本研究旨在探究PTEN诱导激酶1短亚型(PINK1S)在细胞质中激酶活性调节机制。首先,通过免疫共沉淀筛选的方法证明PINK1S能够和酪蛋白激酶2(CK2)蛋白复合体中的β亚基(CK2β)相互结合,但不与其他两个催化亚基α1 (CK2α1)和α2 (CK2α2)结合。其次,同时过表达CK2β和PINK1S,利用免疫共沉淀的方法纯化PINK1S,将得到的PINK1S用生物素标记的磷酸化蛋白检测标签(Phos-tagTM Biotin)检测其磷酸化水平,发现CK2β能够促进PINK1S的自我磷酸化。最后,利用RNA干扰技术,建立干扰CK2β的细胞株;在对照组和干扰CK2β的实验组细胞内表达PINK1S,发现缺少CK2β表达导致PINK1S的磷酸化水平降低。本文研究表明:CK2β作为胞质PINK1S自我磷酸化的辅助亚基,对其活性起到正调节作用。
引用本文： 秦思月, 姜长安. CK2β促进PINK1S自我磷酸化. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(5): 1056-1060. doi: 10.7507/1001-5515.20150187 复制
引言
帕金森氏病是当今三大神经退行性疾病之一，其病因主要是多巴胺神经元的死亡[1]。PTEN诱导激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)是一种线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是遗传性帕金森氏病的主要相关蛋白[2]。PINK1长亚型(PINK1 long isoform,PINK1L)会在跨膜电位下降的线粒体外膜上积累，促进损伤的线粒体通过自噬途径清除[3]。另外，还会产生一种PINK1短亚型(PINK1 short isoform,PINK1S)，这种形式不稳定，由蛋白酶体降解，该亚型对线粒体也有保护作用[4]。据研究显示，在线粒体功能失衡情况下，PINK1L在线粒体外膜聚集并通过自我磷酸化的方式增强自身活性，从而更有效地促进后续线粒体的自噬进程[5]。两个PINK1分子之间能够互相磷酸化，但是PINK1本身并不会主动相互结合，那么它们的相互催化作用必将有其他未知的辅助因子参与。本文旨在研究胞质中PINK1S的自我磷酸化调控机制。
酪蛋白激酶2(Casein kinase 2，CK2)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合体，广泛分布于细胞中，参与细胞增殖分化调控。它由两个催化亚基CK2α1和CK2α2，与两个调节亚基CK2β组合而成[6]。此复合体中CK2β是作为一个中间的衔接亚基有效地连接两个催化亚基，从而促进CK2对底物的识别和磷酸化[7-8]。另外，前人研究表明CK2β亚基还能在细胞质中游离存在，暗示其还具有其他重要功能。本研究发现，CK2β能够与PINK1S相互作用，并促进其自我磷酸化从而增强胞质中PINK1S的活性。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒提取试剂盒以及DNA胶回收试剂盒购自OMEGA BIO-TEK；限制性内切酶购自NEW England Biolabs；HEK293细胞株购自ATCC；DMEM培养基购自Hyclone；真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen；细胞培养胎牛血清购自Biowest；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜和蛋白G琼脂糖凝胶购自Millipore；抗Flag、HA、Myc单克隆抗体均购自Prospect；Phos-tagTM Biotin购自WAKO；生物素结合蛋白偶联二抗和蛋白酶抑制剂均购自Thermo Scientific；人类基因cDNA购自Addgene；转染试剂MegaTran1.0购于Origene；其他生化试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 表达载体的构建
以目的基因cDNA为模板，两端设计带有限制性内切酶位点的上下游引物，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)获得目的基因片段，然后用相对应的两种限制性内切酶酶切目的基因以及欲使用的带有HA、Myc、Flag标签的pcDNA3.1(+)载体。将回收到的片段和载体用T4连接酶于20 ℃连接。连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，42 ℃热激后涂于相应抗性的LB固体培养基上，37 ℃过夜培养。挑选单菌落扩增培养，提取质粒。质粒用相应限制性内切酶切割鉴定是否连入目的基因，并测序确认。质粒构建中引物序列如表 1所示，由成都擎科梓熙生物技术公司合成。
表1
PCR扩增引物序列
Table1.
Primers of cDNA PCR amplification
1.2.2 细胞培养与目的基因的表达
用DMEM基础培养基配制HEK293细胞完全培养液(10% 胎牛血清、1% 非必须氨基酸、1% 青霉素和链霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺)，细胞培养于37 ℃、5% CO2培养箱。HEK293细胞培养于10 cm细胞培养皿中，胰酶消化细胞，按照24孔板12×104个/孔；6孔板50×104/孔，均匀接种于培养板，12 h以后进行表达载体的转染。转染方法均按照转染试剂MegaTran1.0的使用说明进行。质粒与转染试剂1∶3的比例，在DMEM培养基环境下转染4~6 h后换成完全培养液，24 h后进行后续实验。
1.2.3 免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation，co-IP)
HEK293细胞按标准接种于6孔培养板中，37 ℃培养12 h后转染表达载体，转染后培养24 h，使蛋白质充分表达。弃培养液，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)洗3次，每个孔加入200 μL NP40细胞裂解液(1% NP40、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、1 mmol/L 蛋白酶抑制剂)冰上裂解30 min，将裂解产物收集在EP管中4 ℃，14 000 rpm离心15 min。离心后取上清10 μL为全细胞裂解液样品，加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)上样缓冲液(2% SDS、40 mmol/L Tris-HCl pH 6.8、2 mmol/L二硫苏糖醇、4% 甘油、0.01% 溴酚蓝)，剩余上清转移至新的EP管加入2 μg抗Flag或抗HA单克隆抗体，4 ℃旋转孵育2 h。然后每支样品加入20 μL 蛋白G琼脂糖凝胶，继续于4 ℃旋转孵育1 h。最后用NP40细胞裂解液漂洗蛋白G琼脂糖凝胶3次，除去裂解液，加入适量SDS上样缓冲液。以上蛋白样品100 ℃煮5 min，用于western blot检测。
1.2.4 Western blot实验
蛋白样品经10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再以湿转法将凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜上，用含有0.2%吐温的PBS(phosphate buffer saline and tween 20，PBST)配制5%脱脂奶粉，PVDF膜在牛奶中封闭1 h，然后在塑料膜中孵育一抗4 ℃旋转过夜。回收一抗，PBST洗3次，室温摇晃孵育二抗1 h，孵育结束后PBST洗3次，膜烘干。利用Li-Cor Odyssey 红外激光成像系统检测蛋白信号。Image J软件分析蛋白条带灰度，统计变化量。
1.2.5 CK2β沉默细胞株的建立
利用Invitrogen Block-iT miRNA system RNA干扰技术在HEK293细胞的基础上建立沉默掉CK2β的细胞株。首先利用Invitrogen Block-iTRNAi Designer设计了CK2β干扰引物-CK2β392。CK2β392上游引物：TGCTGTTCACAGAAGAATTCATTGCCGT TTTGGCCACTGACTGACGGCAATGATCTTCT GTGAA；下游引物：CCTGTTCACAGAAGATCA TTGCCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGCAATG AATTCTTCTGTGAAC。合成的DNA退火形成双链DNA，克隆到pcDNA3.1(+)-EGFP-mi155载体。该载体能够产生短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，干扰CK2β表达。载体酶切鉴定正确后，转染到HEK293细胞株内，筛选得到含有增强绿色荧光蛋白表达的细胞，通过western blot分析CK2 蛋白表达量。另外，转染pcDNA3.1(+)-EGFP-mi155空载体筛选得到对照细胞株。
1.2.6 Phos-tagTM Biotin检测细胞内磷酸化蛋白
Phos-tagTM Biotin即生物素标记的磷酸化蛋白检测标签，用于检测PVDF膜上的磷酸化蛋白。首先配制含有吐温的Tris-盐酸缓冲液(Tris-buffered saline and tween 20，TBST)(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5，500 mmol/L NaCl，0.2% 吐温)，然后配制Phos-tagTM Biotin反应溶液(469 μL TBST、10 μL Phos-tagTM Biotin、20 μL 10 mmol/L Zn(NO3)2、1 μL生物素结合蛋白偶联二抗)；室温下避光静置至少30 min；将反应溶液加入到离心型滤器中(标称分子量限值=30 000)；14 000 g离心20 min；收集Phos-tagTM Biotin-Zn2+-生物素结合蛋白偶联二抗复合物溶液；用TBST按照1∶10稀释。电泳分离蛋白质并将蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜先在TBST中孵育1 h，室温下PVDF膜和Phos-tagTM Biotin-Zn2+-生物素结合蛋白偶联二抗复合物孵育30 min。TBST洗膜两次，每次5 min。Li-Cor Odyssey 红外激光成像系统检测蛋白信号。
1.2.7 统计学方法
每组实验独立重复3次，实验数据用均数±标准差(
2 结果
2.1 表达载体的构建
PCR反应得到CK2α1、CK2α2、CK2β和PINK1S的cDNA片段，酶切后连接到带有不同标签的pcDNA3.1(+)载体上，扩增获得表达载体。如图 1所示，M代表DNA分子量标准，泳道1~5分别代表pcDNA3.1(+)-HA- CK2α1、pcDNA3.1(+)-HA- CK2α2、pcDNA3.1(+)-HA- CK2β、pcDNA3.1(+)-Myc-PINK1S、pcDNA3.1(+)-Flag-PINK1S酶切鉴定条带，其中5 500 bp左右条带为带不同标签的pcDNA3.1(+)载体，1 000 bp左右条带为各个基因的cDNA片段。其中1 176 bp为CK2α1、 1 053 bp为 CK2α2、639 bp为CK2β、1 386 bp为PINK1S。
图1
限制性内切核酸酶酶切检测表达载体
Figure1.
Identification of expression plasmids by restriction endonuclease digestion
2.2 CK2β与PINK1S的相互作用
研究表明，PINK1的酶活力是通过自我磷酸化来调控的，但是具体的分子机制还不清楚。为了研究PINK1活力调控的辅助因子，本文进行小规模筛选，发现PINK1S能够与CK2β相互作用。在HEK293细胞中共表达pcDNA3.1-HA和Myc-PINK1S为对照组，分别共表达HA-CK2α1和Myc-PINK1S，HA-CK2α2和Myc-PINK1S，HA-CK2β和Myc-PINK1S为实验组，利用抗HA单克隆抗体进行co-IP，检测CK2的3个亚基与PINK1S的相互作用情况。如图 2所示，全细胞裂解液中CK2α1、CK2α2、CK2β和PINK1S均有表达，co-IP组中，用抗Myc单克隆抗体只能在同时过表达CK2β时才能检测到PINK1S信号，表明只有CK2β能够与PINK1S发生相互作用，而CK2α1和CK2α2和PINK1S均没有相互作用。另据报道显示，CK2β亚基除了在CK2激酶复合体中作为两个催化亚基的中介亚基调节活性外，还能以游离的状态广泛地分布于细胞质内，暗示CK2β和有可能参与的细胞质内PINK1S的活力调控。
图2
CK2β结合PINK1S
Figure2.
Interaction of CK2β with PINK1S
2.3 CK2β促进PINK1S自我磷酸化
由于PINK1能够自我磷酸化，而两个PINK1分子本身并不会相互结合，因此猜测具有蛋白质连接功能的CK2β是PINK1自我磷酸化的中介。为了证实这一推论，在HEK 293细胞内共表达空载体pcDNA3.1(+)-HA和Flag-PINK1S为对照组，共表达HA-CK2β和Flag-PINK1S为实验组。利用抗Flag单克隆抗体，通过co-IP从细胞中纯化出PINK1S蛋白，然后用Phos-tagTM Biotin检测对照组和实验组中PINK1S的磷酸化水平。如图 3所示，纯化得到的PINK1S蛋白，western blot后经Phos-tagTM Biotin检测的信号为磷酸化的PINK1S，而抗Flag单克隆抗体检测的信号为总PINK1S。实验组和对照组中磷酸化PINK1S 的水平均用Phos-tagTM Biotin信号强度除以Flag-PINK1S信号强度来表示，统计后发现相比于对照组PINK1S的磷酸化水平，过表达CK2β能够使PINK1S自我磷酸化的水平升高到150%(*P＜0.05，与对照组比较)。
图3
CK2β促进PINK1S自我磷酸化
Figure3.
Auto-phosphorylation of PINK1S enhanced by CK2β
2.4 细胞缺失CK2β抑制PINK1S自我磷酸化
以上实验证实CK2β作为一种连接亚基能够连接PINK1S，并促进其自我磷酸化。为了进一步验证CK2β对PINK1S激酶活力的调控作用，我们将shRNA载体转染到细胞，筛选出对照细胞株(shControl)和CK2β表达降低的细胞株(shCK2β)。如图 4(a)所示，与shControl细胞株相比，shCK2β细胞株中CK2β表达量明显下降。由于shCK2β细胞株为多克隆细胞株，为了更加精确地研究CK2β对PINK1S活力的调控作用，我们在shCK2β细胞株的基础上筛选得到CK2β沉默的单克隆细胞株，shCK2β#1和shCK2β#2。在shControl、shCK2β#1、shCK2β#2细胞株内分别过表达Flag-PINK1S，用抗Flag单克隆抗体进行co-IP，从细胞中纯化出PINK1S，再用Phos-tagTM Biotin检测PINK1S的磷酸化水平。如图 4(b)所示，PINK1S磷酸化水平用Phos-tagTM Biotin信号强度除以Flag-PINK1S信号强度来表示，相比于shControl细胞株，shCK2β#1和shCK2β#2细胞内PINK1S自我磷酸化水平分别下降了33%和66%。
图4
缺失CK2β抑制PINK1S自我磷酸化
(a)Western blot实验检测shControl和shCK2β细胞内CK2β蛋白水平；(b)Phos-tagTM Biotin方法检测不同细胞内PINK1S的磷酸化水平。
Figure4. PINK1S auto-phosphorylation of PINK1S by CK2β with reducing the efficiency(a)Western blot analysis of CK2β in shControl and shCKβ cell lines;(b)Detection of phosp-PINK1S in different cell lines by Phos-tagTM Biotin
3 讨论
本研究发现，CK2β作为一种蛋白质的连接亚基，参与了胞质中PINK1S的自我磷酸化过程。由于CK2β并无催化活性，它在这一过程中扮演了PINK1S相互结合的媒介。缺少CK2β的细胞株内，PINK1S的自我磷酸化水平明显降低，如图 5所示。
目前研究结果表明，PINK1突变导致的线粒体损伤是诱发家族性帕金森氏症的重要因素之一[9-11]。作为细胞内重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，PINK1活力的调控决定了下游信号通路的激活与否，因此阐明其激酶活力的调控机制将为帕金森氏发病的治疗提供理论基础。自我磷酸化激活是激酶调控自身活力的最普遍方式之一[12-13]。和其他的激酶不同，PINK1S蛋白分子之间并不能直接相互结合，暗示PINK1的活力调节可能还有其他蛋白参与。从结构上看，CK2β通过衔接两个CK2 催化亚基，进而活化整个激酶复合体，并且能够帮助两个催化亚基识别底物[14-15]。本研究中指出，CK2β能够促进两个PINK1分子之间的相互磷酸化，但是还不清楚是否也协助识别PINK1S的底物。下一步将深入探讨CK2β是否能够促进PINK1S和其底物的相互作用。
图5
CK2β促进PINK1S二聚化和自我磷酸化
Figure5.
A model for CK2β-induced dimerization and auto-phosphorylation of PINK1S
本研究从生化和细胞层面证明，CK2β能够调节PINK1S的激酶活力，不仅丰富了PINK1S活力调控的机理，而且也阐明了CK2β在其他激酶复合体中的重要功能，提示CK2β突变也可能是诱发帕金森氏病的又一原因。
引言
帕金森氏病是当今三大神经退行性疾病之一，其病因主要是多巴胺神经元的死亡[1]。PTEN诱导激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)是一种线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是遗传性帕金森氏病的主要相关蛋白[2]。PINK1长亚型(PINK1 long isoform,PINK1L)会在跨膜电位下降的线粒体外膜上积累，促进损伤的线粒体通过自噬途径清除[3]。另外，还会产生一种PINK1短亚型(PINK1 short isoform,PINK1S)，这种形式不稳定，由蛋白酶体降解，该亚型对线粒体也有保护作用[4]。据研究显示，在线粒体功能失衡情况下，PINK1L在线粒体外膜聚集并通过自我磷酸化的方式增强自身活性，从而更有效地促进后续线粒体的自噬进程[5]。两个PINK1分子之间能够互相磷酸化，但是PINK1本身并不会主动相互结合，那么它们的相互催化作用必将有其他未知的辅助因子参与。本文旨在研究胞质中PINK1S的自我磷酸化调控机制。
酪蛋白激酶2(Casein kinase 2，CK2)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合体，广泛分布于细胞中，参与细胞增殖分化调控。它由两个催化亚基CK2α1和CK2α2，与两个调节亚基CK2β组合而成[6]。此复合体中CK2β是作为一个中间的衔接亚基有效地连接两个催化亚基，从而促进CK2对底物的识别和磷酸化[7-8]。另外，前人研究表明CK2β亚基还能在细胞质中游离存在，暗示其还具有其他重要功能。本研究发现，CK2β能够与PINK1S相互作用，并促进其自我磷酸化从而增强胞质中PINK1S的活性。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒提取试剂盒以及DNA胶回收试剂盒购自OMEGA BIO-TEK；限制性内切酶购自NEW England Biolabs；HEK293细胞株购自ATCC；DMEM培养基购自Hyclone；真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen；细胞培养胎牛血清购自Biowest；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜和蛋白G琼脂糖凝胶购自Millipore；抗Flag、HA、Myc单克隆抗体均购自Prospect；Phos-tagTM Biotin购自WAKO；生物素结合蛋白偶联二抗和蛋白酶抑制剂均购自Thermo Scientific；人类基因cDNA购自Addgene；转染试剂MegaTran1.0购于Origene；其他生化试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 表达载体的构建
以目的基因cDNA为模板，两端设计带有限制性内切酶位点的上下游引物，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)获得目的基因片段，然后用相对应的两种限制性内切酶酶切目的基因以及欲使用的带有HA、Myc、Flag标签的pcDNA3.1(+)载体。将回收到的片段和载体用T4连接酶于20 ℃连接。连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，42 ℃热激后涂于相应抗性的LB固体培养基上，37 ℃过夜培养。挑选单菌落扩增培养，提取质粒。质粒用相应限制性内切酶切割鉴定是否连入目的基因，并测序确认。质粒构建中引物序列如表 1所示，由成都擎科梓熙生物技术公司合成。
表1
PCR扩增引物序列
Table1.
Primers of cDNA PCR amplification
1.2.2 细胞培养与目的基因的表达
用DMEM基础培养基配制HEK293细胞完全培养液(10% 胎牛血清、1% 非必须氨基酸、1% 青霉素和链霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺)，细胞培养于37 ℃、5% CO2培养箱。HEK293细胞培养于10 cm细胞培养皿中，胰酶消化细胞，按照24孔板12×104个/孔；6孔板50×104/孔，均匀接种于培养板，12 h以后进行表达载体的转染。转染方法均按照转染试剂MegaTran1.0的使用说明进行。质粒与转染试剂1∶3的比例，在DMEM培养基环境下转染4~6 h后换成完全培养液，24 h后进行后续实验。
1.2.3 免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation，co-IP)
HEK293细胞按标准接种于6孔培养板中，37 ℃培养12 h后转染表达载体，转染后培养24 h，使蛋白质充分表达。弃培养液，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)洗3次，每个孔加入200 μL NP40细胞裂解液(1% NP40、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、1 mmol/L 蛋白酶抑制剂)冰上裂解30 min，将裂解产物收集在EP管中4 ℃，14 000 rpm离心15 min。离心后取上清10 μL为全细胞裂解液样品，加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)上样缓冲液(2% SDS、40 mmol/L Tris-HCl pH 6.8、2 mmol/L二硫苏糖醇、4% 甘油、0.01% 溴酚蓝)，剩余上清转移至新的EP管加入2 μg抗Flag或抗HA单克隆抗体，4 ℃旋转孵育2 h。然后每支样品加入20 μL 蛋白G琼脂糖凝胶，继续于4 ℃旋转孵育1 h。最后用NP40细胞裂解液漂洗蛋白G琼脂糖凝胶3次，除去裂解液，加入适量SDS上样缓冲液。以上蛋白样品100 ℃煮5 min，用于western blot检测。
1.2.4 Western blot实验
蛋白样品经10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再以湿转法将凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜上，用含有0.2%吐温的PBS(phosphate buffer saline and tween 20，PBST)配制5%脱脂奶粉，PVDF膜在牛奶中封闭1 h，然后在塑料膜中孵育一抗4 ℃旋转过夜。回收一抗，PBST洗3次，室温摇晃孵育二抗1 h，孵育结束后PBST洗3次，膜烘干。利用Li-Cor Odyssey 红外激光成像系统检测蛋白信号。Image J软件分析蛋白条带灰度，统计变化量。
1.2.5 CK2β沉默细胞株的建立
利用Invitrogen Block-iT miRNA system RNA干扰技术在HEK293细胞的基础上建立沉默掉CK2β的细胞株。首先利用Invitrogen Block-iTRNAi Designer设计了CK2β干扰引物-CK2β392。CK2β392上游引物：TGCTGTTCACAGAAGAATTCATTGCCGT TTTGGCCACTGACTGACGGCAATGATCTTCT GTGAA；下游引物：CCTGTTCACAGAAGATCA TTGCCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGCAATG AATTCTTCTGTGAAC。合成的DNA退火形成双链DNA，克隆到pcDNA3.1(+)-EGFP-mi155载体。该载体能够产生短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，干扰CK2β表达。载体酶切鉴定正确后，转染到HEK293细胞株内，筛选得到含有增强绿色荧光蛋白表达的细胞，通过western blot分析CK2 蛋白表达量。另外，转染pcDNA3.1(+)-EGFP-mi155空载体筛选得到对照细胞株。
1.2.6 Phos-tagTM Biotin检测细胞内磷酸化蛋白
Phos-tagTM Biotin即生物素标记的磷酸化蛋白检测标签，用于检测PVDF膜上的磷酸化蛋白。首先配制含有吐温的Tris-盐酸缓冲液(Tris-buffered saline and tween 20，TBST)(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5，500 mmol/L NaCl，0.2% 吐温)，然后配制Phos-tagTM Biotin反应溶液(469 μL TBST、10 μL Phos-tagTM Biotin、20 μL 10 mmol/L Zn(NO3)2、1 μL生物素结合蛋白偶联二抗)；室温下避光静置至少30 min；将反应溶液加入到离心型滤器中(标称分子量限值=30 000)；14 000 g离心20 min；收集Phos-tagTM Biotin-Zn2+-生物素结合蛋白偶联二抗复合物溶液；用TBST按照1∶10稀释。电泳分离蛋白质并将蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜先在TBST中孵育1 h，室温下PVDF膜和Phos-tagTM Biotin-Zn2+-生物素结合蛋白偶联二抗复合物孵育30 min。TBST洗膜两次，每次5 min。Li-Cor Odyssey 红外激光成像系统检测蛋白信号。
1.2.7 统计学方法
每组实验独立重复3次，实验数据用均数±标准差(
2 结果
2.1 表达载体的构建
PCR反应得到CK2α1、CK2α2、CK2β和PINK1S的cDNA片段，酶切后连接到带有不同标签的pcDNA3.1(+)载体上，扩增获得表达载体。如图 1所示，M代表DNA分子量标准，泳道1~5分别代表pcDNA3.1(+)-HA- CK2α1、pcDNA3.1(+)-HA- CK2α2、pcDNA3.1(+)-HA- CK2β、pcDNA3.1(+)-Myc-PINK1S、pcDNA3.1(+)-Flag-PINK1S酶切鉴定条带，其中5 500 bp左右条带为带不同标签的pcDNA3.1(+)载体，1 000 bp左右条带为各个基因的cDNA片段。其中1 176 bp为CK2α1、 1 053 bp为 CK2α2、639 bp为CK2β、1 386 bp为PINK1S。
图1
限制性内切核酸酶酶切检测表达载体
Figure1.
Identification of expression plasmids by restriction endonuclease digestion
2.2 CK2β与PINK1S的相互作用
研究表明，PINK1的酶活力是通过自我磷酸化来调控的，但是具体的分子机制还不清楚。为了研究PINK1活力调控的辅助因子，本文进行小规模筛选，发现PINK1S能够与CK2β相互作用。在HEK293细胞中共表达pcDNA3.1-HA和Myc-PINK1S为对照组，分别共表达HA-CK2α1和Myc-PINK1S，HA-CK2α2和Myc-PINK1S，HA-CK2β和Myc-PINK1S为实验组，利用抗HA单克隆抗体进行co-IP，检测CK2的3个亚基与PINK1S的相互作用情况。如图 2所示，全细胞裂解液中CK2α1、CK2α2、CK2β和PINK1S均有表达，co-IP组中，用抗Myc单克隆抗体只能在同时过表达CK2β时才能检测到PINK1S信号，表明只有CK2β能够与PINK1S发生相互作用，而CK2α1和CK2α2和PINK1S均没有相互作用。另据报道显示，CK2β亚基除了在CK2激酶复合体中作为两个催化亚基的中介亚基调节活性外，还能以游离的状态广泛地分布于细胞质内，暗示CK2β和有可能参与的细胞质内PINK1S的活力调控。
图2
CK2β结合PINK1S
Figure2.
Interaction of CK2β with PINK1S
2.3 CK2β促进PINK1S自我磷酸化
由于PINK1能够自我磷酸化，而两个PINK1分子本身并不会相互结合，因此猜测具有蛋白质连接功能的CK2β是PINK1自我磷酸化的中介。为了证实这一推论，在HEK 293细胞内共表达空载体pcDNA3.1(+)-HA和Flag-PINK1S为对照组，共表达HA-CK2β和Flag-PINK1S为实验组。利用抗Flag单克隆抗体，通过co-IP从细胞中纯化出PINK1S蛋白，然后用Phos-tagTM Biotin检测对照组和实验组中PINK1S的磷酸化水平。如图 3所示，纯化得到的PINK1S蛋白，western blot后经Phos-tagTM Biotin检测的信号为磷酸化的PINK1S，而抗Flag单克隆抗体检测的信号为总PINK1S。实验组和对照组中磷酸化PINK1S 的水平均用Phos-tagTM Biotin信号强度除以Flag-PINK1S信号强度来表示，统计后发现相比于对照组PINK1S的磷酸化水平，过表达CK2β能够使PINK1S自我磷酸化的水平升高到150%(*P＜0.05，与对照组比较)。
图3
CK2β促进PINK1S自我磷酸化
Figure3.
Auto-phosphorylation of PINK1S enhanced by CK2β
2.4 细胞缺失CK2β抑制PINK1S自我磷酸化
以上实验证实CK2β作为一种连接亚基能够连接PINK1S，并促进其自我磷酸化。为了进一步验证CK2β对PINK1S激酶活力的调控作用，我们将shRNA载体转染到细胞，筛选出对照细胞株(shControl)和CK2β表达降低的细胞株(shCK2β)。如图 4(a)所示，与shControl细胞株相比，shCK2β细胞株中CK2β表达量明显下降。由于shCK2β细胞株为多克隆细胞株，为了更加精确地研究CK2β对PINK1S活力的调控作用，我们在shCK2β细胞株的基础上筛选得到CK2β沉默的单克隆细胞株，shCK2β#1和shCK2β#2。在shControl、shCK2β#1、shCK2β#2细胞株内分别过表达Flag-PINK1S，用抗Flag单克隆抗体进行co-IP，从细胞中纯化出PINK1S，再用Phos-tagTM Biotin检测PINK1S的磷酸化水平。如图 4(b)所示，PINK1S磷酸化水平用Phos-tagTM Biotin信号强度除以Flag-PINK1S信号强度来表示，相比于shControl细胞株，shCK2β#1和shCK2β#2细胞内PINK1S自我磷酸化水平分别下降了33%和66%。
图4
缺失CK2β抑制PINK1S自我磷酸化
(a)Western blot实验检测shControl和shCK2β细胞内CK2β蛋白水平；(b)Phos-tagTM Biotin方法检测不同细胞内PINK1S的磷酸化水平。
Figure4. PINK1S auto-phosphorylation of PINK1S by CK2β with reducing the efficiency(a)Western blot analysis of CK2β in shControl and shCKβ cell lines;(b)Detection of phosp-PINK1S in different cell lines by Phos-tagTM Biotin
3 讨论
本研究发现，CK2β作为一种蛋白质的连接亚基，参与了胞质中PINK1S的自我磷酸化过程。由于CK2β并无催化活性，它在这一过程中扮演了PINK1S相互结合的媒介。缺少CK2β的细胞株内，PINK1S的自我磷酸化水平明显降低，如图 5所示。
目前研究结果表明，PINK1突变导致的线粒体损伤是诱发家族性帕金森氏症的重要因素之一[9-11]。作为细胞内重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，PINK1活力的调控决定了下游信号通路的激活与否，因此阐明其激酶活力的调控机制将为帕金森氏发病的治疗提供理论基础。自我磷酸化激活是激酶调控自身活力的最普遍方式之一[12-13]。和其他的激酶不同，PINK1S蛋白分子之间并不能直接相互结合，暗示PINK1的活力调节可能还有其他蛋白参与。从结构上看，CK2β通过衔接两个CK2 催化亚基，进而活化整个激酶复合体，并且能够帮助两个催化亚基识别底物[14-15]。本研究中指出，CK2β能够促进两个PINK1分子之间的相互磷酸化，但是还不清楚是否也协助识别PINK1S的底物。下一步将深入探讨CK2β是否能够促进PINK1S和其底物的相互作用。
图5
CK2β促进PINK1S二聚化和自我磷酸化
Figure5.
A model for CK2β-induced dimerization and auto-phosphorylation of PINK1S
本研究从生化和细胞层面证明，CK2β能够调节PINK1S的激酶活力，不仅丰富了PINK1S活力调控的机理，而且也阐明了CK2β在其他激酶复合体中的重要功能，提示CK2β突变也可能是诱发帕金森氏病的又一原因。
