肿瘤多药耐药性(MDR)是临床上肿瘤化疗失败的主要原因，其中由多药耐药基因(MDR1)编码的P-糖蛋白(P-gp)又在MDR发生机制中占重要作用。本实验设计合成特异性沉默MDR1基因的小干扰RNA（siRNA），协同抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)共同包裹于固体脂质纳米粒(SLNs)中，利用基因治疗和化学治疗的协同作用，以期克服肿瘤多药耐药性。实验包括制备siRNA-紫杉醇固体脂质纳米粒(siRNA-PTX-SLNs)；检测载药SLNs对肿瘤细胞的增殖抑制作用；测定给药后PTX的细胞摄取率；采用实时荧光定量PCR和流式细胞法评价siRNA-PTX-SLNs对MDR1表达的沉默作用。结果显示在耐药细胞MCF-7/ADR中siRNA-PTX-SLNs能够显著提高PTX细胞摄取率，有效沉默MDR1的表达，抑制P-gp的外排作用，促进P-gp底物在细胞的蓄积。因此siRNA-PTX-SLNs可发挥克服肿瘤多药耐药性的协同治疗作用。
引用本文： 黄蕊, 姚欣宇, 陈媛, 孙逊, 林芸竹. 小干扰RNA-紫杉醇固体脂质纳米粒克服肿瘤多药耐药性的体外细胞学研究. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(1): 108-114. doi: 10.7507/1001-5515.20160020 复制
引言
癌症是严重威胁人类生命健康的重大疾病之一，临床上的治疗手段多为手术切除及化学治疗。但目前肿瘤的化学治疗存在两大障碍：一是肿瘤水平上的生理结构障碍，即肿瘤组织内无序的血管结构、升高的间质液压和缺乏淋巴导管等使得药物很难到达肿瘤组织内部[1-2]；二是细胞水平的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)障碍，包括药物外排泵、基因及蛋白水平修复和抑制肿瘤凋亡、化学药物靶点变化等[3-5]。MDR的产生是多种基因产物共同作用的结果，肿瘤细胞只要对一种化疗药物产生耐药后会对其他不同结构、不同作用机制和作用靶点的药物产生交叉耐药，导致肿瘤化疗失败。根据药物作用靶点，MDR大体可分为5类，其中由MDR1基因编码的P-糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)是一种在肿瘤细胞高度表达的跨膜糖蛋白，起药物外排泵作用，是MDR产生的最重要原因[6]。
小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)是一种小分子RNA分子，能够诱导细胞内相应的mRNA降解而引起转录后基因沉默现象，即RNA干扰(RNA interference,RNAi)。目前已有研究发现siRNA通过脂质体、纳米粒等可对癌症基因产生明显的沉默效果，并在小鼠体内发现了明显的肿瘤抑制作用[7-8]。此外，紫杉醇(paclitaxel,PTX)是一种常用的化疗药物，临床研究表明，PTX对卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤等均有很好的疗效。
前期实验中，我们首先设计合成了对MDR1基因具有明显沉默作用的siRNA[9-10]，利用固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles,SLNs) 作为siRNA及PTX的共同药物传递系统，已经成功制备了同时包裹siRNA和PTX的固体脂质纳米粒(siRNA-PTX-SLNs)[11]。本文针对肿瘤的多药耐药性，进一步对siRNA-PTX-SLNs的细胞药效学进行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料
大豆磷脂(soybean phosphatidyl choline,SPC)购自上海太伟药业有限公司。单硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate,GMS)购自成都科龙化工试剂厂。胆固醇(Chol)购自上海伯奥生物科技有限公司。1-(2,3-二油酰基)-N,N,N-三甲胺丙烷甲基硫酸盐(DOTAP)购自Avanti polar lipids公司。Pluronic F68购自南京威尔公司。紫杉醇购自西安昊轩生物科技有限公司。紫杉醇注射液为重庆太极制药生产。BCA试剂盒购自Thermo Scientific公司。针对MDR1基因设计构建具有沉默MDR1基因作用的特异性siRNA(5＇-GGAAAAGAAACCAACTGTCdTdT-3＇)购自广州市锐博生物科技有限公司。RNase A购自美国Sigma公司。Lipofectamine2000(LIPO)商品化脂质转染试剂购自美国Invitrogen公司。RNA prep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒、TIANScript cDNA第一链合成试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。SsoFast Eva Green购自美国Bio-Rad公司。MDR1和β-actin上下游引物均由上海生工合成。人乳腺癌细胞MCF-7由本实验室保存。人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR由北京大学吕万良教授赠送，该细胞系从亲代细胞经阿霉素筛选而得，为多药耐药细胞系，对PTX具有耐药性[12-13]。MCF-7和MCF-7/ADR细胞均使用DMEM完全培养基(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)培养于37 ℃的5% CO2培养箱中。
1.2 方法
1.2.1 siRNA-PTX-SLNs的制备
按本实验室研发方法自行制备siRNA-PTX-SLNs[11]。将150 μL含0.4 mg DOTAP的三氯甲烷溶液、150 μL含1 nmol siRNA的ddH2O和330 μL甲醇充分混合。于25 ℃静置1 h后，分别加入300 μL三氯甲烷和300 μL ddH2O并混合均匀，于3 000 r/min离心10 min使溶液分层。小心收集下层溶解有DOTAP-siRNA复合物的有机相，加入15 mL乙酸乙酯、3.25 mg GMS、12.95 mg SPC、0.5 mg Chol及0.8 mg PTX。于50 ℃水浴中搅拌10 min。旋转蒸发除去有机溶剂形成薄膜，加入4 mL水相(5%葡萄糖+0.1% F68)重新分散薄膜，探头超声(100 W，20次，每次5 s、间隔7 s)后，即得siRNA-PTX-SLNs。不含siRNA和PTX的空白SLNs以及PTX-SLNs、siRNA-SLNs按相似方法制得。
1.2.2 空白SLNs的细胞毒性研究
将MCF-7和MCF-7/ADR细胞按每孔1×104个细胞的密度接种于96孔培养板中，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h。弃去培养基，分别给予100 μL空白SLNs溶液和LIPO溶液(给药量分别为对应载药纳米粒中siRNA浓度为50、100、200和400 nmol/L时的量)，孵育4 h后，更换为100 μL完全培养基继续培养48 h。每孔弃去培养基，加入100 μL MTT溶液(培养基稀释终浓度至0.5 mg/mL)，继续孵育4 h，小心弃去MTT溶液，加入150 μL DMSO，37 ℃摇床中振摇孵育100 r/min×10 min，于酶联免疫检测仪测定波长490 nm处紫外吸收值(ODsample)，同时，以不加药物处理的细胞组作为对照孔(ODcontrol)，不加细胞的孔为调零孔(ODblank)，每组设5个复孔。按下式计算细胞存活率(cell viability，CV)：CV=(ODsample-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)×100%。
1.2.3 siRNA-PTX-SLNs对肿瘤细胞增殖抑制作用的研究
将MCF-7和MCF-7/ADR细胞按每孔1×104个细胞的密度接种于96孔培养板中，于37 ℃、 5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h。弃去培养基，分别给予不同的给药组，包括游离PTX、游离siRNA、游离siRNA+PTX、PTX-SLNs、siRNA-SLNs、siRNA-PTX-SLNs和siRNA-LIPO组，对应的siRNA浓度为50 nmol/L，PTX浓度为40 μg/mL。孵育4 h后，更换为100 μL完全培养基继续培养48 h。每孔弃去培养基，加入100 μL MTT溶液(培养基稀释终浓度至0.5 mg/mL)，继续孵育4 h，小心弃去MTT溶液，加入150 μL DMSO，37 ℃摇床中振摇孵育100 r/min×10 min，于酶联免疫检测仪测定波长490 nm处紫外吸收值，同时以不加药物处理的细胞组作为对照孔，不加细胞的孔为调零孔，每组设5个复孔。按1.2.2公式计算各组CV。
1.2.4 siRNA-PTX-SLNs的细胞药效学机制研究
(1)PTX-SLNs在MCF-7/ADR上的摄取研究：将MCF-7/ADR细胞按每孔5×105个细胞的密度接种于6孔培养板中。待细胞生长融合率达到50%左右，分别加入样品溶液：游离PTX、PTX-SLNs，其中PTX浓度为40 μg/mL。4 h后，除去药液，清洗并消化细胞，反复冻融获得细胞裂解样品。用BCA试剂盒测定样品蛋白含量，余下样品甲醇溶解后采用HPLC法检测PTX含量，HPLC方法如下：Kromasil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈∶水=55∶45，检测波长227 nm，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量20 μL按下式计算PTX摄取指数(μg/mg)：PTX摄取指数(μg/mg)=PTX浓度( g/mL)／蛋白质浓度(mg/mL)。
(2)RT-PCR法检测siRNA-PTX-SLNs对MDR1基因的沉默作用：将MCF-7/ADR细胞按每孔1×105个细胞的密度接种于12孔板中。于37 ℃、 5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h，用无血清培养基清洗细胞后，分别加入样品溶液空白SLNs、游离PTX、游离siRNA、游离siRNA+PTX、PTX-SLNs、siRNA-SLNs及siRNA-PTX-SLNs。以未经处理的MCF-7/ADR的细胞做为阴性对照组，以商品化LIPO制备的siRNA(siRNA-Lipo)做为阳性对照组。相应给药浓度为siRNA 50 nmol/L，PTX 40 μg/mL孵育4 h后更换新鲜完全培养基，继续培养48 h。培养完成后收集细胞，用RNA prep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒按说明书提取细胞总RNA，用cDNA第一链合成试剂盒逆转录得到cDNA。通过实时荧光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)对样品中的MDR1基因表达进行定量检测。采用SsoFast Eva Green按说明书配制PCR反应液，其中MDR1上下游引物序列分别为5′-ATATCAGCAGCCCACATCAT-3′，5′-GAAGCACTGGGATGTCCGGT-3′。在RT-PCR系统上进行PCR反应，反应条件为95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40 次循环。同时测定β-actin表达量作为内参，通过系统自带软件进行定量分析，得到MDR1的相对表达量[14]。
(3)Rhodamine-123排染实验检测siRNA-PTX-SLNs对细胞P-gp功能的影响：Rhodamine-123是P-gp底物，通过流式细胞仪检测Rhodamine-123在细胞中的蓄积可以间接地评价P-gp的功能。将MCF-7/ADR细胞按每孔5×105个细胞的密度接种于6孔培养板中，待细胞生长融合率达到约50%，分别加入样品溶液空白SLNs、LIPO、游离siRNA、游离PTX、游离siRNA+PTX、PTX-SLNs、siRNA-SLNs、siRNA-PTX-SLNs及siRNA-LIPO。培养4 h后，更换新鲜完全培养基继续培养48 h后弃去培养基，加入2 mL含有2 μg/mL Rhodamine-123的无血清培养基，继续培养3 h。弃去Rhodamine-123溶液并用PBS清洗细胞三次，胰酶消化细胞获得单细胞悬液，再次清洗细胞后用0.5 mL PBS重悬，使用流式细胞仪检测Rhodamine-123在细胞中的蓄积情况：激发光波长为488 nm，发射光波长大于630 nm。将未作其他处理仅给与Rhodamine-123的MCF-7/ADR细胞组做为参比组，即荧光强度为100%，计算各组相对荧光强度。
2 结果
2.1 空白SLNs的细胞毒性研究
结果如图 1所示，在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中，随着SLNs的增加，细胞存活率均逐渐降低，说明随着阳离子脂质材料DOTAP的增加，SLNs的细胞毒性逐渐升高，相同结果在商品化LIPO上也存在。对于耐药细胞MCF-7/ADR，当空白SLNs和商品化LIPO的量增加到对应的含药载体的siRNA剂量为400 nmol/L时，两者均表现出明显的毒性。而当用量降低至200 nmol/L以下时，两者均无明显毒性，因此，该制剂的细胞药效学研究选取对应siRNA剂量为200 nmol/L作为给药浓度。此外，在亲代细胞MCF-7中，SLNs的用量在对应的含药载体的siRNA剂量为100 nmol/L以下时，未表现出明显毒性。
图1
MTT法检测空白SLN及LIPO在MCF-7/ADR和MCF-7上的细胞毒性(n=5)
Figure1.
Cell toxicity of MCF-7/ADR and MCF-7 after treated with blank SLNs and LIPO (n=5) detected using MTT
2.2 siRNA-PTX-SLNs对肿瘤细胞增殖抑制作用的研究
根据空白SLNs细胞毒性实验结果，本部分研究中给药剂量对应为siRNA浓度为50 nmol/L，PTX浓度为40 μg/mL，以排除空白SLNs以及LIPO载体毒性干扰。给药后肿瘤细胞的增殖抑制结果如图 2所示。在MCF-7和MCF-7/ADR两种细胞中，游离siRNA、siRNA-SLNs和siRNA-LIPO均未表现出明显细胞抑制作用，其细胞存活率均在95%以上，说明在此给药剂量下，载体本身以及siRNA均无肿瘤细胞抑制作用。相反，除在MCF-7/ADR细胞上的游离PTX组未表现出明显细胞抑制作用以外，其余含PTX的给药组在MCF-7和MCF-7/ADR两种细胞中均表现出不同程度的细胞抑制作用，其中使用SLNs作为载体的PTX-SLNs组和siRNA-PTX-SLNs组的细胞增殖抑制作用显著高于无载体的游离PTX组和游离siRNA+PTX组(P＜0.05)。更重要的是，在耐药细胞株MCF-7/ADR中，siRNA-PTX-SLNs的肿瘤细胞抑制作用显著高于PTX-SLNs组(P＜0.05)，而在亲代细胞株MCF-7中，两组的肿瘤细胞增殖抑制作用未表现出明显统计学的差异。
图2
MTT法测定不同给药组对耐药细胞MCF-7/ADR和亲代细胞MCF-7的增殖抑制作用(n=5)
Figure2.
Inhibitory function to cell viability of MCF-7/ADR and MCF-7 detected using MTT after treated by different preparations (n=5)
2.3 siRNA-PTX-SLNs的细胞药效学机制研究
2.3.1 PTX-SLNs在MCF-7/ADR上的摄取研究
结果显示，PTX-SLNs组的PTX摄取指数显著高于游离PTX组(PTX摄取指数分别为7.07 μg/mg和3.63 μg/mg，P＜0.05)，此结果同肿瘤细胞增殖抑制实验结果一致。
2.3.2 RT-PCR法检测siRNA-PTX-SLNs对MDR1基因的沉默作用
本部分采用RT-PCR检测法对siRNA-PTX-SLNs的MDR1基因沉默作用进行研究。结果如图 3所示，与未处理组相比，游离PTX组及游离PTX+siRNA组表现出更低的MDR1 mRNA表达水平(P＜0.05)，然而游离siRNA组未表现出明显差异。此外，以SLNs及LIPO作为载体的PTX-SLNs组、siRNA-SLNs组、siRNA-Lipo组及siRNA-PTX-SLNs组的MDR1mRNA表达水平显著低于其他所有组(P＜0.05)，其中siRNA-PTX-SLNs组更优于PTX-siRNA组和siRNA-SLNs组(P＜0.05)。
图3
RT-PCR检测不同给药组对耐药细胞MCF-7/ADR的MDR1沉默作用(n=3)
Figure3.
Quantitative real-time PCR for MDR1 in MCF7/ADR cells showing inhibited expression of MDR1 by siRNA delivered with SLNs (n=3)
2.3.3 Rhodamine-123排染实验检测siRNA-PTX-SLNs对细胞P-gp功能的影响
流式细胞检测结果如图 4所示，以未处理的MCF-7/ADR细胞为参比，空白SLNs组和LIPO组的相对荧光强度均接近100%，可排除空白SLNs及LIPO对Rhodamine-123在细胞内荧光强度的影响；此外，游离siRNA组也未明显提高Rhodamine-123在细胞内的相对荧光强度。其余组别均显著提高了Rhodamine-123在细胞内的相对荧光强度(P＜0.05)，其中也包括游离PTX组、游离siRNA+PTX组及PTX-SLNs组。采用载体传递的siRNA组，包括siRNA-SLNs组、siRNA-PTX-SLNs和siRNA-LIPO组均能显著性提高相对荧光强度(P＜0.05)，更重要的是，与siRNA-SLNs组和PTX-SLNs组相比，siRNA-PTX-SLNs组效率最高(P＜0.05)，最为接近siRNA-LIPO组的效率，这与前述RT-PCR法测定结果相一致。
图4
流式细胞检测不同给药组对Rhodamine-123在细胞中蓄积的影响(n=3)
中文注解
Figure4. Treatment by siRNA loaded with SLNs enhanced Rhodamine-123 accumulation in MCF-7/ADR cells (n=3)英文注解
3 讨论
肿瘤细胞接触抗肿瘤药物后，对该药物以及与该药物化学结构和作用机制不同的其他药物均可能产生交叉耐药，这种现象被称为MDR。MDR已成为临床上肿瘤化疗失败的主要原因[15]，形成机制复杂，其中MDR1编码的P-gp在MDR发生机制中起着极为重要的作用[16-17]。目前，国内外研究者针对肿瘤MDR，尤其是针对P-gp所介导的肿瘤MDR已研发了多种治疗方法，然而其中多数方法缺乏特异性和安全性，因此在临床的研究和应用中存在一定的局限性。siRNA是一种长度在21~23 bp的双链RNA分子，可用于诱导基因沉默，即常见的RNA干扰技术，其优点在于设计方便，序列可控，具有高效、特异的基因沉默作用。但siRNA在应用中也存在严重的缺陷，即极易被RNA酶降解，且其亲水性大分子的性质使其不易透过细胞膜，因此单独的siRNA给药后效果并不理想，在临床的应用中存在障碍。此外，作为临床上广为应用的一线抗癌药物，PTX在MDR机制的研究中应用也十分广泛，但其水溶性极差的性质也限制了PTX在临床上的应用。
SLNs是近年发展起来的新一代亚微粒给药系统，通常采用生物可降解的类脂作为材料，粒径在10~1000 nm之间，具有低毒性、高载药量、缓释以及靶向性等优点[18]。作为一种纳米级给药体系，通过增强渗透与滞留效应(enhanced permeability and retention effect，PR)可被动到达肿瘤组织内部，从而提高药物在肿瘤细胞内浓度，降低在正常细胞内浓度，克服肿瘤组织水平上的物理障碍，达到高效低毒的目的[19-20]。当药物到达肿瘤细胞后，即将面临的便是细胞水平的MDR。为此，在本研究中，我们设计制备了同时包裹可特异性沉默MDR1基因的siRNA与PTX的SLNs药物传递体系siRNA-PTX-SLNs，利用SLNs的性质克服肿瘤组织水平上的障碍，再利用siRNA特异性沉默MDR1基因，以对抗细胞水平上MDR，进而发挥对肿瘤细胞的协同抑制作用[21-22]。实验结果显示，在细胞毒性实验中，仅当空白SLNs用量非常大时才表现出一定的细胞毒性作用，证实该材料具有一定的安全性。在肿瘤细胞增殖抑制实验中，SLNs作为载体的药物组比相应游离药物组的细胞增殖抑制作用显著提高，一方面说明SLNs能够提高siRNA的稳定性，并促进siRNA的摄取和基因沉默作用，另一方面说明SLNs也能促进PTX的细胞摄取及其抗肿瘤作用。此外，肿瘤细胞增殖抑制实验中还发现在耐药细胞MCF-7/ADR中siRNA和PTX共给药可以发挥协同作用，而在亲代细胞MCF-7中，siRNA和PTX共给药并未产生更优的抑制作用。由此说明siRNA-PTX-SLNs具有克服肿瘤多药耐药性的作用，其机制可能与siRNA下调MDR1的表达有关。PTX的摄取实验中，PTX-SLNs可以高效地将所包载PTX传递进入细胞中，原因可能为阳性脂质DOTAP可以与带负电荷的细胞表面发生相互作用而更容易进入细胞，进而提高PTX的细胞传递效率，增加细胞内药物浓度，发挥抑制肿瘤细胞作用。通过比较不同给药组对MDR1基因的沉默作用，结果发现单独使用siRNA对耐药细胞中的MDR1表达量基本没有影响，说明游离siRNA易降解，未能发挥下调作用，但游离PTX组较游离siRNA组表现出更低的MDR1 mRNA表达水平(P＜0.05)，表明PTX具有一定的MDR1表达抑制作用。而使用SLNs包载siRNA时，由于提高siRNA的稳定性和细胞传递效率，能够显著沉默MDR1的表达。其中siRNA-PTX-SLNs表现出更优的MDR1基因沉默效率，且与siRNA-LIPO的结果相近。众所周知，LIPO是一种多用途转染试剂，可在各种贴壁和悬浮细胞系中提供高效转染，还可以利用LIPO进行基于siRNA的基因表达研究，常作为评价siRNA传递系统效率的金标准，在基因沉默实验中通过高效的转染可以得到极高的基因沉默水平。因此，本研究构建的siRNA-PTX-SLNs具有与siRNA-LIPO相近的基因沉默效率，这一结果说明该共给药体系也具有优秀的传递siRNA进入细胞发挥特异性基因沉默作用的能力。MDR1基因的沉默作用可导致肿瘤细胞中具有外排药泵功能的P-gp表达量显著降低，本实验采用的Rhodamine-123是一种膜电位敏感的亲脂性阳离子荧光材料，能够快速通过细胞膜，同时还是一种特异性极强的P-gp底物，已有很多研究通过检测Rhodamine-123在细胞内蓄积的情况，间接反映细胞膜上P-gp水平[23-24]。在Rhodamine-123排染实验中，给药组的相对荧光强度越高，表示Rhodamine-123被外排出细胞的量越少，即P-gp功能下降，说明MDR1基因表达下调，这一结果与各给药组的MDR1基因沉默实验一致。其中siRNA本身不稳定易被降解，且难以进入细胞发挥沉默作用，因此未显著提高Rhodamine-123的蓄积，而游离PTX组、游离siRNA+PTX组及PTX-SLNs组的结果说明PTX会促进Rhodamine-123在细胞中的蓄积，采用载体传递的siRNA组均能显著性提高相对荧光强度(P＜0.05)，说明siRNA在载体的帮助下可以进入细胞发挥MDR1沉默作用，从而减少P-gp对Rhodamine-123的外排；此外，同样作为P-gp底物的抗肿瘤药物PTX在与MDR1基因特异性siRNA共给药时，由于MDR1的表达下调而外排减少，提高了PTX在肿瘤细胞中的蓄积，进而发挥更优的肿瘤抑制作用。综上所述，在MCF-7/ADR细胞上进行的药效学实验表明，本研究构建的MDR1特异性siRNA和PTX共给药体系siRNA-PTX-SLNs，与其他给药组相比具有更强的MDR1基因沉默作用，能够抑制P-gp功能，可有效克服肿瘤的多药耐药性。
本研究制备的siRNA-PTX-SLNs，一方面利用SLNs的优势，提高siRNA稳定性及PTX的水溶性，绕开肿瘤水平的生理结构障碍，通过阳性脂质材料促进药物的细胞摄取；一方面通过siRNA及PTX的共给药，在细胞学水平上沉默MDR1基因表达，从而抑制药物外排，促进药物在肿瘤细胞内积累，达到更好的肿瘤抑制作用。实验结果显示其在耐药肿瘤细胞株中具有明显的肿瘤抑制作用，说明该给药体系能通过以上药理机制，有效克服肿瘤的多药耐药性，为以后肿瘤多药耐药治疗和研究提供了良好的思路，具有重要的意义和广泛的应用前景。
引言
癌症是严重威胁人类生命健康的重大疾病之一，临床上的治疗手段多为手术切除及化学治疗。但目前肿瘤的化学治疗存在两大障碍：一是肿瘤水平上的生理结构障碍，即肿瘤组织内无序的血管结构、升高的间质液压和缺乏淋巴导管等使得药物很难到达肿瘤组织内部[1-2]；二是细胞水平的多药耐药性(multidrug resistance,MDR)障碍，包括药物外排泵、基因及蛋白水平修复和抑制肿瘤凋亡、化学药物靶点变化等[3-5]。MDR的产生是多种基因产物共同作用的结果，肿瘤细胞只要对一种化疗药物产生耐药后会对其他不同结构、不同作用机制和作用靶点的药物产生交叉耐药，导致肿瘤化疗失败。根据药物作用靶点，MDR大体可分为5类，其中由MDR1基因编码的P-糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)是一种在肿瘤细胞高度表达的跨膜糖蛋白，起药物外排泵作用，是MDR产生的最重要原因[6]。
小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)是一种小分子RNA分子，能够诱导细胞内相应的mRNA降解而引起转录后基因沉默现象，即RNA干扰(RNA interference,RNAi)。目前已有研究发现siRNA通过脂质体、纳米粒等可对癌症基因产生明显的沉默效果，并在小鼠体内发现了明显的肿瘤抑制作用[7-8]。此外，紫杉醇(paclitaxel,PTX)是一种常用的化疗药物，临床研究表明，PTX对卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤等均有很好的疗效。
前期实验中，我们首先设计合成了对MDR1基因具有明显沉默作用的siRNA[9-10]，利用固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles,SLNs) 作为siRNA及PTX的共同药物传递系统，已经成功制备了同时包裹siRNA和PTX的固体脂质纳米粒(siRNA-PTX-SLNs)[11]。本文针对肿瘤的多药耐药性，进一步对siRNA-PTX-SLNs的细胞药效学进行了研究。
1 材料和方法
1.1 材料
大豆磷脂(soybean phosphatidyl choline,SPC)购自上海太伟药业有限公司。单硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate,GMS)购自成都科龙化工试剂厂。胆固醇(Chol)购自上海伯奥生物科技有限公司。1-(2,3-二油酰基)-N,N,N-三甲胺丙烷甲基硫酸盐(DOTAP)购自Avanti polar lipids公司。Pluronic F68购自南京威尔公司。紫杉醇购自西安昊轩生物科技有限公司。紫杉醇注射液为重庆太极制药生产。BCA试剂盒购自Thermo Scientific公司。针对MDR1基因设计构建具有沉默MDR1基因作用的特异性siRNA(5＇-GGAAAAGAAACCAACTGTCdTdT-3＇)购自广州市锐博生物科技有限公司。RNase A购自美国Sigma公司。Lipofectamine2000(LIPO)商品化脂质转染试剂购自美国Invitrogen公司。RNA prep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒、TIANScript cDNA第一链合成试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。SsoFast Eva Green购自美国Bio-Rad公司。MDR1和β-actin上下游引物均由上海生工合成。人乳腺癌细胞MCF-7由本实验室保存。人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR由北京大学吕万良教授赠送，该细胞系从亲代细胞经阿霉素筛选而得，为多药耐药细胞系，对PTX具有耐药性[12-13]。MCF-7和MCF-7/ADR细胞均使用DMEM完全培养基(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)培养于37 ℃的5% CO2培养箱中。
1.2 方法
1.2.1 siRNA-PTX-SLNs的制备
按本实验室研发方法自行制备siRNA-PTX-SLNs[11]。将150 μL含0.4 mg DOTAP的三氯甲烷溶液、150 μL含1 nmol siRNA的ddH2O和330 μL甲醇充分混合。于25 ℃静置1 h后，分别加入300 μL三氯甲烷和300 μL ddH2O并混合均匀，于3 000 r/min离心10 min使溶液分层。小心收集下层溶解有DOTAP-siRNA复合物的有机相，加入15 mL乙酸乙酯、3.25 mg GMS、12.95 mg SPC、0.5 mg Chol及0.8 mg PTX。于50 ℃水浴中搅拌10 min。旋转蒸发除去有机溶剂形成薄膜，加入4 mL水相(5%葡萄糖+0.1% F68)重新分散薄膜，探头超声(100 W，20次，每次5 s、间隔7 s)后，即得siRNA-PTX-SLNs。不含siRNA和PTX的空白SLNs以及PTX-SLNs、siRNA-SLNs按相似方法制得。
1.2.2 空白SLNs的细胞毒性研究
将MCF-7和MCF-7/ADR细胞按每孔1×104个细胞的密度接种于96孔培养板中，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h。弃去培养基，分别给予100 μL空白SLNs溶液和LIPO溶液(给药量分别为对应载药纳米粒中siRNA浓度为50、100、200和400 nmol/L时的量)，孵育4 h后，更换为100 μL完全培养基继续培养48 h。每孔弃去培养基，加入100 μL MTT溶液(培养基稀释终浓度至0.5 mg/mL)，继续孵育4 h，小心弃去MTT溶液，加入150 μL DMSO，37 ℃摇床中振摇孵育100 r/min×10 min，于酶联免疫检测仪测定波长490 nm处紫外吸收值(ODsample)，同时，以不加药物处理的细胞组作为对照孔(ODcontrol)，不加细胞的孔为调零孔(ODblank)，每组设5个复孔。按下式计算细胞存活率(cell viability，CV)：CV=(ODsample-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)×100%。
1.2.3 siRNA-PTX-SLNs对肿瘤细胞增殖抑制作用的研究
将MCF-7和MCF-7/ADR细胞按每孔1×104个细胞的密度接种于96孔培养板中，于37 ℃、 5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h。弃去培养基，分别给予不同的给药组，包括游离PTX、游离siRNA、游离siRNA+PTX、PTX-SLNs、siRNA-SLNs、siRNA-PTX-SLNs和siRNA-LIPO组，对应的siRNA浓度为50 nmol/L，PTX浓度为40 μg/mL。孵育4 h后，更换为100 μL完全培养基继续培养48 h。每孔弃去培养基，加入100 μL MTT溶液(培养基稀释终浓度至0.5 mg/mL)，继续孵育4 h，小心弃去MTT溶液，加入150 μL DMSO，37 ℃摇床中振摇孵育100 r/min×10 min，于酶联免疫检测仪测定波长490 nm处紫外吸收值，同时以不加药物处理的细胞组作为对照孔，不加细胞的孔为调零孔，每组设5个复孔。按1.2.2公式计算各组CV。
1.2.4 siRNA-PTX-SLNs的细胞药效学机制研究
(1)PTX-SLNs在MCF-7/ADR上的摄取研究：将MCF-7/ADR细胞按每孔5×105个细胞的密度接种于6孔培养板中。待细胞生长融合率达到50%左右，分别加入样品溶液：游离PTX、PTX-SLNs，其中PTX浓度为40 μg/mL。4 h后，除去药液，清洗并消化细胞，反复冻融获得细胞裂解样品。用BCA试剂盒测定样品蛋白含量，余下样品甲醇溶解后采用HPLC法检测PTX含量，HPLC方法如下：Kromasil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈∶水=55∶45，检测波长227 nm，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量20 μL按下式计算PTX摄取指数(μg/mg)：PTX摄取指数(μg/mg)=PTX浓度( g/mL)／蛋白质浓度(mg/mL)。
(2)RT-PCR法检测siRNA-PTX-SLNs对MDR1基因的沉默作用：将MCF-7/ADR细胞按每孔1×105个细胞的密度接种于12孔板中。于37 ℃、 5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h，用无血清培养基清洗细胞后，分别加入样品溶液空白SLNs、游离PTX、游离siRNA、游离siRNA+PTX、PTX-SLNs、siRNA-SLNs及siRNA-PTX-SLNs。以未经处理的MCF-7/ADR的细胞做为阴性对照组，以商品化LIPO制备的siRNA(siRNA-Lipo)做为阳性对照组。相应给药浓度为siRNA 50 nmol/L，PTX 40 μg/mL孵育4 h后更换新鲜完全培养基，继续培养48 h。培养完成后收集细胞，用RNA prep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒按说明书提取细胞总RNA，用cDNA第一链合成试剂盒逆转录得到cDNA。通过实时荧光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)对样品中的MDR1基因表达进行定量检测。采用SsoFast Eva Green按说明书配制PCR反应液，其中MDR1上下游引物序列分别为5′-ATATCAGCAGCCCACATCAT-3′，5′-GAAGCACTGGGATGTCCGGT-3′。在RT-PCR系统上进行PCR反应，反应条件为95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40 次循环。同时测定β-actin表达量作为内参，通过系统自带软件进行定量分析，得到MDR1的相对表达量[14]。
(3)Rhodamine-123排染实验检测siRNA-PTX-SLNs对细胞P-gp功能的影响：Rhodamine-123是P-gp底物，通过流式细胞仪检测Rhodamine-123在细胞中的蓄积可以间接地评价P-gp的功能。将MCF-7/ADR细胞按每孔5×105个细胞的密度接种于6孔培养板中，待细胞生长融合率达到约50%，分别加入样品溶液空白SLNs、LIPO、游离siRNA、游离PTX、游离siRNA+PTX、PTX-SLNs、siRNA-SLNs、siRNA-PTX-SLNs及siRNA-LIPO。培养4 h后，更换新鲜完全培养基继续培养48 h后弃去培养基，加入2 mL含有2 μg/mL Rhodamine-123的无血清培养基，继续培养3 h。弃去Rhodamine-123溶液并用PBS清洗细胞三次，胰酶消化细胞获得单细胞悬液，再次清洗细胞后用0.5 mL PBS重悬，使用流式细胞仪检测Rhodamine-123在细胞中的蓄积情况：激发光波长为488 nm，发射光波长大于630 nm。将未作其他处理仅给与Rhodamine-123的MCF-7/ADR细胞组做为参比组，即荧光强度为100%，计算各组相对荧光强度。
2 结果
2.1 空白SLNs的细胞毒性研究
结果如图 1所示，在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中，随着SLNs的增加，细胞存活率均逐渐降低，说明随着阳离子脂质材料DOTAP的增加，SLNs的细胞毒性逐渐升高，相同结果在商品化LIPO上也存在。对于耐药细胞MCF-7/ADR，当空白SLNs和商品化LIPO的量增加到对应的含药载体的siRNA剂量为400 nmol/L时，两者均表现出明显的毒性。而当用量降低至200 nmol/L以下时，两者均无明显毒性，因此，该制剂的细胞药效学研究选取对应siRNA剂量为200 nmol/L作为给药浓度。此外，在亲代细胞MCF-7中，SLNs的用量在对应的含药载体的siRNA剂量为100 nmol/L以下时，未表现出明显毒性。
图1
MTT法检测空白SLN及LIPO在MCF-7/ADR和MCF-7上的细胞毒性(n=5)
Figure1.
Cell toxicity of MCF-7/ADR and MCF-7 after treated with blank SLNs and LIPO (n=5) detected using MTT
2.2 siRNA-PTX-SLNs对肿瘤细胞增殖抑制作用的研究
根据空白SLNs细胞毒性实验结果，本部分研究中给药剂量对应为siRNA浓度为50 nmol/L，PTX浓度为40 μg/mL，以排除空白SLNs以及LIPO载体毒性干扰。给药后肿瘤细胞的增殖抑制结果如图 2所示。在MCF-7和MCF-7/ADR两种细胞中，游离siRNA、siRNA-SLNs和siRNA-LIPO均未表现出明显细胞抑制作用，其细胞存活率均在95%以上，说明在此给药剂量下，载体本身以及siRNA均无肿瘤细胞抑制作用。相反，除在MCF-7/ADR细胞上的游离PTX组未表现出明显细胞抑制作用以外，其余含PTX的给药组在MCF-7和MCF-7/ADR两种细胞中均表现出不同程度的细胞抑制作用，其中使用SLNs作为载体的PTX-SLNs组和siRNA-PTX-SLNs组的细胞增殖抑制作用显著高于无载体的游离PTX组和游离siRNA+PTX组(P＜0.05)。更重要的是，在耐药细胞株MCF-7/ADR中，siRNA-PTX-SLNs的肿瘤细胞抑制作用显著高于PTX-SLNs组(P＜0.05)，而在亲代细胞株MCF-7中，两组的肿瘤细胞增殖抑制作用未表现出明显统计学的差异。
图2
MTT法测定不同给药组对耐药细胞MCF-7/ADR和亲代细胞MCF-7的增殖抑制作用(n=5)
Figure2.
Inhibitory function to cell viability of MCF-7/ADR and MCF-7 detected using MTT after treated by different preparations (n=5)
2.3 siRNA-PTX-SLNs的细胞药效学机制研究
2.3.1 PTX-SLNs在MCF-7/ADR上的摄取研究
结果显示，PTX-SLNs组的PTX摄取指数显著高于游离PTX组(PTX摄取指数分别为7.07 μg/mg和3.63 μg/mg，P＜0.05)，此结果同肿瘤细胞增殖抑制实验结果一致。
2.3.2 RT-PCR法检测siRNA-PTX-SLNs对MDR1基因的沉默作用
本部分采用RT-PCR检测法对siRNA-PTX-SLNs的MDR1基因沉默作用进行研究。结果如图 3所示，与未处理组相比，游离PTX组及游离PTX+siRNA组表现出更低的MDR1 mRNA表达水平(P＜0.05)，然而游离siRNA组未表现出明显差异。此外，以SLNs及LIPO作为载体的PTX-SLNs组、siRNA-SLNs组、siRNA-Lipo组及siRNA-PTX-SLNs组的MDR1mRNA表达水平显著低于其他所有组(P＜0.05)，其中siRNA-PTX-SLNs组更优于PTX-siRNA组和siRNA-SLNs组(P＜0.05)。
图3
RT-PCR检测不同给药组对耐药细胞MCF-7/ADR的MDR1沉默作用(n=3)
Figure3.
Quantitative real-time PCR for MDR1 in MCF7/ADR cells showing inhibited expression of MDR1 by siRNA delivered with SLNs (n=3)
2.3.3 Rhodamine-123排染实验检测siRNA-PTX-SLNs对细胞P-gp功能的影响
流式细胞检测结果如图 4所示，以未处理的MCF-7/ADR细胞为参比，空白SLNs组和LIPO组的相对荧光强度均接近100%，可排除空白SLNs及LIPO对Rhodamine-123在细胞内荧光强度的影响；此外，游离siRNA组也未明显提高Rhodamine-123在细胞内的相对荧光强度。其余组别均显著提高了Rhodamine-123在细胞内的相对荧光强度(P＜0.05)，其中也包括游离PTX组、游离siRNA+PTX组及PTX-SLNs组。采用载体传递的siRNA组，包括siRNA-SLNs组、siRNA-PTX-SLNs和siRNA-LIPO组均能显著性提高相对荧光强度(P＜0.05)，更重要的是，与siRNA-SLNs组和PTX-SLNs组相比，siRNA-PTX-SLNs组效率最高(P＜0.05)，最为接近siRNA-LIPO组的效率，这与前述RT-PCR法测定结果相一致。
图4
流式细胞检测不同给药组对Rhodamine-123在细胞中蓄积的影响(n=3)
中文注解
Figure4. Treatment by siRNA loaded with SLNs enhanced Rhodamine-123 accumulation in MCF-7/ADR cells (n=3)英文注解
3 讨论
肿瘤细胞接触抗肿瘤药物后，对该药物以及与该药物化学结构和作用机制不同的其他药物均可能产生交叉耐药，这种现象被称为MDR。MDR已成为临床上肿瘤化疗失败的主要原因[15]，形成机制复杂，其中MDR1编码的P-gp在MDR发生机制中起着极为重要的作用[16-17]。目前，国内外研究者针对肿瘤MDR，尤其是针对P-gp所介导的肿瘤MDR已研发了多种治疗方法，然而其中多数方法缺乏特异性和安全性，因此在临床的研究和应用中存在一定的局限性。siRNA是一种长度在21~23 bp的双链RNA分子，可用于诱导基因沉默，即常见的RNA干扰技术，其优点在于设计方便，序列可控，具有高效、特异的基因沉默作用。但siRNA在应用中也存在严重的缺陷，即极易被RNA酶降解，且其亲水性大分子的性质使其不易透过细胞膜，因此单独的siRNA给药后效果并不理想，在临床的应用中存在障碍。此外，作为临床上广为应用的一线抗癌药物，PTX在MDR机制的研究中应用也十分广泛，但其水溶性极差的性质也限制了PTX在临床上的应用。
SLNs是近年发展起来的新一代亚微粒给药系统，通常采用生物可降解的类脂作为材料，粒径在10~1000 nm之间，具有低毒性、高载药量、缓释以及靶向性等优点[18]。作为一种纳米级给药体系，通过增强渗透与滞留效应(enhanced permeability and retention effect，PR)可被动到达肿瘤组织内部，从而提高药物在肿瘤细胞内浓度，降低在正常细胞内浓度，克服肿瘤组织水平上的物理障碍，达到高效低毒的目的[19-20]。当药物到达肿瘤细胞后，即将面临的便是细胞水平的MDR。为此，在本研究中，我们设计制备了同时包裹可特异性沉默MDR1基因的siRNA与PTX的SLNs药物传递体系siRNA-PTX-SLNs，利用SLNs的性质克服肿瘤组织水平上的障碍，再利用siRNA特异性沉默MDR1基因，以对抗细胞水平上MDR，进而发挥对肿瘤细胞的协同抑制作用[21-22]。实验结果显示，在细胞毒性实验中，仅当空白SLNs用量非常大时才表现出一定的细胞毒性作用，证实该材料具有一定的安全性。在肿瘤细胞增殖抑制实验中，SLNs作为载体的药物组比相应游离药物组的细胞增殖抑制作用显著提高，一方面说明SLNs能够提高siRNA的稳定性，并促进siRNA的摄取和基因沉默作用，另一方面说明SLNs也能促进PTX的细胞摄取及其抗肿瘤作用。此外，肿瘤细胞增殖抑制实验中还发现在耐药细胞MCF-7/ADR中siRNA和PTX共给药可以发挥协同作用，而在亲代细胞MCF-7中，siRNA和PTX共给药并未产生更优的抑制作用。由此说明siRNA-PTX-SLNs具有克服肿瘤多药耐药性的作用，其机制可能与siRNA下调MDR1的表达有关。PTX的摄取实验中，PTX-SLNs可以高效地将所包载PTX传递进入细胞中，原因可能为阳性脂质DOTAP可以与带负电荷的细胞表面发生相互作用而更容易进入细胞，进而提高PTX的细胞传递效率，增加细胞内药物浓度，发挥抑制肿瘤细胞作用。通过比较不同给药组对MDR1基因的沉默作用，结果发现单独使用siRNA对耐药细胞中的MDR1表达量基本没有影响，说明游离siRNA易降解，未能发挥下调作用，但游离PTX组较游离siRNA组表现出更低的MDR1 mRNA表达水平(P＜0.05)，表明PTX具有一定的MDR1表达抑制作用。而使用SLNs包载siRNA时，由于提高siRNA的稳定性和细胞传递效率，能够显著沉默MDR1的表达。其中siRNA-PTX-SLNs表现出更优的MDR1基因沉默效率，且与siRNA-LIPO的结果相近。众所周知，LIPO是一种多用途转染试剂，可在各种贴壁和悬浮细胞系中提供高效转染，还可以利用LIPO进行基于siRNA的基因表达研究，常作为评价siRNA传递系统效率的金标准，在基因沉默实验中通过高效的转染可以得到极高的基因沉默水平。因此，本研究构建的siRNA-PTX-SLNs具有与siRNA-LIPO相近的基因沉默效率，这一结果说明该共给药体系也具有优秀的传递siRNA进入细胞发挥特异性基因沉默作用的能力。MDR1基因的沉默作用可导致肿瘤细胞中具有外排药泵功能的P-gp表达量显著降低，本实验采用的Rhodamine-123是一种膜电位敏感的亲脂性阳离子荧光材料，能够快速通过细胞膜，同时还是一种特异性极强的P-gp底物，已有很多研究通过检测Rhodamine-123在细胞内蓄积的情况，间接反映细胞膜上P-gp水平[23-24]。在Rhodamine-123排染实验中，给药组的相对荧光强度越高，表示Rhodamine-123被外排出细胞的量越少，即P-gp功能下降，说明MDR1基因表达下调，这一结果与各给药组的MDR1基因沉默实验一致。其中siRNA本身不稳定易被降解，且难以进入细胞发挥沉默作用，因此未显著提高Rhodamine-123的蓄积，而游离PTX组、游离siRNA+PTX组及PTX-SLNs组的结果说明PTX会促进Rhodamine-123在细胞中的蓄积，采用载体传递的siRNA组均能显著性提高相对荧光强度(P＜0.05)，说明siRNA在载体的帮助下可以进入细胞发挥MDR1沉默作用，从而减少P-gp对Rhodamine-123的外排；此外，同样作为P-gp底物的抗肿瘤药物PTX在与MDR1基因特异性siRNA共给药时，由于MDR1的表达下调而外排减少，提高了PTX在肿瘤细胞中的蓄积，进而发挥更优的肿瘤抑制作用。综上所述，在MCF-7/ADR细胞上进行的药效学实验表明，本研究构建的MDR1特异性siRNA和PTX共给药体系siRNA-PTX-SLNs，与其他给药组相比具有更强的MDR1基因沉默作用，能够抑制P-gp功能，可有效克服肿瘤的多药耐药性。
本研究制备的siRNA-PTX-SLNs，一方面利用SLNs的优势，提高siRNA稳定性及PTX的水溶性，绕开肿瘤水平的生理结构障碍，通过阳性脂质材料促进药物的细胞摄取；一方面通过siRNA及PTX的共给药，在细胞学水平上沉默MDR1基因表达，从而抑制药物外排，促进药物在肿瘤细胞内积累，达到更好的肿瘤抑制作用。实验结果显示其在耐药肿瘤细胞株中具有明显的肿瘤抑制作用，说明该给药体系能通过以上药理机制，有效克服肿瘤的多药耐药性，为以后肿瘤多药耐药治疗和研究提供了良好的思路，具有重要的意义和广泛的应用前景。
