为探讨奇异变形杆菌(PM)螺纹迁徙生长现象产生的原因。通过对细菌波动培养的接种时间、湿度、接种手法、培养时平板放置、外加磁场和酸碱度等因素的改变, 观察PM螺纹迁徙生长现象。结果显示在密封罐里进行波动培养的平板中出现螺纹迁徙生长现象的频率较高, 不论什么时候接种、接种手法如何、磁场的有无、培养时平板放置的方式如何, 细菌在迁徙生长过程都能表现出螺旋迁徙生长现象, 而且细菌的螺旋环旋转的方向都是逆时针。实验结果证明, PM螺纹迁徙生长需要特定的酸碱度环境, 它的螺纹迁徙生长现象产生可能与其遗传特性和地球的自转有关。
引用本文： 何先元, 廖巳祥, 刘俊康, 李坤, 刘艳霞, 喻录容. 奇异变形杆菌螺纹迁徙生长现象研究. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(1): 131-136. doi: 10.7507/1001-5515.20150024 复制
引言
奇异变形杆菌(Proteus mirabilis， PM)，在湿润的固体琼脂平板上常呈扩散生长，如接种于平板中心部位，培养24 h后形成以接种部位为中心的厚薄交替的波纹状菌苔，称为迁徙生长现象。第三军医大学生物波研究中心研究变形杆菌形态变化和迁徙状生长的联系，最早提出了生物波理论，提出并证实生物波的本质是群体细胞节律性自组织生命活动的过程[1-12]。在研究群体细胞波状生长过程中，观察到群体细菌细胞以子组织方式进行节律性同步生长，形成宏观有序的细胞群体结构。在将PM菌种接种到LB平板中心，PM便会向四周生长扩散开来，起初先长出中心菌落斑，随后便会产生红环和黄环相间的细菌波动环，将这种生命活动的有序形式称为生物波。偶然一次将PM菌种点种到LB平板上，放入电热恒温箱中培养，结果发现有些平板中的第一红环变粗而且产生红黄相间的螺旋状环纹，从整体上来看像是湍流中的漩涡，类似一幅星云图，将这种区别于以前的迁徙生长现象的现象称之为螺纹迁徙生长现象。将螺纹迁徙生长平板与波纹迁徙生长平板进行比较(见图 1)，可发现螺纹迁徙生长平板中有螺旋生长现象，中心菌落斑相对较大，红环数在三左右且较粗，而其中的第一红环因有螺旋生长的影响，所以比其它环都要粗。而波动环纹没有螺旋生长这一现象，中心菌落斑相对较小，红环数在五左右且较细，粗细均匀。本研究主要针对最新发现的奇异变形杆菌螺纹迁徙生长现象进行探讨。
图1
PM不同波纹迁徙生长现象
Figure1.
Different wave swarming growth phenomenon of PM
1 材料与方法
1.1 菌种
PM菌株为第三军医大学生物波研究室分离保存。
1.2 仪器及试剂
手提式不锈钢蒸汽消毒器(上海三申医疗器械有限公司)，HH.Bll.500-BS电热恒温培养箱(上海跃进医疗机械厂)，LH实验室专用超纯水机(重庆浪华实验仪器设备有限公司)，KH-100 TDB型高频数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，密封罐(第三军医大学生物波研究室专利产品)。2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(国药集团化学试剂有限公司)；丁二酸钠(琥珀酸钠)(中国医药(集团)上海化学试剂公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 指示反应
利用PM新陈代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶使无色的TTC还原为红色的1，3，5-三苯甲臜(TPF)作为指示剂，使细菌菌落显红色，从而便于观察和计数。
1.3.2 LB培养基
每100 mL中含：酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1.0 g、氯化钠1.0 g、葡萄糖0.1 g；TTC 0.05 g，琼脂1.5 g，pH值7.2~7.4，随后制成LB平板。
1.3.3 PM波动迁徙培养方法
LB平板中心点种PM，置于密封罐中培养。培养条件：相对湿度40%，温度变化范围31~39℃，持续时间1 h，通气量5 L/min。
2 结果与分析
2.1 湿度对螺纹迁徙生长影响
取6块LB平板，在干燥恒温培养箱38℃下分别烘烤0、10、20、30、40、50 min，然后用相同的方法以同一菌株同时接种后放入密封罐培养。结果如图 2所示，LB平板烘烤0~20 min时，基本不能出现波动生长现象，30~40 min能够形成稳定的环纹波动生长现象，烘烤50 min以上，细菌波动生长现象又不明显了。所以LB平板需要在38℃下烘烤40 min左右，才容易看到细菌波动生长。但是基本没有形成螺纹迁徙生长现象。
图2
湿度对奇异变形杆菌螺纹迁徙生长现象的影响
Figure2.
Effect of humidity on whorl swarming growth phenomenon of PM
2.2 酸碱度对螺纹迁徙生长的影响
取pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB平板，以相同的手法接种同一PM菌种，置于同一密封罐中，放入电热恒温培养箱里培养，18 h后观察结果，如图 3所示。pH7.0~8.0的LB平板出现了螺纹迁徙生长现象，pH6.0以下生长较差，pH6.0出现宽环的波动生长，pH8.5螺纹迁徙生长现象减弱，pH9.0仅出现宽环的波动生长现象。
图3
酸碱度对PM螺纹迁徙生长现象的影响
Figure3.
Effect of pH for whorl swarming growth phenomenon of PM
2.3 气体环境对螺纹迁徙生长的影响
取12块LB平板，随机分成4组，每组3个，用相同的方法接种同一株PM菌，分别放入4个密封罐中。第1组不做任何处理；第2组全部充入氮气；第3组全部充入二氧化碳；第4组充入20％二氧化碳、60%氮气、20%氢气并放入活化后的钯粒(可催化氢气与氧气生成水)。将密封罐放进电热恒温箱中培养，18 h后观察结果。如图 4所示，第1组出现了螺纹迁徙生长现象，第2组出现显色比较浅的波动生长现象，第3组和第4组生长不明显。
图4
气体环境对螺纹迁徙生长的影响
Figure4.
Effect of gas atmospheres for whorl swarming growth phenomenon of PM
2.4 接种时间对螺纹迁徙生长的影响
取9块LB平板，随机分成3组，每组3个，用相同的方法以同一菌株分别在9 :30、13 :30和18 :30接种培养，结果如图 5所示，均有螺纹迁徙生长现象的出现。说明接种时间与波动螺纹的出现无关。
图5
接种时间对螺纹迁徙生长的影响
Figure5.
Effect of inoculation time on whorl swarming growth phenomenon of PM
2.5 接种手法对螺纹迁徙生长的影响
选取6块LB平板，随机分成2组，每组3个。一组顺时针接种，另一组逆时针接种，所用菌种都来自于同一菌株，在密封罐中培养，结果如图 6所示，LB平板中都出现了螺纹迁徙生长现象，且方向一致。说明螺纹状生长现象与接种手法无关。
图6
接种手法对螺纹迁徙生长的影响
Figure6.
Effect of inoculation technique for whorl swarming growth phenomenon of PM
2.6 磁场对螺纹迁徙生长的影响
选取6块LB平板，随机分成2组，每组3个，以相同的方法接种同一株菌。一组同磁铁一起放入密封罐中培养，另一组直接放入密封罐中培养。检验磁场对奇异变形杆菌螺纹迁徙生长的影响，结果如图 7所示都出现了螺纹，且螺旋方向一致。说明磁场对螺纹迁徙生长的没有影响。
图7
磁场对螺纹迁徙生长的影响
Figure7.
Effect of magnetic field on whorl swarming growth phenomenon of PM
2.7 位置对螺纹迁徙生长的影响
选取9块LB平板，随机分成3组，每组3个，以相同的方法接种同一株PM菌。第1组培养皿底部向下，第2组培养皿底部向上，第3组培养皿竖直放入同一密封罐中培养。检验培养皿放置方式不同对奇异变形杆菌螺纹迁徙生长的影响，结果如图 8所示，平板中都出现了波动螺纹，且方向一致。说明培养皿放置方式不影响螺纹迁徙生长现象的出现。
图8
培养皿放置方式对螺纹迁徙生长的影响
Figure8.
Effect of dish position on whorl swarming growth phenomenon of PM
3 结论与讨论
通过一系列的研究，最新发现的螺纹迁徙生长现象，酸碱度是其产生的关键因素，其他适应PM生长的因素如湿度、接种手法、接种时间、气体环境、磁场、培养皿放置方式等对螺纹迁徙生长现象基本没有影响。湿度只是影响波动生长的重要因素，如果湿度过大，整个培养基表面都会长满菌落；如果湿度过小，波动就无法形成，而且波动环也会变得越来越细，甚至连细菌都难以生长；同时也发现在纯二氧化碳条件下PM无法生长；在纯氮气条件下PM虽能生长，但生长情况远不及在适度有氧条件下的好，也仅只能形成波动环纹，所以波动环纹生长是螺纹迁徙生长的基础；螺纹的旋转方向与外加磁场和接种的手法无关；在培养过程中，将LB平板正放和倒置培养，其波动螺纹的旋转方向都一致，这一现象与自然界中的某些滕蔓植物的生长特性类似，牵牛花藤在旋转时，一律按逆时针方向盘旋而上，如果人为地将其缠成右旋，后生出来的新藤仍就恢复其左旋特性。一般认为，植物的茎蔓的左右旋转生长的现象是由于南北半球的地球引力和磁力线的共同作用，同时也是植物的遗传特性。
PM与临床关系较密切，在肠道中与其他菌组成了继发性感染的条件致病菌，同时也可以作为感染的检测指标。PM螺旋迁徙生长现象的发现，对于探索其在肠道微生态环境中的生长规律具有重要的意义，螺纹迁徙生长是其固有的遗传特征，还是一个新变种，对于检测和治疗细菌感染都具有积极作用，同时对从微观世界探讨生物螺旋生长的机理提供了新的科学依据和研究思路。
引言
奇异变形杆菌(Proteus mirabilis， PM)，在湿润的固体琼脂平板上常呈扩散生长，如接种于平板中心部位，培养24 h后形成以接种部位为中心的厚薄交替的波纹状菌苔，称为迁徙生长现象。第三军医大学生物波研究中心研究变形杆菌形态变化和迁徙状生长的联系，最早提出了生物波理论，提出并证实生物波的本质是群体细胞节律性自组织生命活动的过程[1-12]。在研究群体细胞波状生长过程中，观察到群体细菌细胞以子组织方式进行节律性同步生长，形成宏观有序的细胞群体结构。在将PM菌种接种到LB平板中心，PM便会向四周生长扩散开来，起初先长出中心菌落斑，随后便会产生红环和黄环相间的细菌波动环，将这种生命活动的有序形式称为生物波。偶然一次将PM菌种点种到LB平板上，放入电热恒温箱中培养，结果发现有些平板中的第一红环变粗而且产生红黄相间的螺旋状环纹，从整体上来看像是湍流中的漩涡，类似一幅星云图，将这种区别于以前的迁徙生长现象的现象称之为螺纹迁徙生长现象。将螺纹迁徙生长平板与波纹迁徙生长平板进行比较(见图 1)，可发现螺纹迁徙生长平板中有螺旋生长现象，中心菌落斑相对较大，红环数在三左右且较粗，而其中的第一红环因有螺旋生长的影响，所以比其它环都要粗。而波动环纹没有螺旋生长这一现象，中心菌落斑相对较小，红环数在五左右且较细，粗细均匀。本研究主要针对最新发现的奇异变形杆菌螺纹迁徙生长现象进行探讨。
图1
PM不同波纹迁徙生长现象
Figure1.
Different wave swarming growth phenomenon of PM
1 材料与方法
1.1 菌种
PM菌株为第三军医大学生物波研究室分离保存。
1.2 仪器及试剂
手提式不锈钢蒸汽消毒器(上海三申医疗器械有限公司)，HH.Bll.500-BS电热恒温培养箱(上海跃进医疗机械厂)，LH实验室专用超纯水机(重庆浪华实验仪器设备有限公司)，KH-100 TDB型高频数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，密封罐(第三军医大学生物波研究室专利产品)。2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(国药集团化学试剂有限公司)；丁二酸钠(琥珀酸钠)(中国医药(集团)上海化学试剂公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 指示反应
利用PM新陈代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶使无色的TTC还原为红色的1，3，5-三苯甲臜(TPF)作为指示剂，使细菌菌落显红色，从而便于观察和计数。
1.3.2 LB培养基
每100 mL中含：酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1.0 g、氯化钠1.0 g、葡萄糖0.1 g；TTC 0.05 g，琼脂1.5 g，pH值7.2~7.4，随后制成LB平板。
1.3.3 PM波动迁徙培养方法
LB平板中心点种PM，置于密封罐中培养。培养条件：相对湿度40%，温度变化范围31~39℃，持续时间1 h，通气量5 L/min。
2 结果与分析
2.1 湿度对螺纹迁徙生长影响
取6块LB平板，在干燥恒温培养箱38℃下分别烘烤0、10、20、30、40、50 min，然后用相同的方法以同一菌株同时接种后放入密封罐培养。结果如图 2所示，LB平板烘烤0~20 min时，基本不能出现波动生长现象，30~40 min能够形成稳定的环纹波动生长现象，烘烤50 min以上，细菌波动生长现象又不明显了。所以LB平板需要在38℃下烘烤40 min左右，才容易看到细菌波动生长。但是基本没有形成螺纹迁徙生长现象。
图2
湿度对奇异变形杆菌螺纹迁徙生长现象的影响
Figure2.
Effect of humidity on whorl swarming growth phenomenon of PM
2.2 酸碱度对螺纹迁徙生长的影响
取pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB平板，以相同的手法接种同一PM菌种，置于同一密封罐中，放入电热恒温培养箱里培养，18 h后观察结果，如图 3所示。pH7.0~8.0的LB平板出现了螺纹迁徙生长现象，pH6.0以下生长较差，pH6.0出现宽环的波动生长，pH8.5螺纹迁徙生长现象减弱，pH9.0仅出现宽环的波动生长现象。
图3
酸碱度对PM螺纹迁徙生长现象的影响
Figure3.
Effect of pH for whorl swarming growth phenomenon of PM
2.3 气体环境对螺纹迁徙生长的影响
取12块LB平板，随机分成4组，每组3个，用相同的方法接种同一株PM菌，分别放入4个密封罐中。第1组不做任何处理；第2组全部充入氮气；第3组全部充入二氧化碳；第4组充入20％二氧化碳、60%氮气、20%氢气并放入活化后的钯粒(可催化氢气与氧气生成水)。将密封罐放进电热恒温箱中培养，18 h后观察结果。如图 4所示，第1组出现了螺纹迁徙生长现象，第2组出现显色比较浅的波动生长现象，第3组和第4组生长不明显。
图4
气体环境对螺纹迁徙生长的影响
Figure4.
Effect of gas atmospheres for whorl swarming growth phenomenon of PM
2.4 接种时间对螺纹迁徙生长的影响
取9块LB平板，随机分成3组，每组3个，用相同的方法以同一菌株分别在9 :30、13 :30和18 :30接种培养，结果如图 5所示，均有螺纹迁徙生长现象的出现。说明接种时间与波动螺纹的出现无关。
图5
接种时间对螺纹迁徙生长的影响
Figure5.
Effect of inoculation time on whorl swarming growth phenomenon of PM
2.5 接种手法对螺纹迁徙生长的影响
选取6块LB平板，随机分成2组，每组3个。一组顺时针接种，另一组逆时针接种，所用菌种都来自于同一菌株，在密封罐中培养，结果如图 6所示，LB平板中都出现了螺纹迁徙生长现象，且方向一致。说明螺纹状生长现象与接种手法无关。
图6
接种手法对螺纹迁徙生长的影响
Figure6.
Effect of inoculation technique for whorl swarming growth phenomenon of PM
2.6 磁场对螺纹迁徙生长的影响
选取6块LB平板，随机分成2组，每组3个，以相同的方法接种同一株菌。一组同磁铁一起放入密封罐中培养，另一组直接放入密封罐中培养。检验磁场对奇异变形杆菌螺纹迁徙生长的影响，结果如图 7所示都出现了螺纹，且螺旋方向一致。说明磁场对螺纹迁徙生长的没有影响。
图7
磁场对螺纹迁徙生长的影响
Figure7.
Effect of magnetic field on whorl swarming growth phenomenon of PM
2.7 位置对螺纹迁徙生长的影响
选取9块LB平板，随机分成3组，每组3个，以相同的方法接种同一株PM菌。第1组培养皿底部向下，第2组培养皿底部向上，第3组培养皿竖直放入同一密封罐中培养。检验培养皿放置方式不同对奇异变形杆菌螺纹迁徙生长的影响，结果如图 8所示，平板中都出现了波动螺纹，且方向一致。说明培养皿放置方式不影响螺纹迁徙生长现象的出现。
图8
培养皿放置方式对螺纹迁徙生长的影响
Figure8.
Effect of dish position on whorl swarming growth phenomenon of PM
3 结论与讨论
通过一系列的研究，最新发现的螺纹迁徙生长现象，酸碱度是其产生的关键因素，其他适应PM生长的因素如湿度、接种手法、接种时间、气体环境、磁场、培养皿放置方式等对螺纹迁徙生长现象基本没有影响。湿度只是影响波动生长的重要因素，如果湿度过大，整个培养基表面都会长满菌落；如果湿度过小，波动就无法形成，而且波动环也会变得越来越细，甚至连细菌都难以生长；同时也发现在纯二氧化碳条件下PM无法生长；在纯氮气条件下PM虽能生长，但生长情况远不及在适度有氧条件下的好，也仅只能形成波动环纹，所以波动环纹生长是螺纹迁徙生长的基础；螺纹的旋转方向与外加磁场和接种的手法无关；在培养过程中，将LB平板正放和倒置培养，其波动螺纹的旋转方向都一致，这一现象与自然界中的某些滕蔓植物的生长特性类似，牵牛花藤在旋转时，一律按逆时针方向盘旋而上，如果人为地将其缠成右旋，后生出来的新藤仍就恢复其左旋特性。一般认为，植物的茎蔓的左右旋转生长的现象是由于南北半球的地球引力和磁力线的共同作用，同时也是植物的遗传特性。
PM与临床关系较密切，在肠道中与其他菌组成了继发性感染的条件致病菌，同时也可以作为感染的检测指标。PM螺旋迁徙生长现象的发现，对于探索其在肠道微生态环境中的生长规律具有重要的意义，螺纹迁徙生长是其固有的遗传特征，还是一个新变种，对于检测和治疗细菌感染都具有积极作用，同时对从微观世界探讨生物螺旋生长的机理提供了新的科学依据和研究思路。
