本研究旨在通过优化人β2微球蛋白在大肠杆菌中的表达条件并对重组蛋白进行纯化,以期获得可溶性好、纯度高的重组人β2微球蛋白(rhβ2M)。通过检测诱导剂IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对rhβ2M可溶性表达的影响,确定最佳的诱导条件为IPTG终浓度0.8 mmol/L,诱导温度25℃,诱导时间6 h。在最佳诱导条件下进行发酵培养,获得可溶性rhβ2M占菌体总可溶蛋白含量的63.7%。对可溶性蛋白进行Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析纯化,可获得纯度达95%以上的rhβ2M。Western blot分析表明,该蛋白具有与抗人β2M抗体特异反应的抗原特性。
引用本文： 矫丽媛, 才蕾, 任艳娜, 赵晓妮, 王继华. 人β2微球蛋白原核表达条件优化及纯化. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(5): 1050-1055. doi: 10.7507/1001-5515.20150186 复制
引言
β2微球蛋白(β2-microglobulin，β2M)是由99个氨基酸组成的低分子量蛋白，相对分子质量为11.8 kD。该蛋白位于淋巴细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)的轻链部分[1]，含有一对二硫键，从细胞膜脱落后存在于体液中[2]。近年来，β2M被认为是一种肾功能损伤新型标志物[3-4]。检测血清或尿液中β2M水平升高，分别反映了肾小球滤过功能损伤或近端肾小管轻度损伤。对于白血病和实体瘤患者，其血清中β2M水平是极其重要的预后及预测肿瘤患者存活时间指标[5-7]。此外，β2M是癌细胞的生长因子和信号分子，也是调节血管内皮生长因子、雄性激素受体、脂肪酸合成酶等的一个多能性信号分子[2, 8]。因此，血液和尿液中β2M水平的检测，在疾病的预防和筛查，药物疗效观察以及预后等方面均具有重要意义。
应用基因工程技术原核表达人β2微球蛋白已有报道，但其表达的重组人β2微球蛋白(rhβ2M)都以包涵体形式为主[9-11]，如朴文花等[12]构建的rhβ2M表达载体，可溶性目的蛋白仅占总蛋白量的4%。虽然包涵体蛋白可以通过变性、复性方法最终获得可溶性的rhβ2M，但是包涵体蛋白变性、复性过程复杂，同时大多数包涵体蛋白不能实现完全复性，有的复性率极低，影响了活性蛋白产量。因此，需要构建以可溶形式表达的重组蛋白。本研究通过优化人β2M在大肠杆菌中表达的基因序列，使用带有促溶标签的载体pET-32a(+)，用于表达可溶性、具有生物活性的rhβ2M，为β2M诊断试剂盒研发及其抗体的制备奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
质粒pET-32a(+)、大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)为本实验室保存；目的基因由Genewiz公司合成；人β2微球蛋白和抗人β2微球蛋白单克隆抗体(兔源和鼠源两种)购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和T4 DNA 连接酶购自Takara公司；预染蛋白Marker购自Life公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自天根公司；氨苄青霉素、IPTG、PMSF购自Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 主要仪器
仪器设备主要有新芝超声波细胞粉碎机、Thermo Legend RT+台式低温离心机、Bio-Rad PowerPac Basic电泳仪、Bio-Rad Gel Doc XR+凝胶成像仪以及GE AKTA Purifier 100蛋白质纯化系统等。
1.3 方法
1.3.1 重组质粒pET32a(+)-β2M的构建
通过NCBI数据库获取人β2微球蛋白的编码序列(AY187687)，去除该序列中编码信号肽的序列，获得成熟蛋白的编码序列300 bp。根据大肠杆菌密码子偏好性，应用密码子优化工具(http://www.jcat.de/Start.jsp)优化序列，最后由Genewiz公司化学合成该蛋白质的编码序列。在5′端和3′端分别设计加入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点，酶切位点两侧各加3个保护碱基。将上述合成片段和pET32a(+)载体分别进行双酶切，回收目的片段并连接，构建重组质粒pET32a(+)-β2M，并转化E.coli DH5α，通过质粒提取和质粒双酶切验证阳性克隆，最后选取阳性克隆进行测序。
1.3.2 rhβ2M在BL21(DE3)表达的优化
将测序正确的pET32a(+)-β2M重组质粒转化E. coliBL21(DE3)，挑取单菌落，接种至5 mL含氨苄青霉素(50 μg/mL)的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜，得到活化的种子液。之后，将活化种子液以1%接种量接种至LB液体培养基中，37 ℃培养至OD600达到0.8时，分别进行如下条件优化：
(1)诱导剂IPTG浓度对rhβ2M可溶性表达的影响：分别加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L的IPTG，30 ℃震荡培养箱中培养4 h后取样。
(2)诱导温度对rhβ2M可溶性表达的影响：加入终浓度为0.8 mmol/L的IPTG，分别在15、20、25、30和37 ℃的震荡培养箱中培养4 h后取样。
(3)诱导时间对rhβ2M可溶性表达的影响：加入终浓度为0.8 mmol/L的IPTG，25 ℃震荡培养箱中培养，分别于2、4、6、8、12和24 h后取样。
1.3.3 rhβ2M可溶性分析和检测
诱导结束后，分别取2 mL菌液离心收集菌体，以超声破碎缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含100 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA)重悬，超声破碎(超声时长3 min，超声2 s，间断4 s，功率200 W)处理，菌体破碎液低温12 000 r/min离心，取上清进行SDS-PAGE电泳分析，Bio-Rad凝胶成像系统记录电泳情况，并应用Image Lab 3.0软件定量分析各样品中上清表达的rhβ2M占可溶蛋白总量的百分数，从而确定rhβ2M可溶性表达的最佳诱导条件。
1.3.4 rhβ2M纯化及鉴定
在优化后的rhβ2M表达最佳条件下，扩大培养细菌并诱导rhβ2M，收集菌体。以超声破碎缓冲液重悬，加入终浓度为1 mmol/L PMSF，超声裂解菌体，裂解菌液经过4 ℃，12 000 r/min离心20 min后，收集上清即为粗rhβ2M溶液。该粗蛋白液经Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析纯化rhβ2M。配制浓度为12%的SDS-PAGE电泳胶，分别将诱导后、超声上清与纯化后的蛋白溶液进行上样检测，电泳后经考马斯亮蓝染色及脱色，Bio-Rad凝胶成像仪记录电泳情况。
1.3.5 rhβ2M的Western blot检测
为了检测rhβ2M的特异性和灵敏度，将纯化获得的rhβ2M，经过SDS-PAGE分离后转印到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉(溶于PBST缓冲液中)于4 ℃封闭过夜。之后将购买的商品化的抗人β2M单克隆抗体(兔源和鼠源两种)作为一抗，分别用羊抗兔lgG-HRP和羊抗鼠lgG-HRP作为二抗，以购买的人β2M为对照，进行Western blot检测分析。
2 结果
2.1 pET32a-β2M重组质粒的鉴定
提取获得的重组质粒pET32a(+)-β2M用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：经过酶切处理，分别在5 900 bp及300 bp处检测到条带，这与载体和基因片段大小吻合，如图 1所示。之后，将该质粒测序结果与β2M优化序列进行DNA比对，结果显示两序列完全一致，如图 2所示，说明重组质粒pET32a(+)-β2M构建成功。
图1
表达质粒pET32a(+)-β2M的酶切鉴定
M：DL5000 DNA Ladder；1：质粒pET32a(+)-β2M；2：质粒pET32a(+)-β2M酶切产物
Figure1. Identification of plasmid pET32a(+)-β2MM： DL5000 DNA Ladder；1：plasmid pET32a(+)-β2M； 2： plasmid pET32a(+)-β2M digested with
图2
β2M优化序列与质粒pET32a(+)-β2M测序结果的比对
Figure2.
Alignment of β2M coding sequence with that in pET32a(+)-β2M construct
2.2 rhβ2M诱导表达的优化
2.2.1 IPTG诱导浓度对rhβ2M可溶性表达的影响
pET系列载体进行原核表达时，利用IPTG诱导lacⅠ启动子过量表达RNA聚合酶，从而大量获得目的蛋白。但IPTG本身具有毒性，对细菌生长代谢具有一定的抑制作用；同时，高浓度的IPTG容易使目标蛋白形成过快，来不及正确折叠，部分以包涵体形式存在。因此需要对诱导剂IPTG的添加量通过试验进行优化。选取IPTG终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的6个浓度梯度分别诱导rhβ2M表达，结果如图 3所示，在其他诱导条件相同的情况下，当IPTG浓度达到0.8 mmol/L时，rhβ2M可溶表达量为最高，占菌体总可溶蛋白含量的58.1%。继续增加IPTG浓度(1.0~1.2 mmol/L)，可溶性rhβ2M含量反而下降，基于此确定最佳的IPTG添加量为0.8 mmol/L。
图3
诱导剂浓度对rhβ2M可溶性表达的影响
M：低分子量标准蛋白；0：未添加IPTG；1-6：IPTG的终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L
Figure3. Effect of IPTG concentration on the soluble expression level of rhβ2MM: protein M W marker; 0: control with no addition of IPTG; 1-6: rhβ2M were induced by final IPTG concentration of 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mmol/L, respectively
2.2.2 诱导温度对rhβ2M可溶性表达的影响
细菌生长代谢和外源蛋白表达是一系列相关酶作用的结果，诱导温度关系着酶催化反应是否在最适温度下进行，进而影响细菌生长和外源蛋白表达。37 ℃多为这些酶的最适温度，常被选为诱导温度。然而这些酶在最适温度下，生物活性最高，使得目标蛋白的表达过快，从而导致包涵体蛋白的形成。反之，温度过低虽然可以降低目的蛋白的形成速度，使其缓慢、正确的折叠，最终以可溶形式存在，但会降低蛋白的表达量。因此，最佳诱导温度需要通过试验优化来确定。通过15、20、25、30、37 ℃等5个温度梯度，探究诱导温度对rhβ2M可溶性表达的影响，结果如图 4所示，在其他诱导条件相同的情况下，当诱导温度为低温(15 ℃)时rhβ2M表达量很低，仅占蛋白总量的27.3%，随着温度升高，rhβ2M可溶表达量增加，当诱导温度为25 ℃时，rhβ2M可溶表达量为最高，占菌体总可溶蛋白含量的61.7%。继续升高诱导温度，可溶表达水平有降低趋势，所以通过优化确定最佳的诱导温度为25 ℃。
图4
诱导温度对rhβ2M可溶性表达的影响
M：低分子量标准蛋白；1-5：诱导温度分别为15、20、25、30、37 ℃
Figure4. Effect of temperature on the soluble expression level of rhβ2MM: protein M W marker; 1-5: rhβ2M were induced under 15, 20, 25, 30, 37 ℃, respectively
2.2.3 诱导时间对rhβ2M可溶性表达的影响
对于固定的体系，外源蛋白并非随诱导时间的增加而不断产生，诱导时间延长会伴随着细菌的衰老死亡、次级代谢产物的产生和释放，不利于外源蛋白的稳定存在。因此需要通过试验优化来确定最佳诱导时间。在25 ℃，IPTG终浓度为0.8 mmol/L条件下，诱导rhβ2M，并分别对2、4、6、8、12、24 h样品进行电泳检测。诱导时间对rhβ2M可溶性表达的影响，结果如图 5所示，在其他诱导条件相同的情况下，rhβ2M可溶表达量随着诱导时间的增加，rhβ2M可溶表达量增加，当诱导时间为6 h或时间更长时，rhβ2M可溶表达量趋于稳定，约占菌体总可溶蛋白含量的63.2%。继续增加诱导时间，未见可溶表达水平提高，所以通过优化确定最佳的诱导时间为6 h。
图5
诱导时间对rhβ2M可溶性表达的影响
M：低分子量标准蛋白；1-6：诱导时间分别为2、4、6、8、12、24小时
Figure5. Effect of different time on the soluble expression level of rhβ2MLane M: protein M W marker; Lane 1-6: induced time of rhβ2M were 2, 4, 6, 8, 12, 24 h, respectively
2.3 rhβ2M纯化结果
在优化确定的rhβ2M表达最佳条件下，扩大培养细菌，诱导剂IPTG添加终浓度为0.8 mmol/L，25℃条件下诱导培养6 h，最后收集菌体，超声破碎后，取上清纯化。rhβ2M纯化的SDS-PAGE检测结果如图 6所示。凝胶扫描成像Bio-Rad软件分析显示rhβ2M表达量可达细菌总蛋白的39.2%，其可溶表达量占菌体总可溶蛋白含量的63.7%。通过Ni亲和层析纯化后，可获得纯度达95%以上的rhβ2M。
图6
β2M表达产物及其纯化后蛋白的SDS-PAGE分析
M：低分子量标准蛋白；1：未诱导菌体；2：诱导菌体；3：菌体超声破碎后的可溶蛋白；4-5：纯化后rhβ2M
Figure6. SDS-PAGE analysis of rhβ2M products and purified proteinM: protein M W marker; 1: uninduced expression of β2M in
2.4 rhβ2M的Western blot结果
rhβ2M的生物学活性检测选用鼠/兔抗人β2M单克隆抗体对rhβ2M进行免疫学鉴定。将纯化后的rhβ2M和购买的人β2M进行SDS-PAGE，并转印到硝酸纤维素膜上，进行免疫印迹分析，以人β2M为正对照，结果如图 7所示。目的蛋白rhβ2M可与鼠/兔抗人β2M单克隆抗体反应，约在30 kD(含标签的融合蛋白)处出现一条清晰的条带，大小与SDS-PAGE中检测的条带吻合。同时，人β2M在12 KDa附近的单一显色条带可以作为阳性对照。以上结果可知：原核表达获得的rhβ2M可与抗人β2M抗体特异性结合，条带唯一，特异性良好，具有生物学活性。
图7
rhβ2M免疫印迹检测结果
(a)SDS-PAGE检测结果；(b)一抗1：抗人β2M单克隆抗体(鼠源)；(c)一抗2：抗人β2M单克隆抗体(兔源)。M：预染蛋白标准；1：rhβ2M；2：人β2M
Figure7. Western blot analysis of rhβ2M(a) SDS-PAGE Analysis; (b) primary antibody 1： anti-β2M antibody (mouse monoclonal); (c) primary antibody 2： anti-β2M antibody (rabbit monoclonal). M： protein M W marker； 1： rhβ2M； 2： human β2M
3 讨论
基于β2M作为主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子的轻链部分[13]，及其在肾脏损伤和某些肿瘤患者临床检测中的广泛应用。获得高生物活性、高纯度的β2M是制备MHC四聚体分子和研发β2M检测试剂盒所需抗原不可或缺的前提条件。重组表达人β2M的研究已有报道，但是经过原核表达获得的重组蛋白多为包涵体，构建以可溶形式表达的rhβ2M成为研究的关键。本研究通过NCBI数据库获得人β2M氨基酸序列，通过对β2M密码子进行优化，获得E.coli惯用的密码子序列，之后化学合成β2M基因序列。选用带有促溶标签(硫氧还蛋白融合蛋白和多肽，Trx-tag)的载体pET32a(+)，构建重组质粒pET32a(+)-β2M并转入BL21(DE3)。该载体在进行基因表达时，硫氧还原蛋白有助于目的蛋白的正确折叠，促进有活性蛋白的产物形成，提高目的蛋白可溶表达量，并可以抵御蛋白酶的降解作用。
研究证实，外源基因在细菌中高效表达，可以通过调节宿主菌生长和代谢与外源基因表达速率之间的关系来实现，因此，对外源蛋白诱导条件的优化成为一个重要环节。外源蛋白表达的常规因素包括诱导剂IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等[14-15]，每个因素的变化均会影响宿主菌的生长代谢和外源蛋白的表达。本研究以rhβ2M可溶表达量来优化诱导条件，在优化过程中发现，诱导温度变化对rhβ2M可溶表达量有显著影响；诱导时间不宜过长，rhβ2M可溶表达量趋于稳定即可。在最佳诱导条件下，rhβ2M表达量可达细菌总蛋白的39.2%，可溶蛋白表达量占菌体总可溶蛋白含量的63.7%，实现了人β2M在E.coli中高效地可溶性表达。经过大量发酵培养，Ni2+螯合亲和层析柱纯化蛋白，其纯度可以达95%以上，最终获得高纯度rhβ2M。
生物活性方面，使用免疫学方法Western blot鉴定rhβ2M的抗原特性，以购买的人β2M为对照，该蛋白和构建的rhβ2M均出现单一条带，且条带分子量大小正确，说明rhβ2M能与抗人β2M单克隆抗体结合，具有较高特异性，进而证明该蛋白具有抗原的特性，为MHC四聚体分子制备研究以及β2M临床检测应用奠定基础。
引言
β2微球蛋白(β2-microglobulin，β2M)是由99个氨基酸组成的低分子量蛋白，相对分子质量为11.8 kD。该蛋白位于淋巴细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)的轻链部分[1]，含有一对二硫键，从细胞膜脱落后存在于体液中[2]。近年来，β2M被认为是一种肾功能损伤新型标志物[3-4]。检测血清或尿液中β2M水平升高，分别反映了肾小球滤过功能损伤或近端肾小管轻度损伤。对于白血病和实体瘤患者，其血清中β2M水平是极其重要的预后及预测肿瘤患者存活时间指标[5-7]。此外，β2M是癌细胞的生长因子和信号分子，也是调节血管内皮生长因子、雄性激素受体、脂肪酸合成酶等的一个多能性信号分子[2, 8]。因此，血液和尿液中β2M水平的检测，在疾病的预防和筛查，药物疗效观察以及预后等方面均具有重要意义。
应用基因工程技术原核表达人β2微球蛋白已有报道，但其表达的重组人β2微球蛋白(rhβ2M)都以包涵体形式为主[9-11]，如朴文花等[12]构建的rhβ2M表达载体，可溶性目的蛋白仅占总蛋白量的4%。虽然包涵体蛋白可以通过变性、复性方法最终获得可溶性的rhβ2M，但是包涵体蛋白变性、复性过程复杂，同时大多数包涵体蛋白不能实现完全复性，有的复性率极低，影响了活性蛋白产量。因此，需要构建以可溶形式表达的重组蛋白。本研究通过优化人β2M在大肠杆菌中表达的基因序列，使用带有促溶标签的载体pET-32a(+)，用于表达可溶性、具有生物活性的rhβ2M，为β2M诊断试剂盒研发及其抗体的制备奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
质粒pET-32a(+)、大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)为本实验室保存；目的基因由Genewiz公司合成；人β2微球蛋白和抗人β2微球蛋白单克隆抗体(兔源和鼠源两种)购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和T4 DNA 连接酶购自Takara公司；预染蛋白Marker购自Life公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自天根公司；氨苄青霉素、IPTG、PMSF购自Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 主要仪器
仪器设备主要有新芝超声波细胞粉碎机、Thermo Legend RT+台式低温离心机、Bio-Rad PowerPac Basic电泳仪、Bio-Rad Gel Doc XR+凝胶成像仪以及GE AKTA Purifier 100蛋白质纯化系统等。
1.3 方法
1.3.1 重组质粒pET32a(+)-β2M的构建
通过NCBI数据库获取人β2微球蛋白的编码序列(AY187687)，去除该序列中编码信号肽的序列，获得成熟蛋白的编码序列300 bp。根据大肠杆菌密码子偏好性，应用密码子优化工具(http://www.jcat.de/Start.jsp)优化序列，最后由Genewiz公司化学合成该蛋白质的编码序列。在5′端和3′端分别设计加入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点，酶切位点两侧各加3个保护碱基。将上述合成片段和pET32a(+)载体分别进行双酶切，回收目的片段并连接，构建重组质粒pET32a(+)-β2M，并转化E.coli DH5α，通过质粒提取和质粒双酶切验证阳性克隆，最后选取阳性克隆进行测序。
1.3.2 rhβ2M在BL21(DE3)表达的优化
将测序正确的pET32a(+)-β2M重组质粒转化E. coliBL21(DE3)，挑取单菌落，接种至5 mL含氨苄青霉素(50 μg/mL)的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜，得到活化的种子液。之后，将活化种子液以1%接种量接种至LB液体培养基中，37 ℃培养至OD600达到0.8时，分别进行如下条件优化：
(1)诱导剂IPTG浓度对rhβ2M可溶性表达的影响：分别加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L的IPTG，30 ℃震荡培养箱中培养4 h后取样。
(2)诱导温度对rhβ2M可溶性表达的影响：加入终浓度为0.8 mmol/L的IPTG，分别在15、20、25、30和37 ℃的震荡培养箱中培养4 h后取样。
(3)诱导时间对rhβ2M可溶性表达的影响：加入终浓度为0.8 mmol/L的IPTG，25 ℃震荡培养箱中培养，分别于2、4、6、8、12和24 h后取样。
1.3.3 rhβ2M可溶性分析和检测
诱导结束后，分别取2 mL菌液离心收集菌体，以超声破碎缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含100 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA)重悬，超声破碎(超声时长3 min，超声2 s，间断4 s，功率200 W)处理，菌体破碎液低温12 000 r/min离心，取上清进行SDS-PAGE电泳分析，Bio-Rad凝胶成像系统记录电泳情况，并应用Image Lab 3.0软件定量分析各样品中上清表达的rhβ2M占可溶蛋白总量的百分数，从而确定rhβ2M可溶性表达的最佳诱导条件。
1.3.4 rhβ2M纯化及鉴定
在优化后的rhβ2M表达最佳条件下，扩大培养细菌并诱导rhβ2M，收集菌体。以超声破碎缓冲液重悬，加入终浓度为1 mmol/L PMSF，超声裂解菌体，裂解菌液经过4 ℃，12 000 r/min离心20 min后，收集上清即为粗rhβ2M溶液。该粗蛋白液经Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析纯化rhβ2M。配制浓度为12%的SDS-PAGE电泳胶，分别将诱导后、超声上清与纯化后的蛋白溶液进行上样检测，电泳后经考马斯亮蓝染色及脱色，Bio-Rad凝胶成像仪记录电泳情况。
1.3.5 rhβ2M的Western blot检测
为了检测rhβ2M的特异性和灵敏度，将纯化获得的rhβ2M，经过SDS-PAGE分离后转印到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉(溶于PBST缓冲液中)于4 ℃封闭过夜。之后将购买的商品化的抗人β2M单克隆抗体(兔源和鼠源两种)作为一抗，分别用羊抗兔lgG-HRP和羊抗鼠lgG-HRP作为二抗，以购买的人β2M为对照，进行Western blot检测分析。
2 结果
2.1 pET32a-β2M重组质粒的鉴定
提取获得的重组质粒pET32a(+)-β2M用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：经过酶切处理，分别在5 900 bp及300 bp处检测到条带，这与载体和基因片段大小吻合，如图 1所示。之后，将该质粒测序结果与β2M优化序列进行DNA比对，结果显示两序列完全一致，如图 2所示，说明重组质粒pET32a(+)-β2M构建成功。
图1
表达质粒pET32a(+)-β2M的酶切鉴定
M：DL5000 DNA Ladder；1：质粒pET32a(+)-β2M；2：质粒pET32a(+)-β2M酶切产物
Figure1. Identification of plasmid pET32a(+)-β2MM： DL5000 DNA Ladder；1：plasmid pET32a(+)-β2M； 2： plasmid pET32a(+)-β2M digested with
图2
β2M优化序列与质粒pET32a(+)-β2M测序结果的比对
Figure2.
Alignment of β2M coding sequence with that in pET32a(+)-β2M construct
2.2 rhβ2M诱导表达的优化
2.2.1 IPTG诱导浓度对rhβ2M可溶性表达的影响
pET系列载体进行原核表达时，利用IPTG诱导lacⅠ启动子过量表达RNA聚合酶，从而大量获得目的蛋白。但IPTG本身具有毒性，对细菌生长代谢具有一定的抑制作用；同时，高浓度的IPTG容易使目标蛋白形成过快，来不及正确折叠，部分以包涵体形式存在。因此需要对诱导剂IPTG的添加量通过试验进行优化。选取IPTG终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的6个浓度梯度分别诱导rhβ2M表达，结果如图 3所示，在其他诱导条件相同的情况下，当IPTG浓度达到0.8 mmol/L时，rhβ2M可溶表达量为最高，占菌体总可溶蛋白含量的58.1%。继续增加IPTG浓度(1.0~1.2 mmol/L)，可溶性rhβ2M含量反而下降，基于此确定最佳的IPTG添加量为0.8 mmol/L。
图3
诱导剂浓度对rhβ2M可溶性表达的影响
M：低分子量标准蛋白；0：未添加IPTG；1-6：IPTG的终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L
Figure3. Effect of IPTG concentration on the soluble expression level of rhβ2MM: protein M W marker; 0: control with no addition of IPTG; 1-6: rhβ2M were induced by final IPTG concentration of 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mmol/L, respectively
2.2.2 诱导温度对rhβ2M可溶性表达的影响
细菌生长代谢和外源蛋白表达是一系列相关酶作用的结果，诱导温度关系着酶催化反应是否在最适温度下进行，进而影响细菌生长和外源蛋白表达。37 ℃多为这些酶的最适温度，常被选为诱导温度。然而这些酶在最适温度下，生物活性最高，使得目标蛋白的表达过快，从而导致包涵体蛋白的形成。反之，温度过低虽然可以降低目的蛋白的形成速度，使其缓慢、正确的折叠，最终以可溶形式存在，但会降低蛋白的表达量。因此，最佳诱导温度需要通过试验优化来确定。通过15、20、25、30、37 ℃等5个温度梯度，探究诱导温度对rhβ2M可溶性表达的影响，结果如图 4所示，在其他诱导条件相同的情况下，当诱导温度为低温(15 ℃)时rhβ2M表达量很低，仅占蛋白总量的27.3%，随着温度升高，rhβ2M可溶表达量增加，当诱导温度为25 ℃时，rhβ2M可溶表达量为最高，占菌体总可溶蛋白含量的61.7%。继续升高诱导温度，可溶表达水平有降低趋势，所以通过优化确定最佳的诱导温度为25 ℃。
图4
诱导温度对rhβ2M可溶性表达的影响
M：低分子量标准蛋白；1-5：诱导温度分别为15、20、25、30、37 ℃
Figure4. Effect of temperature on the soluble expression level of rhβ2MM: protein M W marker; 1-5: rhβ2M were induced under 15, 20, 25, 30, 37 ℃, respectively
2.2.3 诱导时间对rhβ2M可溶性表达的影响
对于固定的体系，外源蛋白并非随诱导时间的增加而不断产生，诱导时间延长会伴随着细菌的衰老死亡、次级代谢产物的产生和释放，不利于外源蛋白的稳定存在。因此需要通过试验优化来确定最佳诱导时间。在25 ℃，IPTG终浓度为0.8 mmol/L条件下，诱导rhβ2M，并分别对2、4、6、8、12、24 h样品进行电泳检测。诱导时间对rhβ2M可溶性表达的影响，结果如图 5所示，在其他诱导条件相同的情况下，rhβ2M可溶表达量随着诱导时间的增加，rhβ2M可溶表达量增加，当诱导时间为6 h或时间更长时，rhβ2M可溶表达量趋于稳定，约占菌体总可溶蛋白含量的63.2%。继续增加诱导时间，未见可溶表达水平提高，所以通过优化确定最佳的诱导时间为6 h。
图5
诱导时间对rhβ2M可溶性表达的影响
M：低分子量标准蛋白；1-6：诱导时间分别为2、4、6、8、12、24小时
Figure5. Effect of different time on the soluble expression level of rhβ2MLane M: protein M W marker; Lane 1-6: induced time of rhβ2M were 2, 4, 6, 8, 12, 24 h, respectively
2.3 rhβ2M纯化结果
在优化确定的rhβ2M表达最佳条件下，扩大培养细菌，诱导剂IPTG添加终浓度为0.8 mmol/L，25℃条件下诱导培养6 h，最后收集菌体，超声破碎后，取上清纯化。rhβ2M纯化的SDS-PAGE检测结果如图 6所示。凝胶扫描成像Bio-Rad软件分析显示rhβ2M表达量可达细菌总蛋白的39.2%，其可溶表达量占菌体总可溶蛋白含量的63.7%。通过Ni亲和层析纯化后，可获得纯度达95%以上的rhβ2M。
图6
β2M表达产物及其纯化后蛋白的SDS-PAGE分析
M：低分子量标准蛋白；1：未诱导菌体；2：诱导菌体；3：菌体超声破碎后的可溶蛋白；4-5：纯化后rhβ2M
Figure6. SDS-PAGE analysis of rhβ2M products and purified proteinM: protein M W marker; 1: uninduced expression of β2M in
2.4 rhβ2M的Western blot结果
rhβ2M的生物学活性检测选用鼠/兔抗人β2M单克隆抗体对rhβ2M进行免疫学鉴定。将纯化后的rhβ2M和购买的人β2M进行SDS-PAGE，并转印到硝酸纤维素膜上，进行免疫印迹分析，以人β2M为正对照，结果如图 7所示。目的蛋白rhβ2M可与鼠/兔抗人β2M单克隆抗体反应，约在30 kD(含标签的融合蛋白)处出现一条清晰的条带，大小与SDS-PAGE中检测的条带吻合。同时，人β2M在12 KDa附近的单一显色条带可以作为阳性对照。以上结果可知：原核表达获得的rhβ2M可与抗人β2M抗体特异性结合，条带唯一，特异性良好，具有生物学活性。
图7
rhβ2M免疫印迹检测结果
(a)SDS-PAGE检测结果；(b)一抗1：抗人β2M单克隆抗体(鼠源)；(c)一抗2：抗人β2M单克隆抗体(兔源)。M：预染蛋白标准；1：rhβ2M；2：人β2M
Figure7. Western blot analysis of rhβ2M(a) SDS-PAGE Analysis; (b) primary antibody 1： anti-β2M antibody (mouse monoclonal); (c) primary antibody 2： anti-β2M antibody (rabbit monoclonal). M： protein M W marker； 1： rhβ2M； 2： human β2M
3 讨论
基于β2M作为主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子的轻链部分[13]，及其在肾脏损伤和某些肿瘤患者临床检测中的广泛应用。获得高生物活性、高纯度的β2M是制备MHC四聚体分子和研发β2M检测试剂盒所需抗原不可或缺的前提条件。重组表达人β2M的研究已有报道，但是经过原核表达获得的重组蛋白多为包涵体，构建以可溶形式表达的rhβ2M成为研究的关键。本研究通过NCBI数据库获得人β2M氨基酸序列，通过对β2M密码子进行优化，获得E.coli惯用的密码子序列，之后化学合成β2M基因序列。选用带有促溶标签(硫氧还蛋白融合蛋白和多肽，Trx-tag)的载体pET32a(+)，构建重组质粒pET32a(+)-β2M并转入BL21(DE3)。该载体在进行基因表达时，硫氧还原蛋白有助于目的蛋白的正确折叠，促进有活性蛋白的产物形成，提高目的蛋白可溶表达量，并可以抵御蛋白酶的降解作用。
研究证实，外源基因在细菌中高效表达，可以通过调节宿主菌生长和代谢与外源基因表达速率之间的关系来实现，因此，对外源蛋白诱导条件的优化成为一个重要环节。外源蛋白表达的常规因素包括诱导剂IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等[14-15]，每个因素的变化均会影响宿主菌的生长代谢和外源蛋白的表达。本研究以rhβ2M可溶表达量来优化诱导条件，在优化过程中发现，诱导温度变化对rhβ2M可溶表达量有显著影响；诱导时间不宜过长，rhβ2M可溶表达量趋于稳定即可。在最佳诱导条件下，rhβ2M表达量可达细菌总蛋白的39.2%，可溶蛋白表达量占菌体总可溶蛋白含量的63.7%，实现了人β2M在E.coli中高效地可溶性表达。经过大量发酵培养，Ni2+螯合亲和层析柱纯化蛋白，其纯度可以达95%以上，最终获得高纯度rhβ2M。
生物活性方面，使用免疫学方法Western blot鉴定rhβ2M的抗原特性，以购买的人β2M为对照，该蛋白和构建的rhβ2M均出现单一条带，且条带分子量大小正确，说明rhβ2M能与抗人β2M单克隆抗体结合，具有较高特异性，进而证明该蛋白具有抗原的特性，为MHC四聚体分子制备研究以及β2M临床检测应用奠定基础。
