表观遗传学对骨髓间充质干细胞的调控作用已经成为医学领域的研究热点。本文主要综述了DNA甲基化、组蛋白乙酰化、小干扰RNA(siRNA)诱导基因沉默以及微小RNA(miRNA)四个方面对骨髓间充质干细胞调控作用的进展。结果表明, 表观遗传学对骨髓间充质干细胞的调控作用在骨修复、神经修复和心肌修复等方面的应用具有重要的意义。
引用本文： 陈志浩, 方淑斌, 田京. 表观遗传学对骨髓间充质干细胞调控作用的研究进展. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(3): 680-683. doi: 10.7507/1001-5515.20150123 复制
引言
表观遗传学是指DNA序列不发生变化而基因表达却发生了可遗传的改变的一门遗传学分支学科，主要机制包括：DNA甲基化、组蛋白修饰、基因沉默，广义上还包括微小RNA(microRNA, miRNA)的调控等[1]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体，具有多向分化潜能, 在细胞工程和基因工程中具有潜在应用前景，在再生医学中具有重要的临床应用价值[2]。近年来，表观遗传学在骨髓间充质干细胞凋亡与分化的调控作用研究中的应用已经成为热点，极大地促进了再生医学的发展，本文对主要研究进展作一综述。
1 DNA甲基化调控骨髓间充质干细胞的凋亡与分化
DNA甲基化是最重要的一种表观遗传学修饰方式，是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在CpG二核苷酸5′胞嘧啶的第5位碳原子上加一甲基基团，使之变成5′-甲基胞嘧啶的化学修饰过程[3]。其中，DNA启动子高甲基化能下调相应基因的表达，对骨髓间充质干细胞的凋亡有重要的调控作用。Choi等[4]通过对比第5代与第15代骨髓间充质干细胞中DNA的甲基化模式，研究DNA甲基化对骨髓间充质干细胞衰老的调控作用, 发现与DNA复制、细胞周期及过氧化物酶体增殖物活化受体信号通路相关基因的高甲基化可能为导致骨髓间充质干细胞衰老的重要原因。这意味着上述基因可能成为延缓骨髓间充质干细胞凋亡的重要靶点。此外，DNA启动子低甲基化则能上调基因的表达。Naeem等[5]用两种去甲基化药物zebularine和5-氮胞苷处理骨髓间充质干细胞，并分别用RT-PCR和免疫化学的方法测定心脏特异性基因和心肌特异性蛋白的表达水平，发现GATA4和Nkx2.5基因编码的mRNA、蛋白质，以及心肌肌钙蛋白T均可标测到，从而表明用DNA去甲基化药物可促使骨髓间充质干细胞转化形成心肌细胞。因此，DNA启动子的甲基化与去甲基化均可通过调控相应基因靶点的表达，从而调控骨髓间充质干细胞的分化与凋亡。
2 组蛋白乙酰化调控骨髓间充质干细胞的分化
组蛋白乙酰化是通过组蛋白乙酰基转移酶(histone acetylases, HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone acetyltransferase, HDACs)协调完成的，常见于组蛋白H3的Lys9、14、18、23和H4的Lys5、8、12、16等位点，其可使核小体的结构变得松弛，促进转录因子和协同转录因子与DNA分子接触，从而激活特定基因的转录过程[6]。组蛋白的去乙酰化是HDACs使启动子不易接近转录调控元件，从而抑制转录，和基因的失活相关。Dong等[7]用HDACs抑制剂丙戊酸处理骨髓间充质干细胞72 h，发现肝脏特异性标记物在mRNA和蛋白质水平均显著提高，同时丙戊酸可显著提高骨髓间充质干细胞分化形成的肝细胞功能，如糖原储存、细胞色素酶P450的活性以及甲胎蛋白和白蛋白合成均显著提高；通过进一步研究发现，骨髓间充质干细胞经丙戊酸处理后细胞中组蛋白H3、H4乙酰化程度增加，从而表明丙戊酸可能通过抑制HDACs的活性而增加染色质的乙酰化状态，进而促进骨髓间充质干细胞向肝细胞方向分化。然而，目前关于组蛋白乙酰化对骨髓间充质干细胞调控作用的研究仍然相对较少，需要更多的研究对其进行深入地探讨。
3 siRNA诱导基因沉默调控骨髓间充质干细胞的凋亡
人工导入、RNA病毒、转座子或重复序列等dsRNA被Dicer酶加工成长为21~26 nt的小干扰RNA(small interfering, siRNA)，这些siRNA可与一些蛋白组分形成一个沉默效应复合体，从而降解与siRNA互补的mRNA序列进而诱导基因沉默。Smac基因作为新发现的一种由线粒体释放的促凋亡蛋白, 其可参与细胞凋亡的线粒体通路和死亡受体通路的下游反应, 通过特异性地结合凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs), 解除IAPs对Caspase的抑制作用，从而促进细胞凋亡。陆超等[8-9]利用Par4-siRNA诱导Par4基因沉默，探讨Par4基因沉默对人骨髓间充质干细胞中Smac基因表达的影响。研究结果表明，设计的Par4-siRNA可显著诱导骨髓间充质干细胞中Par4基因沉默，进而拮抗谷氨酸对骨髓间充质干细胞凋亡的诱导作用，而后者可能与Par4-siRNA对谷氨酸诱导的骨髓间充质干细胞中Smac蛋白表达上调，进而上调Caspase-3的活性密切相关。骨髓间充质干细胞移植在修复梗死心肌组织中有着良好的应用前景，而氧化应激作用使大部分移植后的骨髓间充质干细胞存活时间短，从而限制了该疗法的广泛应用。Hua等[10]为研究siRNA靶向下调Caspase-3的表达对骨髓间充质干细胞凋亡的影响，通过初步实验表明，转染Caspase-3 siRNA的骨髓间充质干细胞中编码Caspase-3酶的mRNA及Caspase-3酶的表达量均比非转染的骨髓间充质干细胞低。在此基础上，其用含双氧水的培养基培养骨髓间充质干细胞以诱导其凋亡过程，发现双氧水诱导凋亡的骨髓间充质干细胞与正常骨髓间充质干细胞转染Caspase-3 siRNA后，前者编码Caspase-3酶的mRNA显著高于后者，从而表明siRNA可通过靶向下调Caspase-3的表达，显著提高氧化应激作用下的骨髓间充质干细胞的存活率。由于调控细胞凋亡的基因数量巨大，在对这些基因进行深入分析的基础上设计出相应的siRNA诱导基因沉默，因此siRNA在调控细胞凋亡方面有着良好的应用前景。
4 miRNA调控骨髓间充质干细胞的分化
miRNA是一类具有调控功能的内源性非编码RNA，其大小为20～25个核苷酸，可通过结合靶mRNA中的3′非编码区，从而降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻译。据统计，人类约有30%的基因受到miRNA的调控。目前相关研究表明，miRNA在调控骨髓间充质干细胞的神经分化、成骨分化及心肌分化方面有着重要的作用。研究表明，miRNA-124[11]/125b[12]/9[13]均可诱导骨髓间充质干细胞的神经分化，其中，miRNA-124/125b调控骨髓间充质干细胞的神经分化主要与上调细胞中β3微管蛋白和微管相关蛋白2表达率密切相关，而miRNA-9则可能通过Notch-9信号通路[13]或锌指蛋白521[14]调控骨髓间充质干细胞的神经分化。在萎缩性骨不连组织中，hsa-miRNA-149、hsa-miRNA-654-5p和hsa-miRNA-221的表达上调，而魏钧强[15-16]等则通过定量实时PCR和免疫印迹法测定第4代人骨髓间充质干细胞的成骨分化过程相关基因编码的mRNA和蛋白质在不同时间的表达水平, 发现碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein, BMP-2)和血小板源生长因子A(platelet-derived growth factor A, PDGF-A)均显著增加，hsa-miRNA-149和hsa-miRNA-654-5p分别能负性调控ALP和BMP-2基因编码的mRNA与蛋白质水平，而hsa-miRNA-221则与PDGF-A无明显关系，其中hsa-miRNA-654-5p可通过作用于BMP-2的特定靶点而直接抑制BMP-2的mRNA和蛋白表达，但hsa-miRNA-149是否也通过作用于ALP的特定靶点而直接抑制BMP-2的mRNA和蛋白表达则仍需进一步的研究去探索。此外，miRNA-125b能特异性与Smad4 mRNA的3'-UTR结合，而干扰Smad4表达则能抑制ALP活性及RUNX2 mRNA表达水平，因此miRNA-125b可通过抑制靶基因Smad4的表达调控骨髓间充质干细胞的成骨分化[17]，而miRNA-31可通过抑制骨特异性转录因子Osterix的表达调控骨髓间充质干细胞的成骨分化[18]，相关研究表明，miRNA-146a[19]、miRNA-26a[20]和miRNA-30a-5P[21]可能参与调控骨髓间充质干细胞的成骨分化，但是具体的机制则仍不清楚。此外，Liu等[22]通过研究表明miRNA-16可以通过抑制CCND1、CCND2和CDK6基因的表达，诱导骨髓间充质干细胞分裂阻滞于G1期，进而促使骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化。相关研究初步表明miRNA-424[23]和miRNA-499[24]可诱导大鼠骨髓来源间充质干细胞向心肌样细胞分化，但其具体的机制则仍需要进一步研究去探讨。
5 展望
综上所述，DNA甲基化、组蛋白乙酰化、siRNA诱导基因沉默以及miRNA能够调控骨髓间充质干细胞的凋亡与分化，促进骨髓间充质干细胞在骨修复、神经修复和心肌修复等方面的应用。然而，表观遗传学在骨髓间充质干细胞研究中的应用仍然存在诸多不足。首先，miRNA-146a、miRNA-26a和miRNA-30a-5P调控骨髓间充质干细胞成骨分化，以及miRNA-424和miRNA-499调控骨髓间充质干细胞心肌分化的具体机制仍然不清楚；其次，许多研究仍处于基础研究阶段，如何与临床治疗更好地结合起来则需要进一步的探索。因此，表观遗传学在骨髓间充质干细胞的调控方面具有良好的应用前景，但是仍需更多深入地去探讨研究。
引言
表观遗传学是指DNA序列不发生变化而基因表达却发生了可遗传的改变的一门遗传学分支学科，主要机制包括：DNA甲基化、组蛋白修饰、基因沉默，广义上还包括微小RNA(microRNA, miRNA)的调控等[1]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体，具有多向分化潜能, 在细胞工程和基因工程中具有潜在应用前景，在再生医学中具有重要的临床应用价值[2]。近年来，表观遗传学在骨髓间充质干细胞凋亡与分化的调控作用研究中的应用已经成为热点，极大地促进了再生医学的发展，本文对主要研究进展作一综述。
1 DNA甲基化调控骨髓间充质干细胞的凋亡与分化
DNA甲基化是最重要的一种表观遗传学修饰方式，是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在CpG二核苷酸5′胞嘧啶的第5位碳原子上加一甲基基团，使之变成5′-甲基胞嘧啶的化学修饰过程[3]。其中，DNA启动子高甲基化能下调相应基因的表达，对骨髓间充质干细胞的凋亡有重要的调控作用。Choi等[4]通过对比第5代与第15代骨髓间充质干细胞中DNA的甲基化模式，研究DNA甲基化对骨髓间充质干细胞衰老的调控作用, 发现与DNA复制、细胞周期及过氧化物酶体增殖物活化受体信号通路相关基因的高甲基化可能为导致骨髓间充质干细胞衰老的重要原因。这意味着上述基因可能成为延缓骨髓间充质干细胞凋亡的重要靶点。此外，DNA启动子低甲基化则能上调基因的表达。Naeem等[5]用两种去甲基化药物zebularine和5-氮胞苷处理骨髓间充质干细胞，并分别用RT-PCR和免疫化学的方法测定心脏特异性基因和心肌特异性蛋白的表达水平，发现GATA4和Nkx2.5基因编码的mRNA、蛋白质，以及心肌肌钙蛋白T均可标测到，从而表明用DNA去甲基化药物可促使骨髓间充质干细胞转化形成心肌细胞。因此，DNA启动子的甲基化与去甲基化均可通过调控相应基因靶点的表达，从而调控骨髓间充质干细胞的分化与凋亡。
2 组蛋白乙酰化调控骨髓间充质干细胞的分化
组蛋白乙酰化是通过组蛋白乙酰基转移酶(histone acetylases, HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone acetyltransferase, HDACs)协调完成的，常见于组蛋白H3的Lys9、14、18、23和H4的Lys5、8、12、16等位点，其可使核小体的结构变得松弛，促进转录因子和协同转录因子与DNA分子接触，从而激活特定基因的转录过程[6]。组蛋白的去乙酰化是HDACs使启动子不易接近转录调控元件，从而抑制转录，和基因的失活相关。Dong等[7]用HDACs抑制剂丙戊酸处理骨髓间充质干细胞72 h，发现肝脏特异性标记物在mRNA和蛋白质水平均显著提高，同时丙戊酸可显著提高骨髓间充质干细胞分化形成的肝细胞功能，如糖原储存、细胞色素酶P450的活性以及甲胎蛋白和白蛋白合成均显著提高；通过进一步研究发现，骨髓间充质干细胞经丙戊酸处理后细胞中组蛋白H3、H4乙酰化程度增加，从而表明丙戊酸可能通过抑制HDACs的活性而增加染色质的乙酰化状态，进而促进骨髓间充质干细胞向肝细胞方向分化。然而，目前关于组蛋白乙酰化对骨髓间充质干细胞调控作用的研究仍然相对较少，需要更多的研究对其进行深入地探讨。
3 siRNA诱导基因沉默调控骨髓间充质干细胞的凋亡
人工导入、RNA病毒、转座子或重复序列等dsRNA被Dicer酶加工成长为21~26 nt的小干扰RNA(small interfering, siRNA)，这些siRNA可与一些蛋白组分形成一个沉默效应复合体，从而降解与siRNA互补的mRNA序列进而诱导基因沉默。Smac基因作为新发现的一种由线粒体释放的促凋亡蛋白, 其可参与细胞凋亡的线粒体通路和死亡受体通路的下游反应, 通过特异性地结合凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs), 解除IAPs对Caspase的抑制作用，从而促进细胞凋亡。陆超等[8-9]利用Par4-siRNA诱导Par4基因沉默，探讨Par4基因沉默对人骨髓间充质干细胞中Smac基因表达的影响。研究结果表明，设计的Par4-siRNA可显著诱导骨髓间充质干细胞中Par4基因沉默，进而拮抗谷氨酸对骨髓间充质干细胞凋亡的诱导作用，而后者可能与Par4-siRNA对谷氨酸诱导的骨髓间充质干细胞中Smac蛋白表达上调，进而上调Caspase-3的活性密切相关。骨髓间充质干细胞移植在修复梗死心肌组织中有着良好的应用前景，而氧化应激作用使大部分移植后的骨髓间充质干细胞存活时间短，从而限制了该疗法的广泛应用。Hua等[10]为研究siRNA靶向下调Caspase-3的表达对骨髓间充质干细胞凋亡的影响，通过初步实验表明，转染Caspase-3 siRNA的骨髓间充质干细胞中编码Caspase-3酶的mRNA及Caspase-3酶的表达量均比非转染的骨髓间充质干细胞低。在此基础上，其用含双氧水的培养基培养骨髓间充质干细胞以诱导其凋亡过程，发现双氧水诱导凋亡的骨髓间充质干细胞与正常骨髓间充质干细胞转染Caspase-3 siRNA后，前者编码Caspase-3酶的mRNA显著高于后者，从而表明siRNA可通过靶向下调Caspase-3的表达，显著提高氧化应激作用下的骨髓间充质干细胞的存活率。由于调控细胞凋亡的基因数量巨大，在对这些基因进行深入分析的基础上设计出相应的siRNA诱导基因沉默，因此siRNA在调控细胞凋亡方面有着良好的应用前景。
4 miRNA调控骨髓间充质干细胞的分化
miRNA是一类具有调控功能的内源性非编码RNA，其大小为20～25个核苷酸，可通过结合靶mRNA中的3′非编码区，从而降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻译。据统计，人类约有30%的基因受到miRNA的调控。目前相关研究表明，miRNA在调控骨髓间充质干细胞的神经分化、成骨分化及心肌分化方面有着重要的作用。研究表明，miRNA-124[11]/125b[12]/9[13]均可诱导骨髓间充质干细胞的神经分化，其中，miRNA-124/125b调控骨髓间充质干细胞的神经分化主要与上调细胞中β3微管蛋白和微管相关蛋白2表达率密切相关，而miRNA-9则可能通过Notch-9信号通路[13]或锌指蛋白521[14]调控骨髓间充质干细胞的神经分化。在萎缩性骨不连组织中，hsa-miRNA-149、hsa-miRNA-654-5p和hsa-miRNA-221的表达上调，而魏钧强[15-16]等则通过定量实时PCR和免疫印迹法测定第4代人骨髓间充质干细胞的成骨分化过程相关基因编码的mRNA和蛋白质在不同时间的表达水平, 发现碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein, BMP-2)和血小板源生长因子A(platelet-derived growth factor A, PDGF-A)均显著增加，hsa-miRNA-149和hsa-miRNA-654-5p分别能负性调控ALP和BMP-2基因编码的mRNA与蛋白质水平，而hsa-miRNA-221则与PDGF-A无明显关系，其中hsa-miRNA-654-5p可通过作用于BMP-2的特定靶点而直接抑制BMP-2的mRNA和蛋白表达，但hsa-miRNA-149是否也通过作用于ALP的特定靶点而直接抑制BMP-2的mRNA和蛋白表达则仍需进一步的研究去探索。此外，miRNA-125b能特异性与Smad4 mRNA的3'-UTR结合，而干扰Smad4表达则能抑制ALP活性及RUNX2 mRNA表达水平，因此miRNA-125b可通过抑制靶基因Smad4的表达调控骨髓间充质干细胞的成骨分化[17]，而miRNA-31可通过抑制骨特异性转录因子Osterix的表达调控骨髓间充质干细胞的成骨分化[18]，相关研究表明，miRNA-146a[19]、miRNA-26a[20]和miRNA-30a-5P[21]可能参与调控骨髓间充质干细胞的成骨分化，但是具体的机制则仍不清楚。此外，Liu等[22]通过研究表明miRNA-16可以通过抑制CCND1、CCND2和CDK6基因的表达，诱导骨髓间充质干细胞分裂阻滞于G1期，进而促使骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化。相关研究初步表明miRNA-424[23]和miRNA-499[24]可诱导大鼠骨髓来源间充质干细胞向心肌样细胞分化，但其具体的机制则仍需要进一步研究去探讨。
5 展望
综上所述，DNA甲基化、组蛋白乙酰化、siRNA诱导基因沉默以及miRNA能够调控骨髓间充质干细胞的凋亡与分化，促进骨髓间充质干细胞在骨修复、神经修复和心肌修复等方面的应用。然而，表观遗传学在骨髓间充质干细胞研究中的应用仍然存在诸多不足。首先，miRNA-146a、miRNA-26a和miRNA-30a-5P调控骨髓间充质干细胞成骨分化，以及miRNA-424和miRNA-499调控骨髓间充质干细胞心肌分化的具体机制仍然不清楚；其次，许多研究仍处于基础研究阶段，如何与临床治疗更好地结合起来则需要进一步的探索。因此，表观遗传学在骨髓间充质干细胞的调控方面具有良好的应用前景，但是仍需更多深入地去探讨研究。