其在临床应用的价值。
1.2.3 共培养
干细胞所处的微环境、细胞间的直接接触是其定向分化的关键因素。因此，目前已经应用窦房结细胞、心肌细胞或者心肌裂解液、条件培养基等共培养，通过直接或者间接接触来诱导BMSCs向起搏样细胞的定向分化。宋波等[19]将3代大鼠BMSCs和大鼠窦房结组织混合但不直接接触，随着培养时间的延长(1～3周)，HCN4和connexin 40的表达水平均逐渐增加。Li等[18]用5-AZA和bFGF诱导大鼠BMSCs 24 h，再与新生大鼠心肌细胞间接共培养，检测到窦房结样动作电位及HCN4、Tbx3等起搏相关基因的表达。这些研究均未对诱导分化的具体机制进行研究，可以作为下一步的研究方向。
2 脂肪干细胞
ADSCs是一种脂肪来源的间充质干细胞，它是Zuk等[20]在2001年首次从人的脂肪抽吸物中发现大量类似干细胞的细胞，能够被诱导成骨、成软骨、成肌、成脂肪分化。ADSCs同BMSCs一样具有多向分化潜能，目前已被证实其成骨[21]、成软骨[22]、成肌[23]、成脂肪[24]等多向分化能力。
2.1 ADSCs的免疫细胞表型
ADSCs主要表达CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、HLA-II[25]。Minteer等[11]认为其表达CD13、CD29、CD34、CD73、CD90、CD105、CD166、MHCⅠ、HLA-ABC，不表达CD38、CD45、CD106、HLA-DR、DP、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40、CD40L。Russo等[10]认为ADSCs和BMSCs都表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105以及CD166，但ADSCs在新鲜分离时会表达CD34，在培养过程中会表达CD49d、CD54，不表达CD106、CD49f、PODXL。
2.2 ADSCs向起搏样细胞的诱导分化
2.2.1 转染基因
对ADSCs转染起搏基因的研究，国内外报道的比较少，李勇等[26]将人HCN2基因转染进大鼠ADSCs中，并将其与乳鼠心室肌细胞共培养，发现ADSCs能表达较强的人HCN2基因及蛋白，产生If电流，并能使心室肌细胞的自发性搏动明显增快增强。Li等[27]通过慢病毒使CD73+的ADSCs过表达Gata4、Baf60c、Tbx5，8 d后分化为自发跳动的细胞，频率为80～120次/min，但并未鉴定是否为起搏细胞，也未检测其是否具有起搏特征，因此尚有待更深入的研究。
2.2.2 化学诱导
Rangappa等[28]在2003年首次利用不同浓度的5-AZA来诱导兔腹部脂肪来源的ADSCs，2周后20%~30%的细胞表现出球样形态，3周后这些细胞开始自发跳动，但对跳动细胞是否为起搏细胞未做鉴定。而Yang等[17]将人BMSCs和ADSCs经10μmol/L 5-AZA诱导48 h，4周后，通过比较发现，ADSCs增殖能力强于BMSCs，肌钙蛋白I表达也高于BMSCs，且起搏基因HCN2、HCN4等表达的时间比BMSCs早，表达量也比BMSCs多，认为ADSCs更容易诱导。然而，并不是所有的ADSCs经5-AZA诱导都可以向起搏样细胞分化，Lee等[29]分别用5、10μmol/L 5-AZA诱导人腹部皮下脂肪来源的ADSCs，观察8周，并没发现其分化为跳动的细胞，也未做起搏特征的鉴定。因此，5-AZA诱导ADSCs向起搏细胞分化尚存争论，其机制也不是很清楚，还有待更深入的探索。
2.2.3 共培养
研究发现，将人皮下脂肪来源的ADSCs与4～6周大鼠心肌提取液共培养，可观察到细胞有跳动现象。Choi等[30]将人皮下脂肪来源的ADSCs与新生大鼠心肌细胞(1∶10)直接接触共培养，1周后细胞能够自发跳动，检测到细胞钙瞬变、与周围心肌细胞形成缝隙连接，具有一定的起搏特征。但其他一些研究却得到了阴性结果，可能与组织来源、诱导条件差异有关，但具体原因尚不明确。
2.2.4 特定培养基培养
Planat-Bénard等[31]发现6周龄小鼠腹股沟和肩胛间的ADSCs在含有15%胎牛血清的甲基纤维素培养基培养下，1～2周后可以自发地分化为跳动的心肌细胞，自发产生动作电位。结合药理学检测，认为心肌细胞中混有起搏细胞。Palpant等[32]筛选出小鼠肩胛间Sca1+/c-kit+的ADSCs在上述条件培养1周后，分化为自发跳动的细胞，通过检测钙瞬变，证明其有起搏功能，指出非经典Wnt通路在其中起到促进的作用。Zhao等[33]也做了类似的研究，发现ADSCs自发地分化为跳动的细胞，证实Rho因子相关蛋白激酶起着重要的作用，但并没有对这些细胞进行鉴定。然而这些研究未严格区分ADSCs是来源于白色脂肪还是棕色脂肪。Dromard等[34]证实心肌样细胞跳动与培养基中钙的含量有关，同时认为这些能够分化为起搏样细胞的干细胞主要来自于棕色脂肪。
Jumabay等[35]用含有20%胎牛血清的常规培养基培养小鼠去分化白色脂肪细胞2周后，发现一些自发跳动的细胞，并具有4期自动去极化的特点，具有起搏细胞的特性。而Yamada等[36]从小鼠棕色脂肪组织中筛选出CD29+的ADSCs，用含有10%胎牛血清的常规培养基培养后发现有部分细胞能够自发跳动。Liu等[37]对从棕色脂肪组织中分离ADSCs的方法进行改进，提高了跳动细胞的比例。但两者并未对这些跳动的细胞进行起搏特征的鉴定。陈磊等[38]在体外用含有15%胎牛血清的常规培养基培养来自小鼠肩胛间棕色脂肪的ADSCs，发现可分化为自发跳动的细胞，并证实这些自发跳动的细胞具有起搏特征，同时证实经典Wnt通路在棕色脂肪源性ADSCs自发分化为起搏样细胞中的重要作用。
无论是甲基纤维素培养基诱导还是含有不同浓度胎牛血清的常规培养基诱导，相比于其他方法，更加容易、方便。但是，这些细胞中起搏细胞的比例都比较低，目前还不能满足作为起搏种子细胞的要求。此外，上述研究都局限在二维条件，有待深入到三维条件下和动物实验中进行验证。
3 前景展望
ADSCs比BMSCs来源更加广泛，取材容易，安全性高，而且ADSCs的增殖活性、分化能力等不逊于BMSCs，因此更有临床应用价值。虽然目前间充质干细胞向起搏样细胞分化的研究已经有了很大的进展，但是距离构建生物起搏器还有很长的一段路要走，迫切需要更多更深入的研究。如对干细胞的诱导方法还须进一步改进，提高起搏样细胞的分化比例；通过筛选某个标志或者其他的方法，纯化起搏样细胞；对干细胞定向分化为起搏样细胞的主要机制还有待深入地研究和探讨，从而更好地调控干细胞向起搏样细胞的定向分化；三维条件下细胞诱导分化、在体条件下的动物实验也是下一步研究的方向。
引言
心脏及其传导系统病变可诱发威胁生命的心律失常，往往需要药物、手术或者电子起搏器植入等治疗[1]。虽然电子起搏器日臻完善，仍存在对体内体液调节不敏感、可能发生感染以及电池使用寿命有限等不足[2]。随着干细胞、组织工程、再生医学等学科的发展，生物起搏器的研究逐渐成为研究的热点。所谓生物起搏器，是指运用生物学原理和相关技术，利用具有起搏功能的细胞或组织来替代病损的起搏或传导组织，以达到重建、恢复心脏起搏和传导功能目的。
构建生物起搏器的策略包括对原位心肌细胞的基因转染、起搏细胞移植及组织工程构建等[3]，目前的研究主要集中在以下两个方面：一是通过基因操作、重编程使原有心肌细胞转变为起搏细胞；二是寻找有起搏功能的种子细胞以进行细胞移植，尤其是将干细胞诱导为起搏细胞，包括胚胎干细胞、诱导性多能干细胞和成体干细胞。由于骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)来源比较广泛，取材较方便、容易，且没有伦理学限制，更有可能应用于临床，因此具有潜在的应用前景。本文主要对BMSCs和ADSCs向起搏样细胞的诱导分化进行综述。
1 骨髓间充质干细胞
间充质干细胞是一种非造血基质细胞，国际细胞治疗协会推荐用以下标准来鉴定间充质干细胞：①可差速贴壁；②在体外标准诱导环境下可诱导成软骨、骨和脂肪组织；③表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19和HLA-DR[4]。BMSCs由Friedenstein等[5]在1976年首次从小鼠骨髓中发现，此后对其分离、纯化和培养等进行了更进一步的深入研究，证实BMSCs具有成骨[6]、成软骨[7]、成肌[8]、成脂肪[9]等多向分化的能力。
1.1 BMSCs的免疫细胞表型
BMSCs的免疫细胞表型比较复杂，许多研究结果不尽相同，Russo等[10]认为BMSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105以及CD166，而在新鲜分离出来时不表达CD34、CD73；在培养过程中表达CD106、CD49f、PODXL，不表达CD49d、CD54。Minteer等[11]认为BMSCs还表达CD13、MHCⅠ，HLA-ABC，不表达CD34、CD38、CD45、HLA-DR、DP、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40、CD40L(CD154)等。
1.2 BMSCs向起搏样细胞的诱导分化
1.2.1 转染起搏基因
存在于起搏细胞的超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cation channel,HCN)在超极化时能够激活，并受cAMP调控，能够产生If电流，从而产生其动作电位的4期自动去极化，进而自发产生新的动作电位，达到起搏心脏的作用。HCN通道有4种，分别是HCN1、HCN2、HCN3、HCN4，其中存在于心脏中的有HCN1、HCN2、HCN4。Potapova等[12]首次应用电穿孔的方法将小鼠HCN2基因转染进人BMSCs中，随后将其与大鼠心肌细胞共培养或移植到犬左室心外膜下，记录到自动去极化的动作电位，并在心外膜下形成异位起搏点，与邻近心肌细胞产生缝隙连接。其后研究发现，移植细胞数量必须大于700 000个才能够发挥作用。Cheng等[13]通过慢病毒将小鼠HCN4转染进犬的BMSCs中，可产生If电流，注射至犬右心室壁中，在刺激犬迷走神经时，发现右室有其特定频率的自主搏动。Wei等[14]通过慢病毒转染小鼠HCN4进入犬BMSCs中，并注射至完全房室传导阻滞的犬左室前壁，发现犬的最大心率快于正常组，运动后的心率变异高于正常组。Zhou等[15]体外研究证实，通过慢病毒转染人HCN1的兔BMSCs，可产生IHCN1，可使与其共培养的新生兔心肌细胞跳动频率加快。Nong等[16]最近的研究表明，移植细胞的连接蛋白43表达低，可能是影响起搏效果的重要原因。这些研究表明向BMSCs中转染起搏基因，BMSCs可以产生If，体外和体内都能使得周围的心肌细胞产生跳动。但BMSCs本身并不具备起搏细胞的结构基础，仅用单一的基因转染无法成为起搏细胞。此外，基因转染后的BMSCs在体内的长时间效果尚需进一步研究。
1.2.2 化学诱导
在干细胞的研究过程中，5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-AZA)作为诱导剂，经常被用来诱导干细胞向心肌细胞的定向分化。研究发现，小鼠BMSCs经过5-AZA诱导后，部分能够自发跳动，并能检测到窦房结样和心室肌样的动作电位。Yang等[17]发现用10μmol/L 5-AZA诱导人BMSCs，4周后开始表达起搏基因HCN2、HCN4。用5-AZA和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导大鼠BMSCs 24 h后，与新生大鼠心肌细胞间接共培养，可分化成球状和杆状的细胞，检测到其窦房结样、心室肌样的动作电位，同时表达HCN4、Tbx3等和起搏细胞密切相关的基因，并进一步证实神经调节蛋白-1/酪氨酸蛋白激酶受体通路对大鼠BMSCs的这种分化起促进作用[18]。然而，由于5-AZA的细胞毒性及其致突变作用，目前没有报道使用5-AZA对BMSCs向起搏细胞诱导的动物实验，也限制了其在临床应用的价值。
1.2.3 共培养
干细胞所处的微环境、细胞间的直接接触是其定向分化的关键因素。因此，目前已经应用窦房结细胞、心肌细胞或者心肌裂解液、条件培养基等共培养，通过直接或者间接接触来诱导BMSCs向起搏样细胞的定向分化。宋波等[19]将3代大鼠BMSCs和大鼠窦房结组织混合但不直接接触，随着培养时间的延长(1～3周)，HCN4和connexin 40的表达水平均逐渐增加。Li等[18]用5-AZA和bFGF诱导大鼠BMSCs 24 h，再与新生大鼠心肌细胞间接共培养，检测到窦房结样动作电位及HCN4、Tbx3等起搏相关基因的表达。这些研究均未对诱导分化的具体机制进行研究，可以作为下一步的研究方向。
2 脂肪干细胞
ADSCs是一种脂肪来源的间充质干细胞，它是Zuk等[20]在2001年首次从人的脂肪抽吸物中发现大量类似干细胞的细胞，能够被诱导成骨、成软骨、成肌、成脂肪分化。ADSCs同BMSCs一样具有多向分化潜能，目前已被证实其成骨[21]、成软骨[22]、成肌[23]、成脂肪[24]等多向分化能力。
2.1 ADSCs的免疫细胞表型
ADSCs主要表达CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、HLA-II[25]。Minteer等[11]认为其表达CD13、CD29、CD34、CD73、CD90、CD105、CD166、MHCⅠ、HLA-ABC，不表达CD38、CD45、CD106、HLA-DR、DP、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40、CD40L。Russo等[10]认为ADSCs和BMSCs都表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105以及CD166，但ADSCs在新鲜分离时会表达CD34，在培养过程中会表达CD49d、CD54，不表达CD106、CD49f、PODXL。
2.2 ADSCs向起搏样细胞的诱导分化
2.2.1 转染基因
对ADSCs转染起搏基因的研究，国内外报道的比较少，李勇等[26]将人HCN2基因转染进大鼠ADSCs中，并将其与乳鼠心室肌细胞共培养，发现ADSCs能表达较强的人HCN2基因及蛋白，产生If电流，并能使心室肌细胞的自发性搏动明显增快增强。Li等[27]通过慢病毒使CD73+的ADSCs过表达Gata4、Baf60c、Tbx5，8 d后分化为自发跳动的细胞，频率为80～120次/min，但并未鉴定是否为起搏细胞，也未检测其是否具有起搏特征，因此尚有待更深入的研究。
2.2.2 化学诱导
Rangappa等[28]在2003年首次利用不同浓度的5-AZA来诱导兔腹部脂肪来源的ADSCs，2周后20%~30%的细胞表现出球样形态，3周后这些细胞开始自发跳动，但对跳动细胞是否为起搏细胞未做鉴定。而Yang等[17]将人BMSCs和ADSCs经10μmol/L 5-AZA诱导48 h，4周后，通过比较发现，ADSCs增殖能力强于BMSCs，肌钙蛋白I表达也高于BMSCs，且起搏基因HCN2、HCN4等表达的时间比BMSCs早，表达量也比BMSCs多，认为ADSCs更容易诱导。然而，并不是所有的ADSCs经5-AZA诱导都可以向起搏样细胞分化，Lee等[29]分别用5、10μmol/L 5-AZA诱导人腹部皮下脂肪来源的ADSCs，观察8周，并没发现其分化为跳动的细胞，也未做起搏特征的鉴定。因此，5-AZA诱导ADSCs向起搏细胞分化尚存争论，其机制也不是很清楚，还有待更深入的探索。
2.2.3 共培养
研究发现，将人皮下脂肪来源的ADSCs与4～6周大鼠心肌提取液共培养，可观察到细胞有跳动现象。Choi等[30]将人皮下脂肪来源的ADSCs与新生大鼠心肌细胞(1∶10)直接接触共培养，1周后细胞能够自发跳动，检测到细胞钙瞬变、与周围心肌细胞形成缝隙连接，具有一定的起搏特征。但其他一些研究却得到了阴性结果，可能与组织来源、诱导条件差异有关，但具体原因尚不明确。
2.2.4 特定培养基培养
Planat-Bénard等[31]发现6周龄小鼠腹股沟和肩胛间的ADSCs在含有15%胎牛血清的甲基纤维素培养基培养下，1～2周后可以自发地分化为跳动的心肌细胞，自发产生动作电位。结合药理学检测，认为心肌细胞中混有起搏细胞。Palpant等[32]筛选出小鼠肩胛间Sca1+/c-kit+的ADSCs在上述条件培养1周后，分化为自发跳动的细胞，通过检测钙瞬变，证明其有起搏功能，指出非经典Wnt通路在其中起到促进的作用。Zhao等[33]也做了类似的研究，发现ADSCs自发地分化为跳动的细胞，证实Rho因子相关蛋白激酶起着重要的作用，但并没有对这些细胞进行鉴定。然而这些研究未严格区分ADSCs是来源于白色脂肪还是棕色脂肪。Dromard等[34]证实心肌样细胞跳动与培养基中钙的含量有关，同时认为这些能够分化为起搏样细胞的干细胞主要来自于棕色脂肪。
Jumabay等[35]用含有20%胎牛血清的常规培养基培养小鼠去分化白色脂肪细胞2周后，发现一些自发跳动的细胞，并具有4期自动去极化的特点，具有起搏细胞的特性。而Yamada等[36]从小鼠棕色脂肪组织中筛选出CD29+的ADSCs，用含有10%胎牛血清的常规培养基培养后发现有部分细胞能够自发跳动。Liu等[37]对从棕色脂肪组织中分离ADSCs的方法进行改进，提高了跳动细胞的比例。但两者并未对这些跳动的细胞进行起搏特征的鉴定。陈磊等[38]在体外用含有15%胎牛血清的常规培养基培养来自小鼠肩胛间棕色脂肪的ADSCs，发现可分化为自发跳动的细胞，并证实这些自发跳动的细胞具有起搏特征，同时证实经典Wnt通路在棕色脂肪源性ADSCs自发分化为起搏样细胞中的重要作用。
无论是甲基纤维素培养基诱导还是含有不同浓度胎牛血清的常规培养基诱导，相比于其他方法，更加容易、方便。但是，这些细胞中起搏细胞的比例都比较低，目前还不能满足作为起搏种子细胞的要求。此外，上述研究都局限在二维条件，有待深入到三维条件下和动物实验中进行验证。
3 前景展望
ADSCs比BMSCs来源更加广泛，取材容易，安全性高，而且ADSCs的增殖活性、分化能力等不逊于BMSCs，因此更有临床应用价值。虽然目前间充质干细胞向起搏样细胞分化的研究已经有了很大的进展，但是距离构建生物起搏器还有很长的一段路要走，迫切需要更多更深入的研究。如对干细胞的诱导方法还须进一步改进，提高起搏样细胞的分化比例；通过筛选某个标志或者其他的方法，纯化起搏样细胞；对干细胞定向分化为起搏样细胞的主要机制还有待深入地研究和探讨，从而更好地调控干细胞向起搏样细胞的定向分化；三维条件下细胞诱导分化、在体条件下的动物实验也是下一步研究的方向。