人淋巴细胞功能相关抗原3(hLFA3)是一种重要的T细胞黏附分子, 其与CD2结合后可促进T细胞活化。恒河猴被广泛用作人类免疫疾病动物模型。因免疫系统存在严格的种属特异性, 有必要研究恒河猴LFA3的功能。本文通过PCR扩增获得mmLFA3Sh基因, 将其与人IgG1 Fc片段融合, 插入毕赤酵母表达载体构建表达质粒pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig。诱导表达后获得融合蛋白mmLFA3Sh-Ig, 产量为3~4 mg/L。mmLFA3Sh-Ig能够特异性与CD2阳性细胞结合, 能够抑制Con A和同种抗原刺激的猴和人淋巴细胞增殖。这些实验结果表明, mmLFA3Sh-Ig可能作为一种新的生物制剂用于研究恒河猴免疫疾病发病机制和实验治疗。
引用本文： 朱健, 朱升云, 杨浩, 卢晓风, 万琳. 恒河猴LFA3胞外段CD2结合域在毕赤酵母中的重组表达及活性分析. 生物医学工程学杂志, 2015, 32(1): 120-125. doi: 10.7507/1001-5515.20150022 复制
引言
人淋巴细胞功能相关抗原3(human lymphocyte function-associated antigen 3, hLFA3)是T细胞黏附分子的一种，属于免疫球蛋白超家族成员。它广泛表达于血细胞、内皮细胞、上皮细胞和结缔组织细胞[1-3]。其中，表达在抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC)上的LFA3能够与T细胞表面糖蛋白CD2(cluster of differentiation 2, CD2)特异性结合，增强T细胞和APC之间的黏附[4]。此外，hLFA3-CD2的结合还能传递共刺激信号，调控T细胞、自然杀伤细胞、APC。这些事实表明hLFA3-CD2通路在免疫应答中具有重要调控作用[5-7]，因此hLFA3-CD2共刺激通路的干预手段有可能成为免疫抑制治疗新方法[8-9]。
鉴于LFA3在免疫应答中的重要性，已经预测和鉴定了很多动物LFA3的编码基因。国际上主要对人、小鼠、羊、猪的LFA3功能蛋白进行了深入研究[4, 10-12]，但国内研究仅涉及人、绵羊和猪LFA3[13-15]，目前尚未见有关恒河猴LFA3(Macaca mulatta LFA3, mmLFA3)基因克隆和蛋白功能方面的报道。恒河猴已被广泛用作人类免疫疾病模型[16]，由于其免疫系统具有高度的种属特异性[17]，所以极有必要对mmLFA3的结构和功能展开深入研究。
已有研究发现，hLFA3由胞外段、跨膜区和胞内段组成[18]。其中，胞外段包含CD2结合域，介导hLFA3与CD2结合。前期研究中，通过序列对比，我们发现mmLFA3胞外段1-92氨基酸与hLFA3的CD2结合域高度同源，同源性达到85%。这一信息提示，该结构可能是mmLFA3的CD2结合域，可能具有CD2结合功能，而其重组表达产物也可能通过干预mmLFA3-CD2共刺激信号通路而显示免疫抑制活性。因此，本研究首先扩增了推测的mmLFA3胞外段CD2结合域(mmLFA3Sh)基因，然后将其与人IgG1 Fc片段融合，构建了表达质粒pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig；在摸索了融合蛋白毕赤酵母诱导表达及分离纯化条件后，又进一步比较了融合蛋白对CD2阳性和阴性细胞的结合能力，测试了融合蛋白对刀豆球蛋白(concanavalin A, Con A)和同种抗原刺激的淋巴细胞增殖抑制作用。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌TOP10，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115均为本实验室保种；pPIC9K载体购自Invitrogen公司；人外周血白血病T细胞(Jurkat)和B细胞淋巴瘤细胞(Raji)购自美国American Type Culture Collection(ATCC)细胞库。
1.2 实验动物
恒河猴来源于四川大学动物实验中心，恒河猴的饲养和处理都符合伦理学要求。
1.3 方法
1.3.1 pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表达质粒的构建
利用特异性引物(上游：5′-TAGC
1.3.2 mmLFA3Sh-Ig表达菌的筛选
提取抗性克隆中pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表达质粒，用SacⅠ限制性内切酶进行线性化。回收酶切产物，电转化酵母感受态细胞GS115后(电压1.5 kV，电阻200Ω，电容25μF)，涂布于组氨酸缺陷型(minimal dextrose，MD)固体培养基上培养(28℃，40~48 h)。待克隆长出后，挑取单克隆，接种于5 mL Yeast Peptone Dextrose(YPD)培养基中培养(28℃，260 r/min，40~48 h)。
提取不同克隆的DNA，并以此为模板，用引物(上游：5′-TACTATTGCCGCATTGCTGC-3′；下游：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)PCR扩增mmLFA3Sh-Ig基因(94℃变性5 min，94℃解链30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环)，以鉴定mmLFA3Sh基因是否插入成功。将筛选出的阳性克隆分别接种于100 mL BMGY(buffered glycerol-complex medium: 1% yeast extract，2% peptone，pH6.0的100 mmol/L磷酸钾缓冲液，1.34% YNB，4×10-5%生物素，1%甘油)中28℃，280 r/min培养至酵母菌液A600nm=2~6。随后将酵母菌液16 000 g离心10 min，用10 mL BMMY(buffered methanol-complex medium: 1% yeast extract，2% peptone，pH6.0的100 mmol/L磷酸钾缓冲液，1.34% YNB，4×10-5%生物素，3%甲醇)重悬。将BMMY重悬后的菌液28℃，280 r/min诱导培养72 h，期间每天补加甲醇。
诱导完毕取菌液上清进行Western blot检测。取上清15μL，用含有2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol，2-ME)与等体积上样缓冲液混合，沸水浴5~10 min后经SDS-PAGE(Sodium dodecyl(lauryl)sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)电泳分离。分离胶浓度为12.75%，浓缩胶浓度为4%。先用80 V电压使蛋白进入分离胶，再将电压调至120 V电泳至溴酚蓝达到分离胶底部。电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移(100 V，1 h)至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜。转移缓冲液为25 mmol/L Tris，192 mmol/L glycine，15%甲醇。转膜结束后，PVDF膜用含有5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH7.2)37℃封闭1 h。然后用一抗(1 :1 000稀释于含2.5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液中)4℃孵育过夜。用含有0.05% Tween 20的磷酸盐缓冲液洗涤6次后与二抗(1 :2000稀释于含2.5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液)孵育1 h。将膜洗涤6次后用化学发光底物显色，用凝胶成像仪采集图像。
1.3.3 mmLFA3Sh-Ig的分离纯化
选择表达量高的菌株大量生产蛋白。将菌株接种于1000 mL BMGY培养基中，28℃，280 r/min培养至A600nm=2~6，然后收集菌体悬浮于100 mL BMMY培养基(含3%甲醇)中诱导72 h。4℃离心(16 000 g，15 min)收集上清，并以磷酸缓冲液(20 mmol/L，pH7.2，150 mmol/L NaCl)于4℃透析过夜。用磷酸盐缓冲液平衡Protein A-CL-Sepharose亲和层析柱，待电导、A280nm、pH值稳定后上样，流速为3 mL/min。进样完毕，用磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH7.2，300 mmol/L NaCl)将杂蛋白洗去，再用Glycine-HCl(0.1 mol/L，pH3.6)进行洗脱，按500μL/管收集。为避免酸性环境下蛋白失活，在收集管中预先加入50μL Tris-HCl(1 mol/L，pH8.0)。纯化后的蛋白用细胞培养专用PBS(137 mmol/L NaCl，2.68 mmol/L KCl，8.1 mmol/L Na2HPO4，1.47 mmol/L KH2PO4)4℃透析过夜。取10μL样品分别用含和不含2-ME的上样缓冲液处理后进行SDS-PAGE电泳。凝胶浓度和电压条件同1.3.2。电泳结束，凝胶用考马斯亮蓝染色显示蛋白条带，并用凝胶成像仪采集图像。其余样品过滤灭菌分装并贮存于-80℃备用。
1.3.4 mmLFA3Sh-Ig的FITC标记
mmLFA3Sh-Ig蛋白用1 mol/L Na2CO3调节至pH8.5左右。然后将其与溶于二甲基甲酰胺的FITC(fluorescein isothiocyanate，10 mg/mL)按物质的量之比1 :24混合，室温避光反应1 h。反应结束后用PBS于4℃透析去除游离FITC，直至透析外液A495nm＜0.001。透析后的蛋白分装于-80℃贮存。
1.3.5 mmLFA3Sh-Ig与细胞结合
FITC标记的anti-CD2抗体购自BD公司，Jurkat，Raji细胞按照ATCC官网上描述的条件进行培养。Jurkat和Raji细胞均用含有0.5%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的PBS洗涤两次。细胞计数后，每2×105个细胞用100μL含有0.5% FBS的PBS重悬。向两种细胞中加入FITC标记的anti-CD2抗体或mmLFA3Sh-Ig，37℃结合1 h。细胞再用含0.5% FBS的PBS洗涤2次(600 g，3 min)，以羊抗鼠IgG抗体作为对照，用流式细胞分析仪检测。
1.3.6 BrdU检测mmLFA3Sh-Ig对淋巴细胞增殖的抑制效果
Con A可刺激淋巴细胞增殖，是最常用的淋巴细胞增殖抑制测试体系。混合淋巴细胞反应(Mixed Lymphocyte Reaction, MLR)体系能模拟移植排斥，是常规免疫抑制体外测试模型。本文用Con A和MLR两种体系测试mmLFA3Sh-Ig的生物活性。抽取恒河猴和人血液，用Ficoll液分离获取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcells, PBMCs)。在Con A体系中，取2.5×105个细胞接种于96孔板，然后用Con A(5μg/mL)刺激培养。在0 d时加入不同浓度(0、2.5、5、10、20、40或80μg/mL)的mmLFA3Sh-Ig，3 d后用BrdU检测其对淋巴细胞增殖的抑制效果。在MLR体系中，以5×105个淋巴细胞作为效应细胞，用同样数目的同种异体淋巴细胞[经50μg/mL丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)，37℃处理30 min]作为刺激细胞。效应细胞与刺激细胞悬浮于200μL培养基中，96孔板中共培养。0 d时加入不同浓度(0、2.5、5、10、20、40或80μg/mL)mmLFA3Sh-Ig，5 d后用BrdU检测其对淋巴细胞增殖的抑制效果。BrdU掺入时间为2~24 h，以蛋白浓度为0μg/mL(加入等体积PBS)的孔中细胞Brdu摄取量为100%。所有操作按照试剂盒说明书进行，重复三次。
2 结果
2.1 pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig重组表达质粒的构建
以优化过后的mmLFA3基因为模板，PCR扩增获得的片段位于250~500 bp[图 1(a)]，与预期分子量大小相符。经DNA测序验证，基因片段大小为306 bp，序列与mmLFA3Sh序列一致。将经过EcoRⅠ和AvrⅡ双酶切后的mmLFA3Sh片段与pPIC9K-Fc质粒载体连接。获得的质粒再经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，电泳显示酶切产物大于1 000 bp[图 1(b)，泳道2]。进一步测序确定该片段包含mmLFA3Sh和IgG Fc基因，表明mmLFA3Sh与IgG1 Fc连接成功。该表达质粒命名为pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig，框架如图 1(c)所示。
图1
pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表达质粒构建
(a)mmLFA3Sh基因的PCR扩增；M：DNA分子量标准；1：mmLFA3Sh基因扩增产物; (b)质粒酶切鉴定；M：DNA分子量标准；1：pPIC9K-mmLFA3FL-Ig对照质粒；2：pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表达质粒；(c) pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表达质粒结构示意图
Figure1. Construction of pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig expression plasmid(a) PCR amplification of mmLFA3Sh gene; M: DNA marker; 1: PCR product of mmLFA3Sh; (b) digestion of pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig plasmid with
2.2 pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig阳性克隆筛选及表达纯化
随机挑取7个克隆用PCR扩增检查mmLFA3Sh-Ig基因整合情况。电泳显示从6个克隆中扩增出基因片段[图 2(a)]。DNA测序确定该片段大小为1 100 bp，是mmLFA3Sh-Ig编码基因。进一步对这6个阳性克隆菌株目的蛋白表达进行检测。Western blot分析发现，所有菌株发酵液中均显示出与目的蛋白大小(35 kD)相近的蛋白条带，提示mmLFA3Sh-Ig在这些菌株中可以获得表达。相同条件下，6号菌株目的蛋白表达量最高[图 2(b)]。
图2
mmLFA3Sh-Ig阳性克隆筛选和纯化蛋白电泳
(a)PCR鉴定mmLFA3Sh-Ig基因在不同克隆(1~7)的插入；(b)Western blot分析检测阳性克隆中mmLFA3Sh-Ig蛋白的表达；(c)纯化后mmLFA3Sh-Ig的SDS-PAGE电泳；M:蛋白质分子量标准；1:样品含2-ME；2：样品不含2-ME
Figure2. Screening of mmLFA3Sh-Ig-productive colonies and SDS-PAGE of purified mmLFA3Sh-Ig(a) PCR amplification of mmLFA3Sh-Ig in different colonies(1~7); (b) Western blot assays for mmLFA3Sh-Ig expression in PCR-identified colonies; (c) SDS-PAGE of purified mmLFA3Sh-Ig in the presence (+) or absence (-) of 2-ME
利用6号菌株进行蛋白的大量表达和纯化。纯化后的mmLFA3Sh-Ig与含和不含2-巯基乙醇(2-ME)的上样缓冲液混合后电泳。结果如图 2(c)所示，mmLFA3Sh-Ig在有2-ME条件下显示为单带，分子量大约为35 kD。在无2-ME条件下，mmLFA3Sh-Ig显示为两条带，分子量相当于单体和二聚体。IgG1 Fc段有通过分子间二硫键形成二聚体的能力。因此，电泳结果提示部分mmLFA3Sh-Ig可能在分子内Fc段的作用下形成二聚体。分离纯化结果表明，从1 L诱导培养基中能获得3~4 mg纯度为80%左右的mmLFA3Sh-Ig蛋白。
2.3 mmLFA3Sh-Ig与细胞的结合
流式细胞仪检测发现，Anti-CD2抗体与Jurkat，Raji细胞孵育后，阳性率分别是99.7%和2%，验证了Jurkat是CD2阳性细胞，而Raji是CD2阴性细胞[图 3(a)]。mmLFA3Sh-Ig蛋白与Jurkat和Raji细胞孵育后，阳性率分别为66.7%和5% [图 3(b)]，结果显示mmLFA3Sh-Ig能够与CD2阳性细胞Jurkat结合，不与CD2阴性细胞Raji结合。
图3
蛋白与细胞的结合
(a)anti-CD2和细胞的结合；(b)mmLFA3Sh-Ig和细胞的结合
Figure3. Binding of proteins to Jurkat and Raji cells(a) the binding of anti-CD2 to Jurkat and Raji cells; (b) the binding of mmLFA3Sh-Ig to Jurkat and Raji cells
2.4 mmLFA3Sh-Ig对淋巴细胞增殖的抑制
如图 4所示，在Con A刺激的淋巴细胞增殖系统中，随着mmLFA3Sh-Ig蛋白浓度的增加，淋巴细胞的增殖越来越少，这表明mmLFA3Sh-Ig具有剂量依赖的淋巴细胞增殖抑制活性。当蛋白浓度从2.5μg/mL提高到80μg/mL时，抑制率从14%提高到56%。在MLR体系中，mmLFA3Sh-Ig同样显示了对人和猴淋巴细胞增殖的剂量依赖性抑制作用。而且，当蛋白浓度为80μg/mL时，mmLFA3Sh-Ig对恒河猴淋巴细胞增殖的抑制率达到了75%，而对人淋巴细胞增殖的抑制率为55%，两者有明显差异，提示LFA3有一定的种属特异性。但是，mmLFA3Sh-Ig对Con A刺激的人和猴淋巴细胞增殖抑制没有明显差别。这可能是由于Con A刺激淋巴细胞增殖主要依赖丝裂原受体途径而非MLR反应的抗原递呈所致。
图4
mmLFA3Sh-Ig在Con A和MLR系统中对淋巴细胞增殖的抑制作用
Figure4.
Ability of mmLFA3Sh-Ig to suppress the proliferation of lymphocytes in Con A and MLR system
3 讨论
目前，与IgG1 Fc段融合表达是多数共刺激分子功能区段的优选策略。为验证mmLFA3Sh区域的功能，本实验同样选择了将mmLFA3的CD2结合域mmLFA3Sh区域与IgG1 Fc融合[图 1(c)]。实验中，我们用毕赤酵母成功表达了mmLFA3Sh-Ig融合蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示，mmLFA3Sh-Ig在溶液中多数以二聚体形式存在[图 2(c)]，这说明与mmLFA3Sh融合的Fc段发挥了聚合作用。因为天然LFA3是以二聚体形式发挥功能的[19]，所以二聚体形式的mmLFA3Sh-Ig也能更好的模拟天然mmLFA3。
mmLFA3Sh-Ig能够与CD2阳性Jurkat细胞结合，而不与CD2阴性Raji细胞结合，提示mmLFA3Sh具有CD2结合能力。体外实验发现，mmLFA3Sh-Ig在Con A和MLR体系中均显示剂量依赖性的淋巴细胞增殖抑制作用(图 4)，提示了mmLFA3Sh-Ig可能通过干扰LFA3-CD2共刺激信号通路而显示免疫抑制。但已有研究对hLFA3胞外段CD2结合域重组蛋白(Alefacept)的研究表明，Alefacept体内条件下主要依赖Fc介导的细胞毒作用清除记忆性T细胞而显示免疫抑制[20-22]。对于酵母生产的mmLFA3Sh-Ig是否有同样的功能，还需进一步实验证明。尽管如此，mmLFA3Sh-Ig对同种抗原刺激的恒河猴淋巴细胞增殖抑制强于对人淋巴细胞的增殖抑制，不仅提示猴和人免疫系统的差别，还提示我们在恒河猴免疫疾病模型中，最好用mmLFA3来探讨LFA3-CD2共刺激信号通路介导的发病机制或进行实验免疫治疗。
引言
人淋巴细胞功能相关抗原3(human lymphocyte function-associated antigen 3, hLFA3)是T细胞黏附分子的一种，属于免疫球蛋白超家族成员。它广泛表达于血细胞、内皮细胞、上皮细胞和结缔组织细胞[1-3]。其中，表达在抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC)上的LFA3能够与T细胞表面糖蛋白CD2(cluster of differentiation 2, CD2)特异性结合，增强T细胞和APC之间的黏附[4]。此外，hLFA3-CD2的结合还能传递共刺激信号，调控T细胞、自然杀伤细胞、APC。这些事实表明hLFA3-CD2通路在免疫应答中具有重要调控作用[5-7]，因此hLFA3-CD2共刺激通路的干预手段有可能成为免疫抑制治疗新方法[8-9]。
鉴于LFA3在免疫应答中的重要性，已经预测和鉴定了很多动物LFA3的编码基因。国际上主要对人、小鼠、羊、猪的LFA3功能蛋白进行了深入研究[4, 10-12]，但国内研究仅涉及人、绵羊和猪LFA3[13-15]，目前尚未见有关恒河猴LFA3(Macaca mulatta LFA3, mmLFA3)基因克隆和蛋白功能方面的报道。恒河猴已被广泛用作人类免疫疾病模型[16]，由于其免疫系统具有高度的种属特异性[17]，所以极有必要对mmLFA3的结构和功能展开深入研究。
已有研究发现，hLFA3由胞外段、跨膜区和胞内段组成[18]。其中，胞外段包含CD2结合域，介导hLFA3与CD2结合。前期研究中，通过序列对比，我们发现mmLFA3胞外段1-92氨基酸与hLFA3的CD2结合域高度同源，同源性达到85%。这一信息提示，该结构可能是mmLFA3的CD2结合域，可能具有CD2结合功能，而其重组表达产物也可能通过干预mmLFA3-CD2共刺激信号通路而显示免疫抑制活性。因此，本研究首先扩增了推测的mmLFA3胞外段CD2结合域(mmLFA3Sh)基因，然后将其与人IgG1 Fc片段融合，构建了表达质粒pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig；在摸索了融合蛋白毕赤酵母诱导表达及分离纯化条件后，又进一步比较了融合蛋白对CD2阳性和阴性细胞的结合能力，测试了融合蛋白对刀豆球蛋白(concanavalin A, Con A)和同种抗原刺激的淋巴细胞增殖抑制作用。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌TOP10，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115均为本实验室保种；pPIC9K载体购自Invitrogen公司；人外周血白血病T细胞(Jurkat)和B细胞淋巴瘤细胞(Raji)购自美国American Type Culture Collection(ATCC)细胞库。
1.2 实验动物
恒河猴来源于四川大学动物实验中心，恒河猴的饲养和处理都符合伦理学要求。
1.3 方法
1.3.1 pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表达质粒的构建
利用特异性引物(上游：5′-TAGC
1.3.2 mmLFA3Sh-Ig表达菌的筛选
提取抗性克隆中pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表达质粒，用SacⅠ限制性内切酶进行线性化。回收酶切产物，电转化酵母感受态细胞GS115后(电压1.5 kV，电阻200Ω，电容25μF)，涂布于组氨酸缺陷型(minimal dextrose，MD)固体培养基上培养(28℃，40~48 h)。待克隆长出后，挑取单克隆，接种于5 mL Yeast Peptone Dextrose(YPD)培养基中培养(28℃，260 r/min，40~48 h)。
提取不同克隆的DNA，并以此为模板，用引物(上游：5′-TACTATTGCCGCATTGCTGC-3′；下游：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)PCR扩增mmLFA3Sh-Ig基因(94℃变性5 min，94℃解链30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环)，以鉴定mmLFA3Sh基因是否插入成功。将筛选出的阳性克隆分别接种于100 mL BMGY(buffered glycerol-complex medium: 1% yeast extract，2% peptone，pH6.0的100 mmol/L磷酸钾缓冲液，1.34% YNB，4×10-5%生物素，1%甘油)中28℃，280 r/min培养至酵母菌液A600nm=2~6。随后将酵母菌液16 000 g离心10 min，用10 mL BMMY(buffered methanol-complex medium: 1% yeast extract，2% peptone，pH6.0的100 mmol/L磷酸钾缓冲液，1.34% YNB，4×10-5%生物素，3%甲醇)重悬。将BMMY重悬后的菌液28℃，280 r/min诱导培养72 h，期间每天补加甲醇。
诱导完毕取菌液上清进行Western blot检测。取上清15μL，用含有2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol，2-ME)与等体积上样缓冲液混合，沸水浴5~10 min后经SDS-PAGE(Sodium dodecyl(lauryl)sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)电泳分离。分离胶浓度为12.75%，浓缩胶浓度为4%。先用80 V电压使蛋白进入分离胶，再将电压调至120 V电泳至溴酚蓝达到分离胶底部。电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移(100 V，1 h)至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜。转移缓冲液为25 mmol/L Tris，192 mmol/L glycine，15%甲醇。转膜结束后，PVDF膜用含有5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH7.2)37℃封闭1 h。然后用一抗(1 :1 000稀释于含2.5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液中)4℃孵育过夜。用含有0.05% Tween 20的磷酸盐缓冲液洗涤6次后与二抗(1 :2000稀释于含2.5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液)孵育1 h。将膜洗涤6次后用化学发光底物显色，用凝胶成像仪采集图像。
1.3.3 mmLFA3Sh-Ig的分离纯化
选择表达量高的菌株大量生产蛋白。将菌株接种于1000 mL BMGY培养基中，28℃，280 r/min培养至A600nm=2~6，然后收集菌体悬浮于100 mL BMMY培养基(含3%甲醇)中诱导72 h。4℃离心(16 000 g，15 min)收集上清，并以磷酸缓冲液(20 mmol/L，pH7.2，150 mmol/L NaCl)于4℃透析过夜。用磷酸盐缓冲液平衡Protein A-CL-Sepharose亲和层析柱，待电导、A280nm、pH值稳定后上样，流速为3 mL/min。进样完毕，用磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH7.2，300 mmol/L NaCl)将杂蛋白洗去，再用Glycine-HCl(0.1 mol/L，pH3.6)进行洗脱，按500μL/管收集。为避免酸性环境下蛋白失活，在收集管中预先加入50μL Tris-HCl(1 mol/L，pH8.0)。纯化后的蛋白用细胞培养专用PBS(137 mmol/L NaCl，2.68 mmol/L KCl，8.1 mmol/L Na2HPO4，1.47 mmol/L KH2PO4)4℃透析过夜。取10μL样品分别用含和不含2-ME的上样缓冲液处理后进行SDS-PAGE电泳。凝胶浓度和电压条件同1.3.2。电泳结束，凝胶用考马斯亮蓝染色显示蛋白条带，并用凝胶成像仪采集图像。其余样品过滤灭菌分装并贮存于-80℃备用。
1.3.4 mmLFA3Sh-Ig的FITC标记
mmLFA3Sh-Ig蛋白用1 mol/L Na2CO3调节至pH8.5左右。然后将其与溶于二甲基甲酰胺的FITC(fluorescein isothiocyanate，10 mg/mL)按物质的量之比1 :24混合，室温避光反应1 h。反应结束后用PBS于4℃透析去除游离FITC，直至透析外液A495nm＜0.001。透析后的蛋白分装于-80℃贮存。
1.3.5 mmLFA3Sh-Ig与细胞结合
FITC标记的anti-CD2抗体购自BD公司，Jurkat，Raji细胞按照ATCC官网上描述的条件进行培养。Jurkat和Raji细胞均用含有0.5%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的PBS洗涤两次。细胞计数后，每2×105个细胞用100μL含有0.5% FBS的PBS重悬。向两种细胞中加入FITC标记的anti-CD2抗体或mmLFA3Sh-Ig，37℃结合1 h。细胞再用含0.5% FBS的PBS洗涤2次(600 g，3 min)，以羊抗鼠IgG抗体作为对照，用流式细胞分析仪检测。
1.3.6 BrdU检测mmLFA3Sh-Ig对淋巴细胞增殖的抑制效果
Con A可刺激淋巴细胞增殖，是最常用的淋巴细胞增殖抑制测试体系。混合淋巴细胞反应(Mixed Lymphocyte Reaction, MLR)体系能模拟移植排斥，是常规免疫抑制体外测试模型。本文用Con A和MLR两种体系测试mmLFA3Sh-Ig的生物活性。抽取恒河猴和人血液，用Ficoll液分离获取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcells, PBMCs)。在Con A体系中，取2.5×105个细胞接种于96孔板，然后用Con A(5μg/mL)刺激培养。在0 d时加入不同浓度(0、2.5、5、10、20、40或80μg/mL)的mmLFA3Sh-Ig，3 d后用BrdU检测其对淋巴细胞增殖的抑制效果。在MLR体系中，以5×105个淋巴细胞作为效应细胞，用同样数目的同种异体淋巴细胞[经50μg/mL丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)，37℃处理30 min]作为刺激细胞。效应细胞与刺激细胞悬浮于200μL培养基中，96孔板中共培养。0 d时加入不同浓度(0、2.5、5、10、20、40或80μg/mL)mmLFA3Sh-Ig，5 d后用BrdU检测其对淋巴细胞增殖的抑制效果。BrdU掺入时间为2~24 h，以蛋白浓度为0μg/mL(加入等体积PBS)的孔中细胞Brdu摄取量为100%。所有操作按照试剂盒说明书进行，重复三次。
2 结果
2.1 pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig重组表达质粒的构建
以优化过后的mmLFA3基因为模板，PCR扩增获得的片段位于250~500 bp[图 1(a)]，与预期分子量大小相符。经DNA测序验证，基因片段大小为306 bp，序列与mmLFA3Sh序列一致。将经过EcoRⅠ和AvrⅡ双酶切后的mmLFA3Sh片段与pPIC9K-Fc质粒载体连接。获得的质粒再经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，电泳显示酶切产物大于1 000 bp[图 1(b)，泳道2]。进一步测序确定该片段包含mmLFA3Sh和IgG Fc基因，表明mmLFA3Sh与IgG1 Fc连接成功。该表达质粒命名为pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig，框架如图 1(c)所示。
图1
pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表达质粒构建
(a)mmLFA3Sh基因的PCR扩增；M：DNA分子量标准；1：mmLFA3Sh基因扩增产物; (b)质粒酶切鉴定；M：DNA分子量标准；1：pPIC9K-mmLFA3FL-Ig对照质粒；2：pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表达质粒；(c) pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig表达质粒结构示意图
Figure1. Construction of pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig expression plasmid(a) PCR amplification of mmLFA3Sh gene; M: DNA marker; 1: PCR product of mmLFA3Sh; (b) digestion of pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig plasmid with
2.2 pPIC9K-mmLFA3Sh-Ig阳性克隆筛选及表达纯化
随机挑取7个克隆用PCR扩增检查mmLFA3Sh-Ig基因整合情况。电泳显示从6个克隆中扩增出基因片段[图 2(a)]。DNA测序确定该片段大小为1 100 bp，是mmLFA3Sh-Ig编码基因。进一步对这6个阳性克隆菌株目的蛋白表达进行检测。Western blot分析发现，所有菌株发酵液中均显示出与目的蛋白大小(35 kD)相近的蛋白条带，提示mmLFA3Sh-Ig在这些菌株中可以获得表达。相同条件下，6号菌株目的蛋白表达量最高[图 2(b)]。
图2
mmLFA3Sh-Ig阳性克隆筛选和纯化蛋白电泳
(a)PCR鉴定mmLFA3Sh-Ig基因在不同克隆(1~7)的插入；(b)Western blot分析检测阳性克隆中mmLFA3Sh-Ig蛋白的表达；(c)纯化后mmLFA3Sh-Ig的SDS-PAGE电泳；M:蛋白质分子量标准；1:样品含2-ME；2：样品不含2-ME
Figure2. Screening of mmLFA3Sh-Ig-productive colonies and SDS-PAGE of purified mmLFA3Sh-Ig(a) PCR amplification of mmLFA3Sh-Ig in different colonies(1~7); (b) Western blot assays for mmLFA3Sh-Ig expression in PCR-identified colonies; (c) SDS-PAGE of purified mmLFA3Sh-Ig in the presence (+) or absence (-) of 2-ME
利用6号菌株进行蛋白的大量表达和纯化。纯化后的mmLFA3Sh-Ig与含和不含2-巯基乙醇(2-ME)的上样缓冲液混合后电泳。结果如图 2(c)所示，mmLFA3Sh-Ig在有2-ME条件下显示为单带，分子量大约为35 kD。在无2-ME条件下，mmLFA3Sh-Ig显示为两条带，分子量相当于单体和二聚体。IgG1 Fc段有通过分子间二硫键形成二聚体的能力。因此，电泳结果提示部分mmLFA3Sh-Ig可能在分子内Fc段的作用下形成二聚体。分离纯化结果表明，从1 L诱导培养基中能获得3~4 mg纯度为80%左右的mmLFA3Sh-Ig蛋白。
2.3 mmLFA3Sh-Ig与细胞的结合
流式细胞仪检测发现，Anti-CD2抗体与Jurkat，Raji细胞孵育后，阳性率分别是99.7%和2%，验证了Jurkat是CD2阳性细胞，而Raji是CD2阴性细胞[图 3(a)]。mmLFA3Sh-Ig蛋白与Jurkat和Raji细胞孵育后，阳性率分别为66.7%和5% [图 3(b)]，结果显示mmLFA3Sh-Ig能够与CD2阳性细胞Jurkat结合，不与CD2阴性细胞Raji结合。
图3
蛋白与细胞的结合
(a)anti-CD2和细胞的结合；(b)mmLFA3Sh-Ig和细胞的结合
Figure3. Binding of proteins to Jurkat and Raji cells(a) the binding of anti-CD2 to Jurkat and Raji cells; (b) the binding of mmLFA3Sh-Ig to Jurkat and Raji cells
2.4 mmLFA3Sh-Ig对淋巴细胞增殖的抑制
如图 4所示，在Con A刺激的淋巴细胞增殖系统中，随着mmLFA3Sh-Ig蛋白浓度的增加，淋巴细胞的增殖越来越少，这表明mmLFA3Sh-Ig具有剂量依赖的淋巴细胞增殖抑制活性。当蛋白浓度从2.5μg/mL提高到80μg/mL时，抑制率从14%提高到56%。在MLR体系中，mmLFA3Sh-Ig同样显示了对人和猴淋巴细胞增殖的剂量依赖性抑制作用。而且，当蛋白浓度为80μg/mL时，mmLFA3Sh-Ig对恒河猴淋巴细胞增殖的抑制率达到了75%，而对人淋巴细胞增殖的抑制率为55%，两者有明显差异，提示LFA3有一定的种属特异性。但是，mmLFA3Sh-Ig对Con A刺激的人和猴淋巴细胞增殖抑制没有明显差别。这可能是由于Con A刺激淋巴细胞增殖主要依赖丝裂原受体途径而非MLR反应的抗原递呈所致。
图4
mmLFA3Sh-Ig在Con A和MLR系统中对淋巴细胞增殖的抑制作用
Figure4.
Ability of mmLFA3Sh-Ig to suppress the proliferation of lymphocytes in Con A and MLR system
3 讨论
目前，与IgG1 Fc段融合表达是多数共刺激分子功能区段的优选策略。为验证mmLFA3Sh区域的功能，本实验同样选择了将mmLFA3的CD2结合域mmLFA3Sh区域与IgG1 Fc融合[图 1(c)]。实验中，我们用毕赤酵母成功表达了mmLFA3Sh-Ig融合蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示，mmLFA3Sh-Ig在溶液中多数以二聚体形式存在[图 2(c)]，这说明与mmLFA3Sh融合的Fc段发挥了聚合作用。因为天然LFA3是以二聚体形式发挥功能的[19]，所以二聚体形式的mmLFA3Sh-Ig也能更好的模拟天然mmLFA3。
mmLFA3Sh-Ig能够与CD2阳性Jurkat细胞结合，而不与CD2阴性Raji细胞结合，提示mmLFA3Sh具有CD2结合能力。体外实验发现，mmLFA3Sh-Ig在Con A和MLR体系中均显示剂量依赖性的淋巴细胞增殖抑制作用(图 4)，提示了mmLFA3Sh-Ig可能通过干扰LFA3-CD2共刺激信号通路而显示免疫抑制。但已有研究对hLFA3胞外段CD2结合域重组蛋白(Alefacept)的研究表明，Alefacept体内条件下主要依赖Fc介导的细胞毒作用清除记忆性T细胞而显示免疫抑制[20-22]。对于酵母生产的mmLFA3Sh-Ig是否有同样的功能，还需进一步实验证明。尽管如此，mmLFA3Sh-Ig对同种抗原刺激的恒河猴淋巴细胞增殖抑制强于对人淋巴细胞的增殖抑制，不仅提示猴和人免疫系统的差别，还提示我们在恒河猴免疫疾病模型中，最好用mmLFA3来探讨LFA3-CD2共刺激信号通路介导的发病机制或进行实验免疫治疗。
