骨骼肌拥有良好的再生和损伤后修复能力,这种自我更新的能力依赖于骨骼肌卫星细胞。当肌肉损伤后,骨骼肌卫星细胞从静息状态被激活并开始增殖,进而形成肌前体细胞或成肌母细胞,最终分化成肌细胞,并与原有肌纤维融合修复损伤的肌肉。本文就骨骼肌卫星细胞自我更新的分子调节机制作一综述。
引用本文： 熊慧, 浦亚斌, 马月辉, 扈清云, 关伟军, 李向臣. 骨骼肌卫星细胞自我更新的分子调节. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(5): 1168-1171. doi: 10.7507/1001-5515.20140221 复制
引言
骨骼肌卫星细胞(skeletal satellite cell,SSC)是目前公认的一类成体干细胞，位于骨骼肌纤维膜和基底膜之间，具有较强的增殖分化能力，其体外培养及生物学特性已有大量研究，可作为肌组织工程技术的种子细胞。在骨骼肌纤维受到损伤后，SSC被激活并通过增殖分化从而修复受损肌纤维，这种自我更新的调节过程，需要一系列分子机制调节，阐明SSC自我更新的机制能够为体外培养SSC提供更多理论依据，最终应用于肌组织工程，为临床治疗肌肉退行性疾病奠定基础。本文就SSC自我更新的分子机制作一综述。
1 配对盒基因和成肌蛋白的表达与SSC的功能维持
配对盒基因 (paired box gene 7,Pax7) 属于Pax基因家族的第Ⅲ组，与中枢神经系统和骨骼肌的发育有关，是强有力的生肌性诱导物，能使多能干细胞转变为生肌性细胞，在骨骼肌的发育和再生过程中起着至关重要的作用[1]。成肌蛋白(myoblast determination protein,MyoD)属于肌原性的碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,Bhlh)的转录因子，在肌肉发育和再生中，与细胞分化还是维持肌原细胞状态相关[2]。在肌细胞的生发过程中，SSC特异性表达Pax7和MyoD，二者皆为重要的肌原性转录因子。当Pax7表达阳性、MyoD表达阴性时，SSC呈静息状态；当Pax7、MyoD同时表达阳性时，SSC呈增殖状态；而Pax7表达阴性、MyoD表达阳性时，SSC呈分化状态[3]。除增殖分化功能外，被激活的SSC还能维持自我更新，以保持肌肉的持续再生能力。Sacco等[4]发现SSC被移植入小鼠体内后既能促进其肌肉的再生，又能补充静息状态的卫星细胞龛的数量。肌原细胞的分化潜能和SSC数量随着年龄的增长而下降，肌肉的再生能力也随之减弱[5-6]。Kuang等[7-8]报道用基因敲除方法制备Pax7表达阴性的裸鼠，并检测该实验鼠体内SSC的数量，结果显示SSC数量非常少，该实验鼠伴有肌肉再生障碍，从其分离培养的SSC增殖和分化能力也相应减弱。尽管不断有新的证据阐明肌原性生发的分子机制，但是SSC如何调节自身数量和功能还有待进一步研究。
2 Pax7和MyoD与SSC自我更新模式
Tedesco等[9-11]提出，在成年哺乳动物肌肉组织中，存在一种维持卫星细胞龛功能状态的机制，即当一些SSC在细胞分裂后仍然具备自我更新能力并形成干细胞龛，从而出现不同功能的细胞群体。Kuang等[7]也认为SSC由两种群体组成：一种是肌肉卫星细胞，具备分化潜能；另一种是未分化亚群细胞，保持SSC干性潜能[7-8]。 Ono等[12]通过荧光亲脂性染料26(fluorescent lipophilic dye,Pkh26)标记SSC，将其区分为快分裂细胞和慢分裂细胞，其研究结果表明快分裂SSC提供大量分化的成肌细胞，而慢分裂SSC则提供静息态的自我更新细胞。体内移植实验表明慢分裂SSC具备干细胞潜能，在体内负责持续性的肌肉再生，并能够产生肌原性细胞子代。在此研究中，慢分裂SSC基因表达分析可为肌细胞群体中干细胞群体的区分提供一些重要的线索，有望成为在肌细胞群体中筛选干细胞的新方法，即运用流式细胞术(fluorescence activated cell sorting,FACS)，依据细胞内源性表面标记筛选SSC。该实验证明SSC不仅具备自我更新能力，维持细胞数量，还能产生肌母细胞，促使肌肉再生[13]，同时SSC的自我更新对于维持SSC静息龛位具有重要的作用。众多研究表明，Pax7和MyoD在SSC中的表达对于其自我更新和肌原性分化至关重要。在肌原性分化过程中，大多数Pax7和MyoD表达双阳性的肌母细胞分化到成肌细胞和肌小管时，都伴随着Pax7表达量的衰减，而MyoD则维持表达量，只有小部分的肌母细胞在MyoD表达减少时还依然保持Pax7的表达，并且从SSC的自我更新状态变为干细胞静息态龛位。这说明大部分SSC在细胞增殖过程中能够调节自身增殖状态和增殖方向，而且MyoD的表达下调在SSC自我更新程序中是一个重要因素。
Asakura等[14-15]证实，MyoD在非肌原细胞中表达可以将细胞编程为肌原性细胞。在其实验中，肌母细胞被注射到MyoD基因敲除鼠再生肌肉中，结果发现分离提取得到的肌母细胞数量比分离提取得到的野生型肌母细胞多。除此之外，MyoD基因敲除的肌母细胞在小鼠体内移植能够增加肌肉中的SSC数量。MyoD基因敲除的肌母细胞较野生型肌母细胞更不容易凋亡[16]，且SSC的数量仍在增长。因此，MyoD基因敲除的肌母细胞保留了干细胞特性，包括对抗凋亡以及移植后SSC的增加。总之，对于肌母细胞来说，MyoD的低表达是SSC自我更新的关键因素[17]。
3 Six1、p38α/βmapkp、mir-489-dek信号通路调控SSC自我更新
同源异形框基因(sine oculis-related homeobox 1,Six1)属于Six同源蛋白家族，在SSC的激活态和静息态均有表达，能够调节SSC自我更新进而调控骨骼肌的再生。Six1的表达能激活MyoD的表达进而促使肌母细胞分化，相反，Six1的缺失则抑制肌肉再生并使SSC数量增加。Six1表达的下调和双重特异性磷酸酶6(dual specificity phosphatase 6,Dusp6)的下调通过抑制ERK1/2信号通路诱使SSC自我更新[18-20]。Troy 等[21]认为，p38α/βmapkp通路参与调控SSC的非对称分裂。在肌母细胞增殖过程中，蛋白酶激活受体(protease activated receptor,Par)属于G蛋白耦联受体超家族成员之一，Par蛋白复合物能够激动p38α/βmapkp信号通路，使MyoD上调以及促进肌原性分化。而肌母细胞MyoD下调，p38α/βMAPKP通路受阻，则导致SSC的自我更新。Cheung等[22]研究表明肌母细胞自我更新的调节可以通过microRNA中的mir489作用实现，当mir489在静息态SSC中高表达，能够抑制原癌基因dek表达，进而使SSC保持静息状态。当静息态SSC中dek表达减少时，mir-489能够激动肌母细胞MyoD的表达。mir489下调则dek表达上调，诱使SSC转为激活态，说明mir489-dek通路对于维持SSC静息状态至关重要。综上所述，MyoD表达的下调和Pax7表达的上调能使SSC由激活态转为静息态，然而肌母细胞为何选择性地非对称分裂或对称分裂仍有待阐明。
4 Notch信号通路参与SSC自我更新
Notch信号通路由Notch受体、Notch配体DSL(包括Delta蛋白、Serrate蛋白和Lag2蛋白)、CSL[C端启动子结合蛋白(c-promoter binding protein-1,Cbf-1)、无毛基因抑制基因(suppressor of hairless，Su(H))和Lag1复合物]、DNA结合蛋白、其他的效应物和Notch的调节分子等组成。哺乳动物有4种Notch受体(Notch 1~4)和5种Notch配体(Delta-like 1、3、4,Jagged 1和Jagged 2)。Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用，Notch蛋白经过三次剪切，由胞内段(notch intracellular domain,NICD)释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合，形成Nicd/CSL转录激活复合体，从而激活Notch靶基因转录编码Hes基因和Hey基因等在内的Bhlh家族转录因子。Lai等[23]认为，Notch信号通路在SSC的相互作用和维持肌肉组织内稳态以及肌细胞再生中起着重要的作用。 Mourikis等[24-25]实验表明在成年鼠体内阻断Notch信号通路可使SSC从静息态转为快速分化状态，最终至SSC干细胞龛损耗，无法进行肌肉再生。Fukada等[26]实验证明抑制Notch信号通路的靶基因Hesr1和Hear3也会导致SSC自我更新的减少、干细胞龛的损耗以及肌肉再生机制的间接损害，所以激活SSC之间、SSC与肌纤维之间的Notch信号通路可以影响SSC的增殖和定植能力。Notch信号通路可使rbpj(recombination binding protein-J)基因突变，致使MyoD基因敲除的SSC不能位于正常位置，而位于肌纤维间隙，并不参与肌纤维的生长。Brhl等[27]阐述了Notch信号通路与SSC定植能力的相互关系，认为Notch信号通路与基质膜蛋白形成有关，还能产生细胞黏附分子，如整合素α7、胶原ⅩⅧ和多上皮因子样结构域10，说明Notch信号通路通过刺激基底层产物来影响SSC的定植。
5 低氧生理条件参与调控SSC自我更新
近期研究表明，生理条件也能调节SSC的自我更新。Liu等[28]提出低氧环境不会影响肌母细胞增殖，但可通过上调Pax7表达来促进SSC的自我更新，具体是通过低氧下调miRNA-1/miRNA-206的表达来激活Notch信号通路，进而上调Pax7的表达，参与SSC增殖调控。Majmundar等[29]研究认为低氧或Notch信号通路抑制MyoD表达，从而参与调控SSC的自我更新。
6 展望
SSC功能的维持与一系列生理作用有着错综复杂的联系。众所周知，SSC在肌肉再生方面至关重要，但是SSC选择分化为成肌细胞还是保守为干细胞的机制还存在争议。此外，还需深入研究决定成体肌肉组织中SSC数量和使干细胞龛调节呈多相性的更多SSC相关机制。进一步的研究指出，SSC被非对称的DNA模板区分形成子代来维持干细胞特性和维持肌原性细胞；甲基化的Pax7使组蛋白甲基化，在Pax7下游基因Myf5的后生调节过程中能够决定干细胞命运[30-31]，这些SSC的表观现象与DNA甲基化状态或后生记忆相关，因此需进一步研究揭示SSC调节分化、自我更新和维持干细胞状态的机制。
引言
骨骼肌卫星细胞(skeletal satellite cell,SSC)是目前公认的一类成体干细胞，位于骨骼肌纤维膜和基底膜之间，具有较强的增殖分化能力，其体外培养及生物学特性已有大量研究，可作为肌组织工程技术的种子细胞。在骨骼肌纤维受到损伤后，SSC被激活并通过增殖分化从而修复受损肌纤维，这种自我更新的调节过程，需要一系列分子机制调节，阐明SSC自我更新的机制能够为体外培养SSC提供更多理论依据，最终应用于肌组织工程，为临床治疗肌肉退行性疾病奠定基础。本文就SSC自我更新的分子机制作一综述。
1 配对盒基因和成肌蛋白的表达与SSC的功能维持
配对盒基因 (paired box gene 7,Pax7) 属于Pax基因家族的第Ⅲ组，与中枢神经系统和骨骼肌的发育有关，是强有力的生肌性诱导物，能使多能干细胞转变为生肌性细胞，在骨骼肌的发育和再生过程中起着至关重要的作用[1]。成肌蛋白(myoblast determination protein,MyoD)属于肌原性的碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,Bhlh)的转录因子，在肌肉发育和再生中，与细胞分化还是维持肌原细胞状态相关[2]。在肌细胞的生发过程中，SSC特异性表达Pax7和MyoD，二者皆为重要的肌原性转录因子。当Pax7表达阳性、MyoD表达阴性时，SSC呈静息状态；当Pax7、MyoD同时表达阳性时，SSC呈增殖状态；而Pax7表达阴性、MyoD表达阳性时，SSC呈分化状态[3]。除增殖分化功能外，被激活的SSC还能维持自我更新，以保持肌肉的持续再生能力。Sacco等[4]发现SSC被移植入小鼠体内后既能促进其肌肉的再生，又能补充静息状态的卫星细胞龛的数量。肌原细胞的分化潜能和SSC数量随着年龄的增长而下降，肌肉的再生能力也随之减弱[5-6]。Kuang等[7-8]报道用基因敲除方法制备Pax7表达阴性的裸鼠，并检测该实验鼠体内SSC的数量，结果显示SSC数量非常少，该实验鼠伴有肌肉再生障碍，从其分离培养的SSC增殖和分化能力也相应减弱。尽管不断有新的证据阐明肌原性生发的分子机制，但是SSC如何调节自身数量和功能还有待进一步研究。
2 Pax7和MyoD与SSC自我更新模式
Tedesco等[9-11]提出，在成年哺乳动物肌肉组织中，存在一种维持卫星细胞龛功能状态的机制，即当一些SSC在细胞分裂后仍然具备自我更新能力并形成干细胞龛，从而出现不同功能的细胞群体。Kuang等[7]也认为SSC由两种群体组成：一种是肌肉卫星细胞，具备分化潜能；另一种是未分化亚群细胞，保持SSC干性潜能[7-8]。 Ono等[12]通过荧光亲脂性染料26(fluorescent lipophilic dye,Pkh26)标记SSC，将其区分为快分裂细胞和慢分裂细胞，其研究结果表明快分裂SSC提供大量分化的成肌细胞，而慢分裂SSC则提供静息态的自我更新细胞。体内移植实验表明慢分裂SSC具备干细胞潜能，在体内负责持续性的肌肉再生，并能够产生肌原性细胞子代。在此研究中，慢分裂SSC基因表达分析可为肌细胞群体中干细胞群体的区分提供一些重要的线索，有望成为在肌细胞群体中筛选干细胞的新方法，即运用流式细胞术(fluorescence activated cell sorting,FACS)，依据细胞内源性表面标记筛选SSC。该实验证明SSC不仅具备自我更新能力，维持细胞数量，还能产生肌母细胞，促使肌肉再生[13]，同时SSC的自我更新对于维持SSC静息龛位具有重要的作用。众多研究表明，Pax7和MyoD在SSC中的表达对于其自我更新和肌原性分化至关重要。在肌原性分化过程中，大多数Pax7和MyoD表达双阳性的肌母细胞分化到成肌细胞和肌小管时，都伴随着Pax7表达量的衰减，而MyoD则维持表达量，只有小部分的肌母细胞在MyoD表达减少时还依然保持Pax7的表达，并且从SSC的自我更新状态变为干细胞静息态龛位。这说明大部分SSC在细胞增殖过程中能够调节自身增殖状态和增殖方向，而且MyoD的表达下调在SSC自我更新程序中是一个重要因素。
Asakura等[14-15]证实，MyoD在非肌原细胞中表达可以将细胞编程为肌原性细胞。在其实验中，肌母细胞被注射到MyoD基因敲除鼠再生肌肉中，结果发现分离提取得到的肌母细胞数量比分离提取得到的野生型肌母细胞多。除此之外，MyoD基因敲除的肌母细胞在小鼠体内移植能够增加肌肉中的SSC数量。MyoD基因敲除的肌母细胞较野生型肌母细胞更不容易凋亡[16]，且SSC的数量仍在增长。因此，MyoD基因敲除的肌母细胞保留了干细胞特性，包括对抗凋亡以及移植后SSC的增加。总之，对于肌母细胞来说，MyoD的低表达是SSC自我更新的关键因素[17]。
3 Six1、p38α/βmapkp、mir-489-dek信号通路调控SSC自我更新
同源异形框基因(sine oculis-related homeobox 1,Six1)属于Six同源蛋白家族，在SSC的激活态和静息态均有表达，能够调节SSC自我更新进而调控骨骼肌的再生。Six1的表达能激活MyoD的表达进而促使肌母细胞分化，相反，Six1的缺失则抑制肌肉再生并使SSC数量增加。Six1表达的下调和双重特异性磷酸酶6(dual specificity phosphatase 6,Dusp6)的下调通过抑制ERK1/2信号通路诱使SSC自我更新[18-20]。Troy 等[21]认为，p38α/βmapkp通路参与调控SSC的非对称分裂。在肌母细胞增殖过程中，蛋白酶激活受体(protease activated receptor,Par)属于G蛋白耦联受体超家族成员之一，Par蛋白复合物能够激动p38α/βmapkp信号通路，使MyoD上调以及促进肌原性分化。而肌母细胞MyoD下调，p38α/βMAPKP通路受阻，则导致SSC的自我更新。Cheung等[22]研究表明肌母细胞自我更新的调节可以通过microRNA中的mir489作用实现，当mir489在静息态SSC中高表达，能够抑制原癌基因dek表达，进而使SSC保持静息状态。当静息态SSC中dek表达减少时，mir-489能够激动肌母细胞MyoD的表达。mir489下调则dek表达上调，诱使SSC转为激活态，说明mir489-dek通路对于维持SSC静息状态至关重要。综上所述，MyoD表达的下调和Pax7表达的上调能使SSC由激活态转为静息态，然而肌母细胞为何选择性地非对称分裂或对称分裂仍有待阐明。
4 Notch信号通路参与SSC自我更新
Notch信号通路由Notch受体、Notch配体DSL(包括Delta蛋白、Serrate蛋白和Lag2蛋白)、CSL[C端启动子结合蛋白(c-promoter binding protein-1,Cbf-1)、无毛基因抑制基因(suppressor of hairless，Su(H))和Lag1复合物]、DNA结合蛋白、其他的效应物和Notch的调节分子等组成。哺乳动物有4种Notch受体(Notch 1~4)和5种Notch配体(Delta-like 1、3、4,Jagged 1和Jagged 2)。Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用，Notch蛋白经过三次剪切，由胞内段(notch intracellular domain,NICD)释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合，形成Nicd/CSL转录激活复合体，从而激活Notch靶基因转录编码Hes基因和Hey基因等在内的Bhlh家族转录因子。Lai等[23]认为，Notch信号通路在SSC的相互作用和维持肌肉组织内稳态以及肌细胞再生中起着重要的作用。 Mourikis等[24-25]实验表明在成年鼠体内阻断Notch信号通路可使SSC从静息态转为快速分化状态，最终至SSC干细胞龛损耗，无法进行肌肉再生。Fukada等[26]实验证明抑制Notch信号通路的靶基因Hesr1和Hear3也会导致SSC自我更新的减少、干细胞龛的损耗以及肌肉再生机制的间接损害，所以激活SSC之间、SSC与肌纤维之间的Notch信号通路可以影响SSC的增殖和定植能力。Notch信号通路可使rbpj(recombination binding protein-J)基因突变，致使MyoD基因敲除的SSC不能位于正常位置，而位于肌纤维间隙，并不参与肌纤维的生长。Brhl等[27]阐述了Notch信号通路与SSC定植能力的相互关系，认为Notch信号通路与基质膜蛋白形成有关，还能产生细胞黏附分子，如整合素α7、胶原ⅩⅧ和多上皮因子样结构域10，说明Notch信号通路通过刺激基底层产物来影响SSC的定植。
5 低氧生理条件参与调控SSC自我更新
近期研究表明，生理条件也能调节SSC的自我更新。Liu等[28]提出低氧环境不会影响肌母细胞增殖，但可通过上调Pax7表达来促进SSC的自我更新，具体是通过低氧下调miRNA-1/miRNA-206的表达来激活Notch信号通路，进而上调Pax7的表达，参与SSC增殖调控。Majmundar等[29]研究认为低氧或Notch信号通路抑制MyoD表达，从而参与调控SSC的自我更新。
6 展望
SSC功能的维持与一系列生理作用有着错综复杂的联系。众所周知，SSC在肌肉再生方面至关重要，但是SSC选择分化为成肌细胞还是保守为干细胞的机制还存在争议。此外，还需深入研究决定成体肌肉组织中SSC数量和使干细胞龛调节呈多相性的更多SSC相关机制。进一步的研究指出，SSC被非对称的DNA模板区分形成子代来维持干细胞特性和维持肌原性细胞；甲基化的Pax7使组蛋白甲基化，在Pax7下游基因Myf5的后生调节过程中能够决定干细胞命运[30-31]，这些SSC的表观现象与DNA甲基化状态或后生记忆相关，因此需进一步研究揭示SSC调节分化、自我更新和维持干细胞状态的机制。