细胞膜片技术是通过物理的方法将扩增融合的细胞从培养皿底壁分离,获得膜片状细胞结构的一种技术。与传统胰酶消化收集细胞的方法相比,运用该技术收集到的细胞保留了体外培养过程中分泌的胞外基质、建立的细胞-基质连接以及细胞间连接等结构。本文综述了细胞膜片技术在构建包括软组织(角膜、黏膜、心肌、血管、胰岛、肝组织、膀胱、皮肤)和硬组织(骨、软骨、牙根)等组织再生领域的相关应用,以期为组织工程和再生医学的发展提供新思路,并提出今后可在提高该技术的操作性及构建大块组织可行性方面进行深入研究。
引用本文： 马东洋, 任利玲, 毛天球. 细胞膜片技术在组织工程和再生医学领域的应用. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(5): 1164-1167. doi: 10.7507/1001-5515.20140220 复制
引言
近年来随着再生医学的迅速发展，基于组织工程学原理构建的工程化组织为组织器官的修复与再生开辟了新的途径。组织工程包含了种子细胞、生长因子、生物支架材料以及组织构建等要素，模拟了组织再生的过程。传统组织工程的构建方法主要是将种子细胞与外源性支架材料复合形成具有生物活性的组织替代物，尽管现已取得许多进展并有应用于临床的报道，但仍有许多缺点。首先，经体外培养扩增的种子细胞通过胰蛋白酶消化后以单细胞的形式收集，此过程中已有的细胞外基质以及细胞间连接蛋白被破坏，容易改变细胞的表型及生化成分，进而影响细胞活性和功能。其次，至今为止没有一种理想的支架材料问世，这些不够理想的支架材料的应用影响了种子细胞的附着、生长、增殖及功能行使[1]。再者，细胞与支架直接复合的方法存在细胞利用率较低、细胞接种密度和分布不均一等不足。
1993年日本学者Okano等[2]首先报道将温度敏感性聚合物应用到细胞培养上，创新地发明了细胞膜片技术，为解决上述问题带来希望。具体方法是将N-异丙基丙烯酰胺凝胶涂于普通培养皿底壁制备成温敏培养皿，37 ℃条件下培养细胞在其表面黏附生长、伸展、扩增，最后在培养皿底壁形成完整的单层细胞膜片。当温度降低至32 ℃以下时，该材料自发膨胀形成一层水化层，使本来利于黏附在疏水性表面的细胞难以继续黏附在培养皿底壁，因此以完整的膜状结构从培养皿底分离，从而收集到相应的细胞膜片。该技术避免了对细胞进行传统胰蛋白酶消化等处理，保留细胞自分泌的细胞外基质以及一些重要的细胞表面蛋白如离子通道、生长因子受体、细胞-细胞连接蛋白等[1, 3]。但该方法技术操作程序复杂并相对费时，且应用温敏聚合物，可能会影响细胞的增殖分化。Ma等[4]在普通培养皿上连续培养后通过物理刮擦的方法同样获得了骨髓基质细胞膜片，制备方法简单、省时，无需特殊材料或者设备。
1 单层软组织的构建
作为一种新型细胞释放载体，细胞膜片已成功应用于构建组织工程角膜、黏膜、心肌等多种细胞密集型软组织[1, 3, 5]。Nishida等[3]利用细胞膜片技术构建组织工程角膜并成功地为患者实施了角膜修复。他们从4例患有角膜干细胞缺乏症的患者口腔内切取小块黏膜，分离获得黏膜上皮细胞，接种到温敏凝胶培养皿中，连续培养2周后获得黏膜上皮细胞膜片，直接移植到角膜表面，术后1周患者即获得了角膜上皮细胞再生，角膜透明度恢复，视力显著提高，随访14个月未发现并发症。另外，在动物模型上取得成功后，Ohki等[6]将细胞膜片技术应用到临床，对9例食管浅表肿瘤患者实施黏膜下切除，同期经内窥镜用自体口腔黏膜上皮细胞膜片移植修复遗留的创面，有效地预防了食管狭窄，患者的生活质量显著提高。
在治疗心肌缺血等心脏病方面，细胞治疗策略已取得初步成果，但传统单细胞悬液注入病变区域后，细胞易发生吸收、扩散，难于停留在治疗部位，修复效能较低[7]。细胞膜片技术正好弥补了以上缺点。Zakharova等[8]将心肌前体细胞膜片植入大鼠模型心肌缺血区，术后发现移植膜片逐渐发育成由新生血管、未分化细胞和少量心肌细胞构成的一厚层组织，逆转了疤痕区变薄的心肌壁，心脏功能得到显著提高，同时还证实植入干细胞膜片可通过旁分泌的途径激发血管发生。Kawamura等[9]则在猪模型上证实了人皮肤成纤维细胞来源的诱导多能干细胞膜片用于治疗缺血性心肌病的可行性、安全性以及有效性。
随着再生医学的迅速发展，细胞膜片技术也为细胞移植治疗Ⅰ型糖尿病带来了希望。由于移植细胞无法长期存活并保持生物学功能，目前胰岛细胞移植的方法仅能获得短期疗效。Saito等[10]发现胰岛细胞膜片无论在体外还是在体内环境下，都能保留分泌胰岛素和胰高血糖素的功能，预示着细胞膜片技术有可能在Ⅰ型糖尿病的治疗方面发挥重要作用。此外，在膀胱、皮肤等软组织构建领域，细胞膜片技术也展现出诱人前景[6, 11]。
2 复层膜片构建三维结构的软组织
细胞膜片技术获取的单层细胞膜片也可用来构建具有三维结构的组织。Haraguchi等[12]将多层膜片重叠复合，实现了三维组织的构建。另有学者采用多次手术重叠植入单层心肌细胞膜片的方法构建出厚约1 mm、可搏动的心肌组织，膜片中保留的细胞-细胞连接对于心肌的搏动和功能恢复十分重要[7, 13]。为了比较单层和多层细胞膜片的治疗效果，Sekiya等[14]将1、3、5层心肌细胞膜片植入大鼠心肌梗死区，术后8周通过超声心动图、导管插入术、组织学等检查综合评价，结果多层膜片组的心脏射血分数及收缩末期压力容积显著改善，5层膜片移植组中心肌纤维化最少，新生血管密度最高，表明植入多层膜片可以更好地恢复心功能。
细胞膜片技术在血管构建方面也展现出良好的应用前景。Hibino等[15]将诱导的多能干细胞膜片与直径0.8 mm细管状可降解的高分子聚合物复合构建小口径组织工程化血管。Zhao等[16]应用未分化骨髓基质干细胞膜片成功构建小口径组织工程化血管，在兔颈动脉缺损模型上成功重建颈动脉，移植1月后血管仍保持通畅，并发现部分血管内壁上皮化。L’Heureux等[17]将血管平滑肌细胞膜片结构环绕在一个管状支撑体，再用人成纤维细胞膜片环绕在中膜层外作为血管外膜，孵育成熟后将支撑体取出并把内皮细胞接种到管腔内。该方法体外构建的组织工程血管具有三层结构，血管内径约3 mm，爆破强度可达到2 000 mm Hg，与人体天然血管相当，进一步用于修复犬双侧股动脉缺损，短期内观察血管通畅。
氧气和营养的充足供应以及代谢产物的顺利排出，是体外构建的大体积组织植入体内后能够成活的必要前提，因此解决血管化的问题势在必行。Sasagawa等[18]将脐静脉内皮细胞膜片以“三明治”的形式夹杂在多层成肌细胞膜片中间，体外培养发现内皮细胞层可发芽形成网状血管，植入裸鼠体内后这些预成血管与宿主体内血管自行吻合连接，形成的新生血管网有利于三维构建组织的成活，该研究结果提示借助细胞膜片技术有望实现构建组织的血管化。
3 硬组织的构建和再生
细胞膜片技术在骨、软骨、牙齿等硬组织构建领域也有诸多应用。2007年Zhou等[19]首先报道将细胞膜片技术应用于组织工程骨的构建,其方法是将具有成骨分化潜能的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)膜片包裹块状磷酸三钙/聚已酸内酯复合材料，体外培养后植入裸鼠背部皮下，发现皮质骨和松质骨形成，同时新生组织具有较高抗压强度。Ma等[20]将BMSC膜片作为骨膜样组织与磷酸三钙复合，发现细胞膜片可以作为细胞释放载体赋予无机材料生物活性。Solorio等[21]将人来源BMSC膜片与加载有转移生长因子的可降解明胶微球结合，成功构建软骨样组织。此外，Yang等[22]采用经处理的牙本质作为生物支架，与人牙滤泡细胞膜片复合，构建牙根样组织，并发现细胞膜片在牙本质引导下形成牙髓和牙周样结构。
上述研究是在体外及实验动物皮下异位完成的，尚不能代表构建组织在骨或者软骨缺损环境下具有修复功能。因此，Tsumanuma等[23]借助乙醇酸编织片做载体，将三层犬牙周膜细胞膜片三明治式重叠后移植到牙周缺损的牙根表面，周围充填多孔β-磷酸三钙，结果缺损区既有新生骨也有牙骨质，二者间还可见良好走行的胶原纤维连接。Ma等[24]在兔模型的颅骨临界缺损区植入细胞膜片和同种异体脱钙骨基质颗粒复合物，术后12周缺损区完全由新生骨修复。
这些硬组织的构建方法仍然涉及到外源性支架材料的应用。尽管已有众多材料(生物陶瓷、高分子聚合物及陶瓷聚合物复合材料等)被应用于构建组织工程骨，但目前为止仍未发现一种完全理想的材料。为避免对支架材料过分依赖，Ma等[4]将成骨分化的骨髓基质膜片折叠成长方形状的多层膜片复合物，并由一端卷起形成具有一定体积的圆构建物，静置孵育后移植到裸鼠背部皮下，结果发现8周后体内形成密度与裸鼠椎体相似的矿化物，组织学检查证实为骨组织。研究结果充分说明单纯应用成体干细胞膜片，无需支架材料也可以构建骨组织，为组织工程骨构建提供了新的策略。
综上所述，细胞膜片技术已经广泛应用于组织工程和再生医学领域。该技术也存在一些局限性亟待解决，例如：细胞膜片具有易碎性，可操作性能较低，初期的生物力学性能较差；其次，采用该技术构建大体积的组织时，所需种子细胞数量大、培养时间长且形态难以精确控制。但作为一种优良的细胞释放系统，细胞膜片技术是传统组织工程技术的有益补充，将为组织工程和再生医学的发展提供崭新思路和广阔前景。
引言
近年来随着再生医学的迅速发展，基于组织工程学原理构建的工程化组织为组织器官的修复与再生开辟了新的途径。组织工程包含了种子细胞、生长因子、生物支架材料以及组织构建等要素，模拟了组织再生的过程。传统组织工程的构建方法主要是将种子细胞与外源性支架材料复合形成具有生物活性的组织替代物，尽管现已取得许多进展并有应用于临床的报道，但仍有许多缺点。首先，经体外培养扩增的种子细胞通过胰蛋白酶消化后以单细胞的形式收集，此过程中已有的细胞外基质以及细胞间连接蛋白被破坏，容易改变细胞的表型及生化成分，进而影响细胞活性和功能。其次，至今为止没有一种理想的支架材料问世，这些不够理想的支架材料的应用影响了种子细胞的附着、生长、增殖及功能行使[1]。再者，细胞与支架直接复合的方法存在细胞利用率较低、细胞接种密度和分布不均一等不足。
1993年日本学者Okano等[2]首先报道将温度敏感性聚合物应用到细胞培养上，创新地发明了细胞膜片技术，为解决上述问题带来希望。具体方法是将N-异丙基丙烯酰胺凝胶涂于普通培养皿底壁制备成温敏培养皿，37 ℃条件下培养细胞在其表面黏附生长、伸展、扩增，最后在培养皿底壁形成完整的单层细胞膜片。当温度降低至32 ℃以下时，该材料自发膨胀形成一层水化层，使本来利于黏附在疏水性表面的细胞难以继续黏附在培养皿底壁，因此以完整的膜状结构从培养皿底分离，从而收集到相应的细胞膜片。该技术避免了对细胞进行传统胰蛋白酶消化等处理，保留细胞自分泌的细胞外基质以及一些重要的细胞表面蛋白如离子通道、生长因子受体、细胞-细胞连接蛋白等[1, 3]。但该方法技术操作程序复杂并相对费时，且应用温敏聚合物，可能会影响细胞的增殖分化。Ma等[4]在普通培养皿上连续培养后通过物理刮擦的方法同样获得了骨髓基质细胞膜片，制备方法简单、省时，无需特殊材料或者设备。
1 单层软组织的构建
作为一种新型细胞释放载体，细胞膜片已成功应用于构建组织工程角膜、黏膜、心肌等多种细胞密集型软组织[1, 3, 5]。Nishida等[3]利用细胞膜片技术构建组织工程角膜并成功地为患者实施了角膜修复。他们从4例患有角膜干细胞缺乏症的患者口腔内切取小块黏膜，分离获得黏膜上皮细胞，接种到温敏凝胶培养皿中，连续培养2周后获得黏膜上皮细胞膜片，直接移植到角膜表面，术后1周患者即获得了角膜上皮细胞再生，角膜透明度恢复，视力显著提高，随访14个月未发现并发症。另外，在动物模型上取得成功后，Ohki等[6]将细胞膜片技术应用到临床，对9例食管浅表肿瘤患者实施黏膜下切除，同期经内窥镜用自体口腔黏膜上皮细胞膜片移植修复遗留的创面，有效地预防了食管狭窄，患者的生活质量显著提高。
在治疗心肌缺血等心脏病方面，细胞治疗策略已取得初步成果，但传统单细胞悬液注入病变区域后，细胞易发生吸收、扩散，难于停留在治疗部位，修复效能较低[7]。细胞膜片技术正好弥补了以上缺点。Zakharova等[8]将心肌前体细胞膜片植入大鼠模型心肌缺血区，术后发现移植膜片逐渐发育成由新生血管、未分化细胞和少量心肌细胞构成的一厚层组织，逆转了疤痕区变薄的心肌壁，心脏功能得到显著提高，同时还证实植入干细胞膜片可通过旁分泌的途径激发血管发生。Kawamura等[9]则在猪模型上证实了人皮肤成纤维细胞来源的诱导多能干细胞膜片用于治疗缺血性心肌病的可行性、安全性以及有效性。
随着再生医学的迅速发展，细胞膜片技术也为细胞移植治疗Ⅰ型糖尿病带来了希望。由于移植细胞无法长期存活并保持生物学功能，目前胰岛细胞移植的方法仅能获得短期疗效。Saito等[10]发现胰岛细胞膜片无论在体外还是在体内环境下，都能保留分泌胰岛素和胰高血糖素的功能，预示着细胞膜片技术有可能在Ⅰ型糖尿病的治疗方面发挥重要作用。此外，在膀胱、皮肤等软组织构建领域，细胞膜片技术也展现出诱人前景[6, 11]。
2 复层膜片构建三维结构的软组织
细胞膜片技术获取的单层细胞膜片也可用来构建具有三维结构的组织。Haraguchi等[12]将多层膜片重叠复合，实现了三维组织的构建。另有学者采用多次手术重叠植入单层心肌细胞膜片的方法构建出厚约1 mm、可搏动的心肌组织，膜片中保留的细胞-细胞连接对于心肌的搏动和功能恢复十分重要[7, 13]。为了比较单层和多层细胞膜片的治疗效果，Sekiya等[14]将1、3、5层心肌细胞膜片植入大鼠心肌梗死区，术后8周通过超声心动图、导管插入术、组织学等检查综合评价，结果多层膜片组的心脏射血分数及收缩末期压力容积显著改善，5层膜片移植组中心肌纤维化最少，新生血管密度最高，表明植入多层膜片可以更好地恢复心功能。
细胞膜片技术在血管构建方面也展现出良好的应用前景。Hibino等[15]将诱导的多能干细胞膜片与直径0.8 mm细管状可降解的高分子聚合物复合构建小口径组织工程化血管。Zhao等[16]应用未分化骨髓基质干细胞膜片成功构建小口径组织工程化血管，在兔颈动脉缺损模型上成功重建颈动脉，移植1月后血管仍保持通畅，并发现部分血管内壁上皮化。L’Heureux等[17]将血管平滑肌细胞膜片结构环绕在一个管状支撑体，再用人成纤维细胞膜片环绕在中膜层外作为血管外膜，孵育成熟后将支撑体取出并把内皮细胞接种到管腔内。该方法体外构建的组织工程血管具有三层结构，血管内径约3 mm，爆破强度可达到2 000 mm Hg，与人体天然血管相当，进一步用于修复犬双侧股动脉缺损，短期内观察血管通畅。
氧气和营养的充足供应以及代谢产物的顺利排出，是体外构建的大体积组织植入体内后能够成活的必要前提，因此解决血管化的问题势在必行。Sasagawa等[18]将脐静脉内皮细胞膜片以“三明治”的形式夹杂在多层成肌细胞膜片中间，体外培养发现内皮细胞层可发芽形成网状血管，植入裸鼠体内后这些预成血管与宿主体内血管自行吻合连接，形成的新生血管网有利于三维构建组织的成活，该研究结果提示借助细胞膜片技术有望实现构建组织的血管化。
3 硬组织的构建和再生
细胞膜片技术在骨、软骨、牙齿等硬组织构建领域也有诸多应用。2007年Zhou等[19]首先报道将细胞膜片技术应用于组织工程骨的构建,其方法是将具有成骨分化潜能的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)膜片包裹块状磷酸三钙/聚已酸内酯复合材料，体外培养后植入裸鼠背部皮下，发现皮质骨和松质骨形成，同时新生组织具有较高抗压强度。Ma等[20]将BMSC膜片作为骨膜样组织与磷酸三钙复合，发现细胞膜片可以作为细胞释放载体赋予无机材料生物活性。Solorio等[21]将人来源BMSC膜片与加载有转移生长因子的可降解明胶微球结合，成功构建软骨样组织。此外，Yang等[22]采用经处理的牙本质作为生物支架，与人牙滤泡细胞膜片复合，构建牙根样组织，并发现细胞膜片在牙本质引导下形成牙髓和牙周样结构。
上述研究是在体外及实验动物皮下异位完成的，尚不能代表构建组织在骨或者软骨缺损环境下具有修复功能。因此，Tsumanuma等[23]借助乙醇酸编织片做载体，将三层犬牙周膜细胞膜片三明治式重叠后移植到牙周缺损的牙根表面，周围充填多孔β-磷酸三钙，结果缺损区既有新生骨也有牙骨质，二者间还可见良好走行的胶原纤维连接。Ma等[24]在兔模型的颅骨临界缺损区植入细胞膜片和同种异体脱钙骨基质颗粒复合物，术后12周缺损区完全由新生骨修复。
这些硬组织的构建方法仍然涉及到外源性支架材料的应用。尽管已有众多材料(生物陶瓷、高分子聚合物及陶瓷聚合物复合材料等)被应用于构建组织工程骨，但目前为止仍未发现一种完全理想的材料。为避免对支架材料过分依赖，Ma等[4]将成骨分化的骨髓基质膜片折叠成长方形状的多层膜片复合物，并由一端卷起形成具有一定体积的圆构建物，静置孵育后移植到裸鼠背部皮下，结果发现8周后体内形成密度与裸鼠椎体相似的矿化物，组织学检查证实为骨组织。研究结果充分说明单纯应用成体干细胞膜片，无需支架材料也可以构建骨组织，为组织工程骨构建提供了新的策略。
综上所述，细胞膜片技术已经广泛应用于组织工程和再生医学领域。该技术也存在一些局限性亟待解决，例如：细胞膜片具有易碎性，可操作性能较低，初期的生物力学性能较差；其次，采用该技术构建大体积的组织时，所需种子细胞数量大、培养时间长且形态难以精确控制。但作为一种优良的细胞释放系统，细胞膜片技术是传统组织工程技术的有益补充，将为组织工程和再生医学的发展提供崭新思路和广阔前景。