骨髓间充质干细胞(BMSC)移植是重症急性胰腺炎(SAP)治疗的研究热点。但在临床应用中, 该治疗方式却遇到了诸多技术及伦理问题。BMSC的旁分泌因子具有与细胞移植同样的疗效, 且可减少上述生物安全问题, 具有更安全、更易操控的治疗优势。本文就BMSC旁分泌因子在SAP中的治疗潜能作一综述, 注射含旁分泌因子的BMSC培养上清有望成为未来SAP细胞治疗的新策略。
引用本文： 陈珂玲, 周总光, 周斌, 李园. 骨髓间充质干细胞旁分泌因子治疗重症急性胰腺炎的潜能. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(1): 245-248. doi: 10.7507/1001-5515.20150045 复制
引言
重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是外科常见急腹症，起病骤，预后差，死亡率高，在帮助患者修复受损组织及恢复器官功能方面尚无有效措施。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC)因具有多向分化潜能、来源方便等优点，成为治疗SAP的热点。然而在临床应用中，BMSC移植治疗的方式却遇到了诸多技术及伦理问题，如患者肿瘤、血栓形成的风险加大，异质性组织的形成等。近年来，科学家发现BMSC的旁分泌因子具有与BMSC移植同样的治疗效果，且可减少上述生物安全问题，具有更安全、更易操控的治疗优势[1-2]。在此，本文将针对BMSC旁分泌因子在SAP治疗中的潜能作一综述。
1 BMSC及其旁分泌作用
1.1 BMSC
自1987年，Friedenstein等首次发现并培养出BMSC后，BMSC因具有多向分化潜能、可参与免疫调节、促进效应细胞定位及归巢等特点，迅速在包括心脏、胰腺及肾脏等在内的多种组织器官的再生中得到研究和应用，甚至在急性肺损伤、骨组织工程及脑出血等疾病中已进入临床试验阶段[3-4]。然而，随着这些基础研究的成果逐步向临床应用转化，BMSC移植的细胞治疗方式在实际操作中显现出了诸多问题：
首先，BMSC作为活细胞被移植入人体以后，其在体内的增殖数量与频率往往不可控，而细胞的增殖数量通常与脏器的功能密切相关(如心肌细胞与血管内皮细胞的过度增殖会影响心脏功能等)。
其二，BMSC进入体内后，暴露于免疫细胞及体内其他可溶性物质的作用下，在这种特定的微环境中，BMSC的生物学行为很可能会改变，不向预期的方向发展。如细胞突变后引起肿瘤的风险加大，在脏器中形成异质性组织(已发现在心肌中产生骨组织，在肾脏中形成脂肪组织)等[5-6]。
其三，当通过静脉注射方式移植BMSC时，细胞利用率低，仅不足15%的细胞能跨越微血管进入组织，且极易在微血管内形成细胞团块，引起血栓及局部组织缺血。
为解决上述问题，科学家们将研究重点从细胞本身转移至其分泌成分上，发现用BMSC细胞培养液中含有旁分泌因子的上清液进行持续性治疗，可获得与移植BMSC相同的治疗效果，且未出现上述病理变化[7-8]。
1.2 BMSC的旁分泌作用
旁分泌是指细胞通过分泌趋化因子、生长因子、激素等影响邻近的其它种类细胞的生物学行为[2]。BMSC可分泌多种旁分泌因子，包括白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor, IGF-1)、基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases, MMPs)等。这些旁分泌因子有助于调节血管内皮细胞的通透性，降低机体的炎性反应，促进组织修复及抑制细菌生长[9]。BMSC的旁分泌功能可因外界条件影响而发生改变，缺氧、营养供应不足及炎性因子的刺激等均可增强BMSC的旁分泌能力[10-11]。因此，在BMSC移植技术遇到困难时，BMSC旁分泌因子则显现出其在炎性疾病及组织修复中的临床应用潜能。
2 SAP治疗进展
急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是临床常见急腹症，大部分为自限性倾向的轻型胰腺炎，其中约有20%的患者可转化为SAP。SAP发展迅速，预后凶险，死亡率高达50%以上，通常以局部胰腺组织的坏死、脓肿及炎症的全身蔓延[如系统性炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)]为特征，并(或)伴以系统性多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是导致患者死亡的主要原因[12]。SAP发病机制多样，涉及到内毒素、微循环、炎性递质和细胞因子连锁反应等多个环节。近两百年来，关于急性胰腺炎的发生、发展机制尚未完全阐明，对急性胰腺炎病情的控制及转归方面的研究更是鲜有进展。
目前临床治疗手段通常以使用生长抑素类药物(如奥曲肽等)、激素(地塞米松，氢化可的松)并(或)联合使用中药，以抑制机体的炎性反应、清除体内毒素。但在帮助患者修复受损组织及恢复器官功能方面，仍缺乏有效措施，患者预后评估不甚理想。自20世纪80、90年代干细胞的研究兴起以来，科学家们观察到干细胞的出现是急性胰腺炎病理过程中的重要事件之一；BMSC可通过减弱炎症反应及促进组织细胞的新生，参与到急性胰腺炎病情的控制及转归中。大量研究结果显示，BMSC的注入可减轻胰腺坏死及炎性细胞浸润，降低炎症介质和细胞因子的表达水平[13-16]。研究者在SAP受损的胰腺组织及肺组织中观察到BMSC可向损伤部位定向趋化移动，并在SAP诱发的受损器官中定植[17]。然而，当科学家用Cre-LoxP系统示踪时却发现，胰腺中新生的胰岛等组织并非由这些“远道而来”的BMSC分化而来，而是来源于导管细胞或胰岛内原先即已存在的β细胞的自我复制[18-19]。既然如此，那么BMSC又为何要迁移至这些受损部位呢？除去其分化替代功能，BMSC又是通过什么样的方式来发挥其抗炎、促新生作用的呢？新的研究发现，BMSC可迁移至受损部位，通过近距离分泌一些细胞因子、调节蛋白来减轻SAP大鼠的炎症反应及相关脏器的损伤，BMSC的旁分泌功能可能在SAP治疗中起着更重要的作用[2, 20]。
3 BMSC旁分泌因子治疗SAP的作用基础
BMSC的旁分泌因子可参与SAP炎症的调控、血管内皮的修复及新生以及SAP相关的多器官损伤修复，具有治疗SAP的作用基础。
3.1 BMSC旁分泌因子的抑炎作用
炎性介质的大量释放是SAP最重要的病理特征之一。BMSC分泌的多种抑炎因子可阻断细胞炎性通路，降低核因子κ-B(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的活性，从而减轻动物模型中的炎性应答反应。如BMSC可分泌IL-10、白介素-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1RA)及可溶性的肿瘤坏死因子受体1(soluble tumor necrosis factor receptor 1, sTNFR1)等多种抑炎因子。李德全等研究显示，BMSC可分泌一些细胞因子及调节蛋白来抑制发生SAP时TOLL样受体(TOLL like receptor，TLR)2、4的激活，或阻断TLR 2、4与其下游炎症因子之间的信号通路，也可能通过拮抗终末炎症因子的生物效应间接下调TLR 2、4 mRNA表达，从而减轻患SAP大鼠的炎症反应及相关组织损伤。此外，旁分泌因子还可以通过影响T细胞及树突状细胞(dendritic cell, DC)细胞的增殖与成熟来间接调控机体的炎症反应[21-24]。
3.2 BMSC旁分泌因子促进血管新生与分化
在SAP中，大量炎性介质进入循环系统后，会导致SAP患者毛细血管通透性增高，大分子物质外渗，损伤血管内皮细胞，造成局部组织的微循环障碍。据报道，在炎性因子的刺激下，受损组织中释放的SDF-1蛋白可通过与BMSC细胞上的CXCR4受体配对，募集BMSC细胞，并促进BMSC细胞分泌大量包括VEGF、成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor，FGF-2)、角细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)等在内的生长因子，这些细胞因子在促进血管新生与分化，保护及改善组织微循环状况中起重要作用[25]。
3.3 BMSC旁分泌因子对减轻多器官损伤有效
在急性胰腺炎中，绝大多数患者死亡的原因是由其引发的多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，BMSC的旁分泌因子被证明可缓解多种SAP相关器官的损伤。如，SAP的死亡病例中有50%发生重度急性肺损伤(acute lung injury, ALI)，BMSC的旁分泌因子有助于调节血管内皮细胞及肺泡上皮细胞通透性，修复Ⅱ型肺泡上皮细胞及小导管上皮细胞的损伤[7]。Ionescu等[8]将BMSC的条件培养上清液注射入ALI小鼠模型中，发现小鼠的嗜中性粒细胞浸润，肺水肿及肺损伤程度均得以减轻，且注射BMSC培养上清的效果与直接注射BMSC的效果相当。另外，在急性肾损伤模型中发现，BMSC的修复能力可随其分泌因子的增加而增强，BMSC的培养上清可减轻由庆大霉素诱导的肾损伤[26-27]。这些研究结果均提示, BMSC并没有直接分化替代损伤组织, 而是可能通过旁分泌的众多因子促进及调节受损组织的修复。
4 问题与展望
研究结果显示，BMSC可通过分泌多种细胞因子和调节蛋白来发挥在SAP治疗中的抗炎、促新生等作用，而这些细胞因子和调节蛋白正是BMSC旁分泌因子的成员。因此，挖掘BMSC旁分泌因子在SAP临床治疗中的潜能，将研究重心转移到利用这些旁分泌因子上来，将成为SAP治疗的新方向。注射含旁分泌因子的BMSC培养上清液有望成为未来SAP细胞治疗的新策略。
然而，作为一种新兴的治疗方式，在其具体的实施过程中仍不可避免地面临一些问题。例如，BMSC在体外进行平面培养或多次传代后，其生物特性及旁分泌能力会发生改变[5, 28]，如何在体外扩大培养的过程中保持BMSC的生物学特性并增加其旁分泌功能将是后期研究需要关注的方向。对细胞进行预刺激及使用大孔径的纤维膜生物反应器有望成为该方向的突破口[29-30]。此外，在使用BMSC旁分泌因子进行治疗时给药剂量及给药途径如何确定，以及短期及长期的临床安全性如何评估等也需要进一步探索。
引言
重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是外科常见急腹症，起病骤，预后差，死亡率高，在帮助患者修复受损组织及恢复器官功能方面尚无有效措施。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC)因具有多向分化潜能、来源方便等优点，成为治疗SAP的热点。然而在临床应用中，BMSC移植治疗的方式却遇到了诸多技术及伦理问题，如患者肿瘤、血栓形成的风险加大，异质性组织的形成等。近年来，科学家发现BMSC的旁分泌因子具有与BMSC移植同样的治疗效果，且可减少上述生物安全问题，具有更安全、更易操控的治疗优势[1-2]。在此，本文将针对BMSC旁分泌因子在SAP治疗中的潜能作一综述。
1 BMSC及其旁分泌作用
1.1 BMSC
自1987年，Friedenstein等首次发现并培养出BMSC后，BMSC因具有多向分化潜能、可参与免疫调节、促进效应细胞定位及归巢等特点，迅速在包括心脏、胰腺及肾脏等在内的多种组织器官的再生中得到研究和应用，甚至在急性肺损伤、骨组织工程及脑出血等疾病中已进入临床试验阶段[3-4]。然而，随着这些基础研究的成果逐步向临床应用转化，BMSC移植的细胞治疗方式在实际操作中显现出了诸多问题：
首先，BMSC作为活细胞被移植入人体以后，其在体内的增殖数量与频率往往不可控，而细胞的增殖数量通常与脏器的功能密切相关(如心肌细胞与血管内皮细胞的过度增殖会影响心脏功能等)。
其二，BMSC进入体内后，暴露于免疫细胞及体内其他可溶性物质的作用下，在这种特定的微环境中，BMSC的生物学行为很可能会改变，不向预期的方向发展。如细胞突变后引起肿瘤的风险加大，在脏器中形成异质性组织(已发现在心肌中产生骨组织，在肾脏中形成脂肪组织)等[5-6]。
其三，当通过静脉注射方式移植BMSC时，细胞利用率低，仅不足15%的细胞能跨越微血管进入组织，且极易在微血管内形成细胞团块，引起血栓及局部组织缺血。
为解决上述问题，科学家们将研究重点从细胞本身转移至其分泌成分上，发现用BMSC细胞培养液中含有旁分泌因子的上清液进行持续性治疗，可获得与移植BMSC相同的治疗效果，且未出现上述病理变化[7-8]。
1.2 BMSC的旁分泌作用
旁分泌是指细胞通过分泌趋化因子、生长因子、激素等影响邻近的其它种类细胞的生物学行为[2]。BMSC可分泌多种旁分泌因子，包括白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor, IGF-1)、基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases, MMPs)等。这些旁分泌因子有助于调节血管内皮细胞的通透性，降低机体的炎性反应，促进组织修复及抑制细菌生长[9]。BMSC的旁分泌功能可因外界条件影响而发生改变，缺氧、营养供应不足及炎性因子的刺激等均可增强BMSC的旁分泌能力[10-11]。因此，在BMSC移植技术遇到困难时，BMSC旁分泌因子则显现出其在炎性疾病及组织修复中的临床应用潜能。
2 SAP治疗进展
急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是临床常见急腹症，大部分为自限性倾向的轻型胰腺炎，其中约有20%的患者可转化为SAP。SAP发展迅速，预后凶险，死亡率高达50%以上，通常以局部胰腺组织的坏死、脓肿及炎症的全身蔓延[如系统性炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)]为特征，并(或)伴以系统性多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是导致患者死亡的主要原因[12]。SAP发病机制多样，涉及到内毒素、微循环、炎性递质和细胞因子连锁反应等多个环节。近两百年来，关于急性胰腺炎的发生、发展机制尚未完全阐明，对急性胰腺炎病情的控制及转归方面的研究更是鲜有进展。
目前临床治疗手段通常以使用生长抑素类药物(如奥曲肽等)、激素(地塞米松，氢化可的松)并(或)联合使用中药，以抑制机体的炎性反应、清除体内毒素。但在帮助患者修复受损组织及恢复器官功能方面，仍缺乏有效措施，患者预后评估不甚理想。自20世纪80、90年代干细胞的研究兴起以来，科学家们观察到干细胞的出现是急性胰腺炎病理过程中的重要事件之一；BMSC可通过减弱炎症反应及促进组织细胞的新生，参与到急性胰腺炎病情的控制及转归中。大量研究结果显示，BMSC的注入可减轻胰腺坏死及炎性细胞浸润，降低炎症介质和细胞因子的表达水平[13-16]。研究者在SAP受损的胰腺组织及肺组织中观察到BMSC可向损伤部位定向趋化移动，并在SAP诱发的受损器官中定植[17]。然而，当科学家用Cre-LoxP系统示踪时却发现，胰腺中新生的胰岛等组织并非由这些“远道而来”的BMSC分化而来，而是来源于导管细胞或胰岛内原先即已存在的β细胞的自我复制[18-19]。既然如此，那么BMSC又为何要迁移至这些受损部位呢？除去其分化替代功能，BMSC又是通过什么样的方式来发挥其抗炎、促新生作用的呢？新的研究发现，BMSC可迁移至受损部位，通过近距离分泌一些细胞因子、调节蛋白来减轻SAP大鼠的炎症反应及相关脏器的损伤，BMSC的旁分泌功能可能在SAP治疗中起着更重要的作用[2, 20]。
3 BMSC旁分泌因子治疗SAP的作用基础
BMSC的旁分泌因子可参与SAP炎症的调控、血管内皮的修复及新生以及SAP相关的多器官损伤修复，具有治疗SAP的作用基础。
3.1 BMSC旁分泌因子的抑炎作用
炎性介质的大量释放是SAP最重要的病理特征之一。BMSC分泌的多种抑炎因子可阻断细胞炎性通路，降低核因子κ-B(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的活性，从而减轻动物模型中的炎性应答反应。如BMSC可分泌IL-10、白介素-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1RA)及可溶性的肿瘤坏死因子受体1(soluble tumor necrosis factor receptor 1, sTNFR1)等多种抑炎因子。李德全等研究显示，BMSC可分泌一些细胞因子及调节蛋白来抑制发生SAP时TOLL样受体(TOLL like receptor，TLR)2、4的激活，或阻断TLR 2、4与其下游炎症因子之间的信号通路，也可能通过拮抗终末炎症因子的生物效应间接下调TLR 2、4 mRNA表达，从而减轻患SAP大鼠的炎症反应及相关组织损伤。此外，旁分泌因子还可以通过影响T细胞及树突状细胞(dendritic cell, DC)细胞的增殖与成熟来间接调控机体的炎症反应[21-24]。
3.2 BMSC旁分泌因子促进血管新生与分化
在SAP中，大量炎性介质进入循环系统后，会导致SAP患者毛细血管通透性增高，大分子物质外渗，损伤血管内皮细胞，造成局部组织的微循环障碍。据报道，在炎性因子的刺激下，受损组织中释放的SDF-1蛋白可通过与BMSC细胞上的CXCR4受体配对，募集BMSC细胞，并促进BMSC细胞分泌大量包括VEGF、成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor，FGF-2)、角细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)等在内的生长因子，这些细胞因子在促进血管新生与分化，保护及改善组织微循环状况中起重要作用[25]。
3.3 BMSC旁分泌因子对减轻多器官损伤有效
在急性胰腺炎中，绝大多数患者死亡的原因是由其引发的多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，BMSC的旁分泌因子被证明可缓解多种SAP相关器官的损伤。如，SAP的死亡病例中有50%发生重度急性肺损伤(acute lung injury, ALI)，BMSC的旁分泌因子有助于调节血管内皮细胞及肺泡上皮细胞通透性，修复Ⅱ型肺泡上皮细胞及小导管上皮细胞的损伤[7]。Ionescu等[8]将BMSC的条件培养上清液注射入ALI小鼠模型中，发现小鼠的嗜中性粒细胞浸润，肺水肿及肺损伤程度均得以减轻，且注射BMSC培养上清的效果与直接注射BMSC的效果相当。另外，在急性肾损伤模型中发现，BMSC的修复能力可随其分泌因子的增加而增强，BMSC的培养上清可减轻由庆大霉素诱导的肾损伤[26-27]。这些研究结果均提示, BMSC并没有直接分化替代损伤组织, 而是可能通过旁分泌的众多因子促进及调节受损组织的修复。
4 问题与展望
研究结果显示，BMSC可通过分泌多种细胞因子和调节蛋白来发挥在SAP治疗中的抗炎、促新生等作用，而这些细胞因子和调节蛋白正是BMSC旁分泌因子的成员。因此，挖掘BMSC旁分泌因子在SAP临床治疗中的潜能，将研究重心转移到利用这些旁分泌因子上来，将成为SAP治疗的新方向。注射含旁分泌因子的BMSC培养上清液有望成为未来SAP细胞治疗的新策略。
然而，作为一种新兴的治疗方式，在其具体的实施过程中仍不可避免地面临一些问题。例如，BMSC在体外进行平面培养或多次传代后，其生物特性及旁分泌能力会发生改变[5, 28]，如何在体外扩大培养的过程中保持BMSC的生物学特性并增加其旁分泌功能将是后期研究需要关注的方向。对细胞进行预刺激及使用大孔径的纤维膜生物反应器有望成为该方向的突破口[29-30]。此外，在使用BMSC旁分泌因子进行治疗时给药剂量及给药途径如何确定，以及短期及长期的临床安全性如何评估等也需要进一步探索。