介绍一种利用聚氨酯高分子材料和有机溶剂四氢呋喃配制的溶液制备犬门脉高压症动物模型的方法, 并评价成模效果。选用西安本地杂种犬12只, 取上腹部小切口, 经门静脉推注8%(W/V)的聚氨酯-四氢呋喃溶液建立门脉高压症模型。分别在造模前、造模中、造模后4、8、12周测量实验犬门静脉压力, 以造模前门静脉压力作为正常参考值, 评估模型建立效果。结果显示经门静脉注射聚氨酯-四氢呋喃溶液后门静脉压力可立即升至造模前的2.5倍, 4周后门静脉压力维持在造模前的1.5倍以上。该法制备犬门脉高压症模型操作简单、死亡率低、门静脉压力维持稳定, 尤其是腹腔粘连极轻, 门静脉的结构和位置保持正常, 非常适合外科手术治疗门脉高压症方面的研究。
引用本文： 严小鹏, 任冯刚, 马佳, 董鼎辉, 薛飞, 吕毅. 门脉注射聚氨酯-四氢呋喃溶液制备犬门脉高压症模型. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(3): 645-649. doi: 10.7507/1001-5515.20150117 复制
引言
肝炎肝硬化导致的门脉高压症是临床常见疾病，门脉高压症可引起食管胃底静脉曲张破裂出血，是上消化道出血最常见的原因。临床治疗肝硬化门脉高压症的手术方法众多，对于各种手术方式的利弊各学者间争议较大。大动物门脉高压症模型能够为研究各种外科手术方法的利弊提供有力证据，然而目前大动物门脉高压症动物模型的建立方法虽然较多，但都存在着各自的缺点。本文配制出了制备犬门脉高压症动物模型的一种复合高分子材料溶液，通过门静脉穿刺直接注射即可快速制备出犬门脉高压症模型，并且具有操作简单、成功率高的优点，尤其是腹腔基本无粘连，正常的门静脉结构和解剖位置不被影响，利于二次手术操作，非常适用于门脉高压症的外科手术干预研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
西安本地杂种犬12只(购于西安交通大学动物实验中心)，雌雄不限，年龄＞12月，体重15～20 kg。本实验研究经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会审核批准，所有实验动物在实验过程中均严格按照我国实验动物福利要求进行。
1.1.2 实验试剂
医用聚氨酯(天津市康盾宝医用聚氨酯技术有限公司)；四氢呋喃(分析纯)(天津市津东天正精细化学试剂厂)；肝素(12500 IU/100 mg, 江苏万邦生化医药股份有限公司)；青霉素钾(华北制药股份有限公司)；生理盐水(石家庄四药有限公司)。
1.1.3 实验仪器
MEC-2000便携式多参数监护仪及有创压力传感器(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 聚氨酯-四氢呋喃溶液的配制
医用聚氨酯颗粒8 g，经超声清洗后室温干燥备用。四氢呋喃溶液100 mL中加入8 g医用聚氨酯颗粒，密封，轻微震荡约24 h即成浓度为8%(W/V)的聚氨酯-四氢呋喃溶液。
1.2.2 动物分组及模型制备
所有实验犬均适应性笼养1周后开始实施手术。采用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)腹腔注射麻醉，麻醉满意后仰卧位固定，气管插管，常规备皮、消毒、铺无菌手术单。取上腹部正中切口，长约5 cm，逐层切开进腹，暴露门静脉。穿刺部位在脾静脉汇入部上方约5 mm处，22 G聚四氟乙烯套管针直接刺入门静脉，见血从套管流出后，拔出针芯，立即通过三通与注射器相连，排尽气泡后接事先充满肝素盐水(12.5 IU/mL)的一次性压力传感装置专用测压管路，压力转换头接心电监护仪的有创血压监测接口，以犬右心房水平面为基准进行校正调零，妥善固定压力传感装置。测量门静脉压力值作为犬门静脉压的正常参考值。然后用玻璃管注射器吸取聚氨酯-四氢呋喃溶液(1 mL/kg)，7号针在门静脉入肝处直接穿刺门静脉快速推注，同时动态观察门静脉压力值，一般使门静脉压力上升至正常值的2.5倍为宜。小心拔出注射器针头和聚四氟乙烯套管穿刺针，小纱布按压门静脉壁上的针孔约5 min，出血止住即可逐层关腹，拔除气管插管。术后给予青霉素钾1.6×105 U肌肉注射，一日两次，连续3日。术后所有犬常规笼养。
1.2.3 门静脉压力测量
所有犬在造模前、造模中、造模后4、8、12周均采用开腹下门静脉穿刺直接测量门静脉压力变化，方法与造模手术中测压方法相同。
1.2.4 血清生化指标检测
所有实验犬均在造模前以及造模后1 d、3 d、7 d、2周、4周、8周、12周经大隐静脉采血检测谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)、总蛋白(total protein, TP)和白蛋白(albumin, ALB)。
1.2.5 肝脏肉眼观察和光镜下组织学观察
造模后12周，静脉推注过量麻醉药处死动物，剖腹观察腹腔及门静脉黏连状况，取出肝脏，肉眼观察肝脏大体标本，同时多点切取小块肝脏组织10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肝脏组织学结构。
1.2.6 统计学处理
数据以均值±标准差表示，采用SPSS 17.0软件进行分析，组间比较采用成组t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 门静脉压力变化
实验犬门静脉压力造模前为(7.93±0.80)mm Hg，推注聚氨酯-四氢呋喃溶液后门静脉压力升至(17.79±1.26)mm Hg(P＜0.001)，术后4周门静脉压力为(14.44±1.77)mm Hg较造模术中略有所下降，但与造模前比较仍显著升高(P＜0.001)，维持在1.5倍以上，术后8周、12周门静脉压力维持稳定，与造模前相比均升高(P＜0.001)，门静脉压力稳定地维持在正常值的1.5倍以上，如图 1所示。
图1
造模前后不同时间点门静脉压力变化
*与造模前比较，
*
2.2 血清生化指标
血清生化检查显示，在推注聚氨酯-四氢呋喃溶液后肝功能指标升高，尤以ALT和AST在术后3 d升高最为显著(P＜0.001)，但在7 d以后逐渐下降，在造模后2周左右ALT和AST降至造模前水平，血清蛋白TP和ALB水平在造模前后无显著改变，如图 2所示。
图2
造模前后血清生化检测
*与造模前比较，
*
2.3 肝脏大体及组织学观察
造模后12周，剖腹观察可见实验组腹腔无粘连，门静脉解剖位置及结构清晰可见，无周围组织粘连。肝脏大小、形态、质地正常，无肉眼可见的病理改变。自门静脉起始部开始沿门静脉主干及其分支剖开门静脉系统，清晰可见门静脉内成固态条索状沿门脉系统分布的“树状”聚氨酯，有细小丝状聚氨酯延伸分布于门静脉细小分支，门脉系统内未见肉眼血栓形成，如图 3所示。病理学观察可见造模后12周肝小叶结构稍有紊乱，但没有明显的假小叶形成，如图 4所示。
图3
聚氨酯成条索状沿门静脉走形分布
(a)沿门静脉走形分布的条索状聚氨酯；(b)聚氨酯可分布至门静脉细小分支；(c)沿门静脉解剖分离出的条索状聚氨酯
Figure3. Polyurethane distributed along the portal vein with a cord-like structure(a) the cord-like polyurethane distributed along the portal vein; (b) the polyurethane could distributed in small branches of portal vein system; (c) the cord-like polyurethane isolated from the portal vein anatomically
图4
造模前后犬肝脏组织学观察比较(HE，100×)
Figure4.
Histological observation and comparison of canine liver before and after modeling (HE, 100×)
3 讨论
门脉高压症模型的建立方法较多，有化学药物肝损伤法[1-4](四氯化碳、二甲基亚硝胺、硫代乙酰胺)、门静脉缩窄法[5-6]、门脉系统异物栓塞法[7-10]，胆总管结扎法[11]等。化学药物肝损伤法适用于大鼠等小动物肝硬化模型的制备，模型制备成功率较高，其肝硬化病理表现与人类肝硬化较为相似，主要用来做药理、药效实验。门静脉缩窄法通过丝线部分缩窄门静脉一次手术即可完成，但门脉缩窄程度不易掌握，缩窄程度不够门静脉压力升高不明显，门静脉过分缩窄易造成肠道淤血动物死亡，因此门脉缩窄法成功率较低。门静脉系统异物栓塞法制备肝前型门脉高压症模型最为重要的就是栓塞异物的选择。李宗芳等[7]采用1/2门静脉缩窄联合丝线栓堵法制备犬门脉高压症模型，效果可靠。但是操作繁琐，最重要的是手术操作对腹腔刺激较为严重，因而常造成严重的腹腔黏连尤其是门静脉部位周围组织包裹黏连严重，非常不利于后期的门腔分流等手术操作。同时，丝线慢性栓塞门静脉最终导致门静脉系统闭塞，从病理上来讲与临床门脉高压症差异较大。白芨粉等异物门静脉栓塞法同样最终导致门静脉完全闭塞，不适用分流手术效果的实验研究。
本实验采用聚氨酯-四氢呋喃溶液制备犬门脉高压症模型对动物腹腔干扰小，仅需腹部极小切口在满足暴露门静脉的条件下，通过注射器直接穿刺门静脉推注聚氨酯复合溶液即可完成。对门静脉的损伤也极其微小，针刺口通过短暂压迫即可止血，保证了安全性。
聚氨酯是一种生物相容性极佳的高分子材料，已被作为人造血管的原料用于生物体内[12]。四氢呋喃是极性很高的化学溶剂，极易溶于水，能溶解绝大多数高分子材料，对生物体有较大的毒性。聚氨酯-四氢呋喃进入血管后，四氢呋喃迅速溶于血液里面的水，并随着血液流动被带走，从而造成聚氨酯析出，并呈现出柔软的丝絮状，随着血液的流动漂流到血管小分支内成固态存在。聚氨酯-四氢呋喃溶液浓度越高黏性越大，流动性越差，静脉推注越困难，甚至会导致针头堵塞；反之，溶液浓度越低，流动性越佳，越易推注，但在满足门脉部分栓堵的条件下随着溶液推注量增加，进入动物体内的四氢呋喃用量增加，对动物的毒性危害就越大，动物死亡率较高。8%(W/V)的溶度配比是作者经过多次试验，探索出来的最为合适的浓度。该浓度下既能保证顺利推注，又能最大限度地减少四氢呋喃的用量，提高了动物的存活率。同时，在8%(W/V)的浓度下，将门静脉压力升高至正常值两倍的聚氨酯-四氢呋喃溶液的用量大约为1 mL/kg。
实验犬在静脉推注聚氨酯-四氢呋喃溶液后3天，ALT和AST升高到正常值的数倍，其他肝功能指标基本能维持正常。主要原因为四氢呋喃对肝脏造成的急性损伤，但此种肝损伤是一过性的，在术后1周至2周实验犬AST和ALT逐渐恢复至正常。成“树状”分布于门静脉系统的聚氨酯除了能增加门脉血流阻力外，对肝脏功能无影响。而且，由于聚氨酯血液相容性高，门静脉系统内不会形成血栓，也就不会造成门静脉的完全闭塞，这与临床上的门脉高压症比较相似，这也是本法优于其他门脉异物栓塞法的最大优点。
聚氨酯-四氢呋喃溶液制备门脉高压症模型操作简单，对腹腔刺激小，腹腔无粘连，非常适用于门脉高压症的外科手术研究。术中推注聚氨酯-四氢呋喃溶液(1 mL/kg)可使门脉压力立即升至正常压力2倍以上；随着门静脉侧枝循环的建立，术后门脉压力会有所下降，但4周以后，门脉压力趋于稳定，并能维持门脉压力在正常值的1.5倍以上，此时方适合进行下一步实验。
本方法制备门脉高压症模型属于肝前型，肝脏组织病理不发生改变，不形成肝硬化，这与临床患者的肝炎肝硬化导致的门脉高压症发病机制不同，因此不适用于研究肝硬化门脉高压症的发病机制及药理、药效实验研究。
引言
肝炎肝硬化导致的门脉高压症是临床常见疾病，门脉高压症可引起食管胃底静脉曲张破裂出血，是上消化道出血最常见的原因。临床治疗肝硬化门脉高压症的手术方法众多，对于各种手术方式的利弊各学者间争议较大。大动物门脉高压症模型能够为研究各种外科手术方法的利弊提供有力证据，然而目前大动物门脉高压症动物模型的建立方法虽然较多，但都存在着各自的缺点。本文配制出了制备犬门脉高压症动物模型的一种复合高分子材料溶液，通过门静脉穿刺直接注射即可快速制备出犬门脉高压症模型，并且具有操作简单、成功率高的优点，尤其是腹腔基本无粘连，正常的门静脉结构和解剖位置不被影响，利于二次手术操作，非常适用于门脉高压症的外科手术干预研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
西安本地杂种犬12只(购于西安交通大学动物实验中心)，雌雄不限，年龄＞12月，体重15～20 kg。本实验研究经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会审核批准，所有实验动物在实验过程中均严格按照我国实验动物福利要求进行。
1.1.2 实验试剂
医用聚氨酯(天津市康盾宝医用聚氨酯技术有限公司)；四氢呋喃(分析纯)(天津市津东天正精细化学试剂厂)；肝素(12500 IU/100 mg, 江苏万邦生化医药股份有限公司)；青霉素钾(华北制药股份有限公司)；生理盐水(石家庄四药有限公司)。
1.1.3 实验仪器
MEC-2000便携式多参数监护仪及有创压力传感器(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 聚氨酯-四氢呋喃溶液的配制
医用聚氨酯颗粒8 g，经超声清洗后室温干燥备用。四氢呋喃溶液100 mL中加入8 g医用聚氨酯颗粒，密封，轻微震荡约24 h即成浓度为8%(W/V)的聚氨酯-四氢呋喃溶液。
1.2.2 动物分组及模型制备
所有实验犬均适应性笼养1周后开始实施手术。采用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)腹腔注射麻醉，麻醉满意后仰卧位固定，气管插管，常规备皮、消毒、铺无菌手术单。取上腹部正中切口，长约5 cm，逐层切开进腹，暴露门静脉。穿刺部位在脾静脉汇入部上方约5 mm处，22 G聚四氟乙烯套管针直接刺入门静脉，见血从套管流出后，拔出针芯，立即通过三通与注射器相连，排尽气泡后接事先充满肝素盐水(12.5 IU/mL)的一次性压力传感装置专用测压管路，压力转换头接心电监护仪的有创血压监测接口，以犬右心房水平面为基准进行校正调零，妥善固定压力传感装置。测量门静脉压力值作为犬门静脉压的正常参考值。然后用玻璃管注射器吸取聚氨酯-四氢呋喃溶液(1 mL/kg)，7号针在门静脉入肝处直接穿刺门静脉快速推注，同时动态观察门静脉压力值，一般使门静脉压力上升至正常值的2.5倍为宜。小心拔出注射器针头和聚四氟乙烯套管穿刺针，小纱布按压门静脉壁上的针孔约5 min，出血止住即可逐层关腹，拔除气管插管。术后给予青霉素钾1.6×105 U肌肉注射，一日两次，连续3日。术后所有犬常规笼养。
1.2.3 门静脉压力测量
所有犬在造模前、造模中、造模后4、8、12周均采用开腹下门静脉穿刺直接测量门静脉压力变化，方法与造模手术中测压方法相同。
1.2.4 血清生化指标检测
所有实验犬均在造模前以及造模后1 d、3 d、7 d、2周、4周、8周、12周经大隐静脉采血检测谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)、总蛋白(total protein, TP)和白蛋白(albumin, ALB)。
1.2.5 肝脏肉眼观察和光镜下组织学观察
造模后12周，静脉推注过量麻醉药处死动物，剖腹观察腹腔及门静脉黏连状况，取出肝脏，肉眼观察肝脏大体标本，同时多点切取小块肝脏组织10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肝脏组织学结构。
1.2.6 统计学处理
数据以均值±标准差表示，采用SPSS 17.0软件进行分析，组间比较采用成组t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 门静脉压力变化
实验犬门静脉压力造模前为(7.93±0.80)mm Hg，推注聚氨酯-四氢呋喃溶液后门静脉压力升至(17.79±1.26)mm Hg(P＜0.001)，术后4周门静脉压力为(14.44±1.77)mm Hg较造模术中略有所下降，但与造模前比较仍显著升高(P＜0.001)，维持在1.5倍以上，术后8周、12周门静脉压力维持稳定，与造模前相比均升高(P＜0.001)，门静脉压力稳定地维持在正常值的1.5倍以上，如图 1所示。
图1
造模前后不同时间点门静脉压力变化
*与造模前比较，
*
2.2 血清生化指标
血清生化检查显示，在推注聚氨酯-四氢呋喃溶液后肝功能指标升高，尤以ALT和AST在术后3 d升高最为显著(P＜0.001)，但在7 d以后逐渐下降，在造模后2周左右ALT和AST降至造模前水平，血清蛋白TP和ALB水平在造模前后无显著改变，如图 2所示。
图2
造模前后血清生化检测
*与造模前比较，
*
2.3 肝脏大体及组织学观察
造模后12周，剖腹观察可见实验组腹腔无粘连，门静脉解剖位置及结构清晰可见，无周围组织粘连。肝脏大小、形态、质地正常，无肉眼可见的病理改变。自门静脉起始部开始沿门静脉主干及其分支剖开门静脉系统，清晰可见门静脉内成固态条索状沿门脉系统分布的“树状”聚氨酯，有细小丝状聚氨酯延伸分布于门静脉细小分支，门脉系统内未见肉眼血栓形成，如图 3所示。病理学观察可见造模后12周肝小叶结构稍有紊乱，但没有明显的假小叶形成，如图 4所示。
图3
聚氨酯成条索状沿门静脉走形分布
(a)沿门静脉走形分布的条索状聚氨酯；(b)聚氨酯可分布至门静脉细小分支；(c)沿门静脉解剖分离出的条索状聚氨酯
Figure3. Polyurethane distributed along the portal vein with a cord-like structure(a) the cord-like polyurethane distributed along the portal vein; (b) the polyurethane could distributed in small branches of portal vein system; (c) the cord-like polyurethane isolated from the portal vein anatomically
图4
造模前后犬肝脏组织学观察比较(HE，100×)
Figure4.
Histological observation and comparison of canine liver before and after modeling (HE, 100×)
3 讨论
门脉高压症模型的建立方法较多，有化学药物肝损伤法[1-4](四氯化碳、二甲基亚硝胺、硫代乙酰胺)、门静脉缩窄法[5-6]、门脉系统异物栓塞法[7-10]，胆总管结扎法[11]等。化学药物肝损伤法适用于大鼠等小动物肝硬化模型的制备，模型制备成功率较高，其肝硬化病理表现与人类肝硬化较为相似，主要用来做药理、药效实验。门静脉缩窄法通过丝线部分缩窄门静脉一次手术即可完成，但门脉缩窄程度不易掌握，缩窄程度不够门静脉压力升高不明显，门静脉过分缩窄易造成肠道淤血动物死亡，因此门脉缩窄法成功率较低。门静脉系统异物栓塞法制备肝前型门脉高压症模型最为重要的就是栓塞异物的选择。李宗芳等[7]采用1/2门静脉缩窄联合丝线栓堵法制备犬门脉高压症模型，效果可靠。但是操作繁琐，最重要的是手术操作对腹腔刺激较为严重，因而常造成严重的腹腔黏连尤其是门静脉部位周围组织包裹黏连严重，非常不利于后期的门腔分流等手术操作。同时，丝线慢性栓塞门静脉最终导致门静脉系统闭塞，从病理上来讲与临床门脉高压症差异较大。白芨粉等异物门静脉栓塞法同样最终导致门静脉完全闭塞，不适用分流手术效果的实验研究。
本实验采用聚氨酯-四氢呋喃溶液制备犬门脉高压症模型对动物腹腔干扰小，仅需腹部极小切口在满足暴露门静脉的条件下，通过注射器直接穿刺门静脉推注聚氨酯复合溶液即可完成。对门静脉的损伤也极其微小，针刺口通过短暂压迫即可止血，保证了安全性。
聚氨酯是一种生物相容性极佳的高分子材料，已被作为人造血管的原料用于生物体内[12]。四氢呋喃是极性很高的化学溶剂，极易溶于水，能溶解绝大多数高分子材料，对生物体有较大的毒性。聚氨酯-四氢呋喃进入血管后，四氢呋喃迅速溶于血液里面的水，并随着血液流动被带走，从而造成聚氨酯析出，并呈现出柔软的丝絮状，随着血液的流动漂流到血管小分支内成固态存在。聚氨酯-四氢呋喃溶液浓度越高黏性越大，流动性越差，静脉推注越困难，甚至会导致针头堵塞；反之，溶液浓度越低，流动性越佳，越易推注，但在满足门脉部分栓堵的条件下随着溶液推注量增加，进入动物体内的四氢呋喃用量增加，对动物的毒性危害就越大，动物死亡率较高。8%(W/V)的溶度配比是作者经过多次试验，探索出来的最为合适的浓度。该浓度下既能保证顺利推注，又能最大限度地减少四氢呋喃的用量，提高了动物的存活率。同时，在8%(W/V)的浓度下，将门静脉压力升高至正常值两倍的聚氨酯-四氢呋喃溶液的用量大约为1 mL/kg。
实验犬在静脉推注聚氨酯-四氢呋喃溶液后3天，ALT和AST升高到正常值的数倍，其他肝功能指标基本能维持正常。主要原因为四氢呋喃对肝脏造成的急性损伤，但此种肝损伤是一过性的，在术后1周至2周实验犬AST和ALT逐渐恢复至正常。成“树状”分布于门静脉系统的聚氨酯除了能增加门脉血流阻力外，对肝脏功能无影响。而且，由于聚氨酯血液相容性高，门静脉系统内不会形成血栓，也就不会造成门静脉的完全闭塞，这与临床上的门脉高压症比较相似，这也是本法优于其他门脉异物栓塞法的最大优点。
聚氨酯-四氢呋喃溶液制备门脉高压症模型操作简单，对腹腔刺激小，腹腔无粘连，非常适用于门脉高压症的外科手术研究。术中推注聚氨酯-四氢呋喃溶液(1 mL/kg)可使门脉压力立即升至正常压力2倍以上；随着门静脉侧枝循环的建立，术后门脉压力会有所下降，但4周以后，门脉压力趋于稳定，并能维持门脉压力在正常值的1.5倍以上，此时方适合进行下一步实验。
本方法制备门脉高压症模型属于肝前型，肝脏组织病理不发生改变，不形成肝硬化，这与临床患者的肝炎肝硬化导致的门脉高压症发病机制不同，因此不适用于研究肝硬化门脉高压症的发病机制及药理、药效实验研究。
