转移生长因子-β1(TGF-β1)/Smad3信号转导通路与人类的多种生理病理发生机制相关,但是该信号通路中Smad3被磷酸化的时空信息仍然不完全清楚。为了动态观察活细胞生理状态下Smad3被磷酸化的过程,首先进行ECFP-Smad3-Citrine(Smad3 biosensor)融合蛋白表达载体的构建及鉴定;然后转染293T细胞并观察转染效率和融合蛋白表达情况。在荧光显微镜下,应用MetaFlour FRET 4.6软件测量TGF-β1刺激293T细胞前后Smad3 biosensor的荧光能量共振转移(FRET)的变化情况。结果显示,Smad3 biosensor转染效率达40%,融合蛋白表达成功。TGF-β1刺激293T细胞10 min后,监测到胞质内FRET值逐渐减小,青色荧光蛋白(CFP)减弱,黄色荧光蛋白变体(Citrine)增强,历时约300 s后逐渐恢复。应用FRET技术能使我们在活细胞生理状态下,实时动态监测TGF-β1/Smad3信号转导通路的过程。
引用本文： 曹薇薇, 刘伟, 王维山, 陈召, 何仁豪, 何建伟. 利用荧光共振能量转移技术研究TGF-β/Smad3信号转导通路. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(5): 1080-1084. doi: 10.7507/1001-5515.20140203 复制
引言
转移生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是多肽转移生长因子大家族成员之一。在大多数细胞中，TGF-β1与胞膜受体结合后是通过Smad蛋白介导将胞外信号传递到胞质和细胞核中，从而调控着细胞的增殖、分化和细胞凋亡等许多生理和病理过程[1] 。Smad蛋白被分为三类，即受体调节Smads (receptor-regulated Smads,R-Smads)，它可与通用Smads (common-partner Smad，Co-Smad)结合成复合物，第三类Smads是抑制型Smads (inhibitory Smads，I-Smads)[2]。
R-Smads包括了Smad1、Smad2和Smad3，它们具有相似的蛋白结构和功能，均有3个功能域，即MH1区、MH2区和Linker区。当有配体(如TGF-β1)存在时，C端的MH2区含有的保守磷酸化位点SSXS基序可被TGF-β1受体I磷酸化，然后与Smad4结合为二聚体转位入核[3]。N端的MH1结构域在细胞核中与转录辅激活蛋白或辅阻遏物相互作用，结合下游的靶基因，调节基因转录[4]。既往研究证实，MH1区和MH2区在Smad3未被活化时相互抑制，磷酸化后构象发生变化，抑制作用解除。Smad3是通过磷酸化前后的构象变化来传递TGF-β1信号的，即通过Smad3空间结构变构将Smad 3与受体的作用转化为Smad3与细胞核的互相作用[5]。但是TGF-β1受体与Smad3相互作用的机制仍然不完全清楚，如：TGF-β1与受体结合后，多长时间、在什么位置Smad3被磷酸化产生空间变构效应？本实验研究了这一问题。
本研究利用荧光能量共振转移(flurorescence resonance energy transfer,FRET)技术这一目前研究活体细胞内信号转导通路最可靠的方法，对TGF-β1/Smad3信号转导通路作进一步的探讨，以期在活细胞生理条件下明确TGF-β1/Smad3信号传递过程的时空信息。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株和细胞
CKAR生物传感器载体质粒和Smad3-pcDNA3.1载体质粒由美国约翰霍普金斯大学万梅教授惠赠；FT-T Fast Ligation Kit购自上海依科赛生物制品有限公司；大肠杆菌菌株DH5α、人胚肾上皮293T细胞均由本室保存。
1.1.2 试剂
细胞转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；DNA回收试剂盒、质粒小量制备试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；反转录试剂盒、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、核酸分子量Marker等购自Takara公司；无内毒素质粒大提试剂盒购自TianGen生物科技有限公司；细胞培养试剂(DMEM、胎牛血清)为Gibco公司产品；其他试剂为国产分析纯级。
1.1.3 荧光成像系统
Zeiss Axiovert 200 M 倒置荧光显微镜(德国Zeiss公司)，配备青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)(BP 436/25,FT455,BP480/40)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP) (BP 500/25,FT515,BP535/30)、CFP-YFP-FRET(BP 436/25,FT455,BP535/30)滤光片，MetaFlour软件。
1.2 ECFP-Smad3-Citrine融合蛋白表达载体的构建及表达鉴定
依据NCBI数据库中Smad3 mRNA基因序列，用Primer Premier 5.0 软件设计引物。引入合适的酶切位点和保护碱基备用，下划线处分别为Sph Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点。并委托上海生工生物技术公司合成：
P1 5′-ACAT
P2 5′-C
以CKAR生物传感器载体质粒为起点，通用质粒FT-T为中间载体，依次获得了多个中间重组子，最后获得目的重组质粒Smad3-Biosensor(ECFP-Smad3-Citrine-pcDNA3′)。经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序结果均表明成功构建Smad3 Biosensor(见图 1、2)。
图1
构建Smad3生物传感器载体PCR鉴定结果
1：Smad3生物传感器质粒PCR结果；M：DNA marker Ⅲ标准分子量
Figure1. Identification of constructed Smad3 biosensor vector by PCR1: Smad3 biosensor vector PCR production by electrophoresis; M: DNA marker,marker Ⅲ
图2
构建Smad3生物传感器载体双酶切鉴定结果
1：Smad3生物传感器载体
1: Smad3 biosensor vector by double restriction enzymes digestion with
1.3 细胞培养和转染
293T细胞用含10% FBS的DMEM培养基，在37 ℃、 5% CO2培养箱中培养。转染前1 d，细胞用0.05%胰蛋白酶消化，铺入Petri皿中，密度为2×104 个/皿。待细胞生长融合至50%～70%时，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒操作说明，转染3 μg Smad3 Biosensor载体质粒,7 μL Lip2000，转染24 h后，用Zeiss Axiovert 200 M倒置荧光显微镜观察荧光蛋白表达情况。
1.4 荧光成像及FRET检测
1.4.1 校正因子计算
在Zeiss Axiovert 200 M倒置荧光显微镜上，采用1 000倍油镜。分别选取CFP、YFP、FRET三个滤光片作为供体、受体、FRET三个通道的滤光片。分别用单独转染并表达pCFP和pEYFP的细胞来检测并计算供体的校正因子(correction factor)A和B，MetaFlour FRET软件计算供体及受体串色常数，得到校正后的FRET。
1.4.2 FRET检测
将滤光片转到CFP通道，镜下确定视野，选定待测细胞，将滤光片转到FRET通道，拍照获取单张细胞图片。对待测细胞圈定几个感兴趣区域(region of interest，ROI)，同时选定1个无细胞的背景区域，用以扣除背景信号。设置实时观察时间60 min，每间隔1 min采图一次，共60张。连续采集CFP、YFP和FRET三个通道的图片；将前面计算出的供体校正因子A和受体校正因子B输入MetaFlour FRET 4.6软件自带公式，运用校正的方法计算出Corrected FRET，并用伪彩标记FRET图像(pseudoecolored FRET image)显示FRET效率。确认CFP、YFP、YFP/CFP Ratio三条基线处于平稳状态后，加入终浓度为1.25 ng/mL的TGF-β1，动态观察FRET变化。
2 结果
2.1 Smad3 biosensor的表达、FRET值检测及计算
在488 nm激光激发转染Smad3 biosensor的293T细胞，用515 nm的绿色荧光蛋白通道观察发现：细胞可发出较强的绿色荧光，整体细胞转染率达到40%(见图 3)。除了能在CFP通道和YFP通道看到均匀分布的青色和黄色荧光外，还可以在FRET通道看到明显的黄色荧光即FRET现象(见图 4)。并且用伪彩标记的RRET图像也显示有较高的FRET值(数据未显示)。
图3
Smad3 biosensor在细胞中的表达情况
Figure3.
Smad3 biosensor fusion protein expression in 293T cells
图4
Smad3 biosensor在293T细胞中的FRET图像
Figure4.
FRET image of Smad3 biosensor fusion protein expression in 293T cells
2.2 TGF-β1诱导Smad3融合蛋白的动力学研究
为了能在293T细胞中实时动态观察到TGF-β1诱导的Smad3被激活的生理过程，我们将293T细胞转染了Smad3 biosensor质粒，表达24 h后，观察TGF-β1诱导处理前后，Smad3融合蛋白的FRET现象的变化情况。细胞分为对照组(n=3)和实验组(n=3)，对照组加入PBS液，实验组加入TGF-β1液(浓度1.25 ng/mL)。结果显示：对照组在实验记录时间内，YFP和CFP的荧光强度没有任何变化；实验组(见图 5、6)中，经过TGF-β1处理后，可以看到前10 min左右CFP、Citrine的荧光强度没有变化，这段无反应期之后，出现了CFP荧光强度明显增强而Citrine的荧光强度明显减弱的现象，Citrine/CFP的强度也明显减弱，变化持续时间约300 s，之后600 s Citrine/CFP的强度逐渐恢复。用PBS冲洗，30 min后，重复上述实验有时还可以出现上述FRET改变的现象。综上所述，基于FRET原理，通过定量分析对照组和实验组的Citrine和CFP荧光强度随时间变化的比率，证实Smad3蛋白在TGF-β1诱导下被激活并发生了空间构象的改变，历时约300 s，而293T细胞在TGF-β1诱导下TGF-β1/Smad3信号转导有一定滞后时间，约10 min。
图5
TGF-β1与293T细胞共孵育前后15 min三个通道的荧光图像和伪彩FRET图像
上排：加入TGF-
Upper line: before adding TGF-
图6
用计算机分析转染Smad3 biosensor 的293T细胞在TGF-β1刺激下的FRET现象
Figure6.
Computerized analysis of FRET in a single 293T cell transfected with Smad3 biosensor after incubation with the ligand of TGF-β1
3 讨论
FRET现象是指当两个荧光基团足够近时(通常在10 nm以内)，激发供体荧光基团，能量将转移到受体荧光基团，使受体发射出荧光，FRET现象是一个距离依赖性的物理过程，其效率与供体和受体荧光基团之间距离的六次方成反比。由于其能量传递与供受体之间的距离的高度依赖性，使得人们可以利用FRET现象来分析两个分子间的相互作用或者同一分子间构象的变化[6]。根据这一原理，将目标蛋白与荧光蛋白融合表达，运用FRET技术在活细胞中可用于可视化检测细胞内信号转导机制的研究[7]。CFP和YFP是最常用的一对用于FRET研究的荧光基团。但是YFP易于受到细胞中酸碱度和氯离子的影响，有学者将YFP置换为更稳定的黄色荧光蛋白变体--Citrine，从而大大提高了FRET的效率[8]。本实验所用的一对荧光蛋白就是CFP和Citrine，在Zeiss Axiovert 200 M倒置荧光显微镜下观察到了FRET现象，说明Smad3 biosensor融合蛋白表达成功，荧光蛋白产生的FRET的效率较高。
本实验TGF-β1与293T细胞共孵育10 min后，Smad3的融合蛋白的FRET现象才发生改变，这一段无反应时间是什么因素造成的，或者说TGF-β1/Smad3信号转导通路的限速反应步骤是什么，这是一个值得研究的问题。既往研究证实，TGF-β1能与细胞表面密布的TGF-β1受体迅速结合，亲和力很强，信号转导速度应该很快[9]。有研究也证实，Smad3在胞质中弥散速度很快，能很快接受TGF-β1受体磷酸化[10]。我们考虑以下步骤可以影响TGF-β1/Smad3信号转导通路的反应速度，如TGF-β1与受体结合后TGF-β1受体入胞作用的速度[11]，还有Smad3被TGF-β1受体磷酸化后脱落的速度也会影响到其他Smad3继续被TGF-β1受体磷酸化的速度。上述因素均可延迟TGF-β1/Smad3信号转导通路的反应时间。
Smad3被磷酸化后，其MH2区产生了空间结构改变，与MH1区像双臂一样打开，使得Smad3融合蛋白两端的CFP和Citrine荧光蛋白的FRET效率减低，FRET变化过程提示，上述Smad3被磷酸化并产生变构的过程历时约300 s。从区域上看，靠近胞膜的胞质中产生FRET现象较明显，提示了反应的位置。FRET现象产生变化的时间反映了细胞内Smad3被磷酸化的过程，使我们在时间和空间二维层次上认识了TGF-β1/Smad3信号转导通路在活细胞中的传递过程。
最近有研究表明，Smad3蛋白的基因突变和缺失与乳腺癌[12]和胃癌[13]有关。我们相信本实验中的Smad3 biosensor将能作为一种抗肿瘤药物的高通量筛选工具和药效评价工具，为肿瘤临床的分子靶向治疗提供可靠理论依据。
引言
转移生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是多肽转移生长因子大家族成员之一。在大多数细胞中，TGF-β1与胞膜受体结合后是通过Smad蛋白介导将胞外信号传递到胞质和细胞核中，从而调控着细胞的增殖、分化和细胞凋亡等许多生理和病理过程[1] 。Smad蛋白被分为三类，即受体调节Smads (receptor-regulated Smads,R-Smads)，它可与通用Smads (common-partner Smad，Co-Smad)结合成复合物，第三类Smads是抑制型Smads (inhibitory Smads，I-Smads)[2]。
R-Smads包括了Smad1、Smad2和Smad3，它们具有相似的蛋白结构和功能，均有3个功能域，即MH1区、MH2区和Linker区。当有配体(如TGF-β1)存在时，C端的MH2区含有的保守磷酸化位点SSXS基序可被TGF-β1受体I磷酸化，然后与Smad4结合为二聚体转位入核[3]。N端的MH1结构域在细胞核中与转录辅激活蛋白或辅阻遏物相互作用，结合下游的靶基因，调节基因转录[4]。既往研究证实，MH1区和MH2区在Smad3未被活化时相互抑制，磷酸化后构象发生变化，抑制作用解除。Smad3是通过磷酸化前后的构象变化来传递TGF-β1信号的，即通过Smad3空间结构变构将Smad 3与受体的作用转化为Smad3与细胞核的互相作用[5]。但是TGF-β1受体与Smad3相互作用的机制仍然不完全清楚，如：TGF-β1与受体结合后，多长时间、在什么位置Smad3被磷酸化产生空间变构效应？本实验研究了这一问题。
本研究利用荧光能量共振转移(flurorescence resonance energy transfer,FRET)技术这一目前研究活体细胞内信号转导通路最可靠的方法，对TGF-β1/Smad3信号转导通路作进一步的探讨，以期在活细胞生理条件下明确TGF-β1/Smad3信号传递过程的时空信息。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株和细胞
CKAR生物传感器载体质粒和Smad3-pcDNA3.1载体质粒由美国约翰霍普金斯大学万梅教授惠赠；FT-T Fast Ligation Kit购自上海依科赛生物制品有限公司；大肠杆菌菌株DH5α、人胚肾上皮293T细胞均由本室保存。
1.1.2 试剂
细胞转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；DNA回收试剂盒、质粒小量制备试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；反转录试剂盒、Pfu DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、核酸分子量Marker等购自Takara公司；无内毒素质粒大提试剂盒购自TianGen生物科技有限公司；细胞培养试剂(DMEM、胎牛血清)为Gibco公司产品；其他试剂为国产分析纯级。
1.1.3 荧光成像系统
Zeiss Axiovert 200 M 倒置荧光显微镜(德国Zeiss公司)，配备青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)(BP 436/25,FT455,BP480/40)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP) (BP 500/25,FT515,BP535/30)、CFP-YFP-FRET(BP 436/25,FT455,BP535/30)滤光片，MetaFlour软件。
1.2 ECFP-Smad3-Citrine融合蛋白表达载体的构建及表达鉴定
依据NCBI数据库中Smad3 mRNA基因序列，用Primer Premier 5.0 软件设计引物。引入合适的酶切位点和保护碱基备用，下划线处分别为Sph Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点。并委托上海生工生物技术公司合成：
P1 5′-ACAT
P2 5′-C
以CKAR生物传感器载体质粒为起点，通用质粒FT-T为中间载体，依次获得了多个中间重组子，最后获得目的重组质粒Smad3-Biosensor(ECFP-Smad3-Citrine-pcDNA3′)。经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序结果均表明成功构建Smad3 Biosensor(见图 1、2)。
图1
构建Smad3生物传感器载体PCR鉴定结果
1：Smad3生物传感器质粒PCR结果；M：DNA marker Ⅲ标准分子量
Figure1. Identification of constructed Smad3 biosensor vector by PCR1: Smad3 biosensor vector PCR production by electrophoresis; M: DNA marker,marker Ⅲ
图2
构建Smad3生物传感器载体双酶切鉴定结果
1：Smad3生物传感器载体
1: Smad3 biosensor vector by double restriction enzymes digestion with
1.3 细胞培养和转染
293T细胞用含10% FBS的DMEM培养基，在37 ℃、 5% CO2培养箱中培养。转染前1 d，细胞用0.05%胰蛋白酶消化，铺入Petri皿中，密度为2×104 个/皿。待细胞生长融合至50%～70%时，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒操作说明，转染3 μg Smad3 Biosensor载体质粒,7 μL Lip2000，转染24 h后，用Zeiss Axiovert 200 M倒置荧光显微镜观察荧光蛋白表达情况。
1.4 荧光成像及FRET检测
1.4.1 校正因子计算
在Zeiss Axiovert 200 M倒置荧光显微镜上，采用1 000倍油镜。分别选取CFP、YFP、FRET三个滤光片作为供体、受体、FRET三个通道的滤光片。分别用单独转染并表达pCFP和pEYFP的细胞来检测并计算供体的校正因子(correction factor)A和B，MetaFlour FRET软件计算供体及受体串色常数，得到校正后的FRET。
1.4.2 FRET检测
将滤光片转到CFP通道，镜下确定视野，选定待测细胞，将滤光片转到FRET通道，拍照获取单张细胞图片。对待测细胞圈定几个感兴趣区域(region of interest，ROI)，同时选定1个无细胞的背景区域，用以扣除背景信号。设置实时观察时间60 min，每间隔1 min采图一次，共60张。连续采集CFP、YFP和FRET三个通道的图片；将前面计算出的供体校正因子A和受体校正因子B输入MetaFlour FRET 4.6软件自带公式，运用校正的方法计算出Corrected FRET，并用伪彩标记FRET图像(pseudoecolored FRET image)显示FRET效率。确认CFP、YFP、YFP/CFP Ratio三条基线处于平稳状态后，加入终浓度为1.25 ng/mL的TGF-β1，动态观察FRET变化。
2 结果
2.1 Smad3 biosensor的表达、FRET值检测及计算
在488 nm激光激发转染Smad3 biosensor的293T细胞，用515 nm的绿色荧光蛋白通道观察发现：细胞可发出较强的绿色荧光，整体细胞转染率达到40%(见图 3)。除了能在CFP通道和YFP通道看到均匀分布的青色和黄色荧光外，还可以在FRET通道看到明显的黄色荧光即FRET现象(见图 4)。并且用伪彩标记的RRET图像也显示有较高的FRET值(数据未显示)。
图3
Smad3 biosensor在细胞中的表达情况
Figure3.
Smad3 biosensor fusion protein expression in 293T cells
图4
Smad3 biosensor在293T细胞中的FRET图像
Figure4.
FRET image of Smad3 biosensor fusion protein expression in 293T cells
2.2 TGF-β1诱导Smad3融合蛋白的动力学研究
为了能在293T细胞中实时动态观察到TGF-β1诱导的Smad3被激活的生理过程，我们将293T细胞转染了Smad3 biosensor质粒，表达24 h后，观察TGF-β1诱导处理前后，Smad3融合蛋白的FRET现象的变化情况。细胞分为对照组(n=3)和实验组(n=3)，对照组加入PBS液，实验组加入TGF-β1液(浓度1.25 ng/mL)。结果显示：对照组在实验记录时间内，YFP和CFP的荧光强度没有任何变化；实验组(见图 5、6)中，经过TGF-β1处理后，可以看到前10 min左右CFP、Citrine的荧光强度没有变化，这段无反应期之后，出现了CFP荧光强度明显增强而Citrine的荧光强度明显减弱的现象，Citrine/CFP的强度也明显减弱，变化持续时间约300 s，之后600 s Citrine/CFP的强度逐渐恢复。用PBS冲洗，30 min后，重复上述实验有时还可以出现上述FRET改变的现象。综上所述，基于FRET原理，通过定量分析对照组和实验组的Citrine和CFP荧光强度随时间变化的比率，证实Smad3蛋白在TGF-β1诱导下被激活并发生了空间构象的改变，历时约300 s，而293T细胞在TGF-β1诱导下TGF-β1/Smad3信号转导有一定滞后时间，约10 min。
图5
TGF-β1与293T细胞共孵育前后15 min三个通道的荧光图像和伪彩FRET图像
上排：加入TGF-
Upper line: before adding TGF-
图6
用计算机分析转染Smad3 biosensor 的293T细胞在TGF-β1刺激下的FRET现象
Figure6.
Computerized analysis of FRET in a single 293T cell transfected with Smad3 biosensor after incubation with the ligand of TGF-β1
3 讨论
FRET现象是指当两个荧光基团足够近时(通常在10 nm以内)，激发供体荧光基团，能量将转移到受体荧光基团，使受体发射出荧光，FRET现象是一个距离依赖性的物理过程，其效率与供体和受体荧光基团之间距离的六次方成反比。由于其能量传递与供受体之间的距离的高度依赖性，使得人们可以利用FRET现象来分析两个分子间的相互作用或者同一分子间构象的变化[6]。根据这一原理，将目标蛋白与荧光蛋白融合表达，运用FRET技术在活细胞中可用于可视化检测细胞内信号转导机制的研究[7]。CFP和YFP是最常用的一对用于FRET研究的荧光基团。但是YFP易于受到细胞中酸碱度和氯离子的影响，有学者将YFP置换为更稳定的黄色荧光蛋白变体--Citrine，从而大大提高了FRET的效率[8]。本实验所用的一对荧光蛋白就是CFP和Citrine，在Zeiss Axiovert 200 M倒置荧光显微镜下观察到了FRET现象，说明Smad3 biosensor融合蛋白表达成功，荧光蛋白产生的FRET的效率较高。
本实验TGF-β1与293T细胞共孵育10 min后，Smad3的融合蛋白的FRET现象才发生改变，这一段无反应时间是什么因素造成的，或者说TGF-β1/Smad3信号转导通路的限速反应步骤是什么，这是一个值得研究的问题。既往研究证实，TGF-β1能与细胞表面密布的TGF-β1受体迅速结合，亲和力很强，信号转导速度应该很快[9]。有研究也证实，Smad3在胞质中弥散速度很快，能很快接受TGF-β1受体磷酸化[10]。我们考虑以下步骤可以影响TGF-β1/Smad3信号转导通路的反应速度，如TGF-β1与受体结合后TGF-β1受体入胞作用的速度[11]，还有Smad3被TGF-β1受体磷酸化后脱落的速度也会影响到其他Smad3继续被TGF-β1受体磷酸化的速度。上述因素均可延迟TGF-β1/Smad3信号转导通路的反应时间。
Smad3被磷酸化后，其MH2区产生了空间结构改变，与MH1区像双臂一样打开，使得Smad3融合蛋白两端的CFP和Citrine荧光蛋白的FRET效率减低，FRET变化过程提示，上述Smad3被磷酸化并产生变构的过程历时约300 s。从区域上看，靠近胞膜的胞质中产生FRET现象较明显，提示了反应的位置。FRET现象产生变化的时间反映了细胞内Smad3被磷酸化的过程，使我们在时间和空间二维层次上认识了TGF-β1/Smad3信号转导通路在活细胞中的传递过程。
最近有研究表明，Smad3蛋白的基因突变和缺失与乳腺癌[12]和胃癌[13]有关。我们相信本实验中的Smad3 biosensor将能作为一种抗肿瘤药物的高通量筛选工具和药效评价工具，为肿瘤临床的分子靶向治疗提供可靠理论依据。
