为了对金刚烷胺(AM)和联苯双酯(DDB)抗乙肝病毒(HBV)的作用进行动物实验研究,采用高压注射体内转染法建立HBV复制小鼠模型,对模型小鼠给药3 d后处死。用Southern杂交检测小鼠肝脏HBV DNA复制中间体;ELISA检测血清中HBeAg和HBsAg。给予AM和二种药物联合处理后,小鼠体内HBV DNA复制中间体和HBeAg、HBsAg的水平较对照组明显降低,而该两组相比无明显差异。仅给予DDB的小鼠肝脏HBV DNA复制中间体和血清抗原水平与对照组相比无明显差异。因此,AM能够抑制小鼠体内HBV的复制、表达,而连续3 d给予DDB对小鼠体内HBV无抑制作用。
引用本文： 刘凤君, 蒋智, 周巧玲, 于毅, 孟黄花, 石瑶. 金刚烷胺和联苯双酯抗乙型肝炎病毒作用的动物实验研究. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(2): 400-404. doi: 10.7507/1001-5515.20140075 复制
引言
乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，不仅发病人数众多，而且慢性乙型肝炎易发展成肝硬化和肝癌。慢性乙型肝炎治疗的关键是抗病毒，病毒的清除或抑制可以阻止或减轻肝脏的损害和疾病的进展。但因为目前尚无彻底清除乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的措施，所以目前慢性乙型肝炎的治疗目标是持续抑制HBV的复制，延缓肝病的进展，最终阻止肝硬化和肝癌的发生，药物主要是干扰素和核苷类似物。然而，现有抗HBV药物的疗效尚不令人满意，且核苷类似物的长期应用可能导致病毒耐药株的产生。因此，慢性乙型肝炎抗病毒这一领域的发展方向是寻找新的抗病毒措施，以替代目前抗HBV药物或与之联用，延缓或减少耐药的产生，增强抗HBV的疗效。
金刚烷胺(amantadine,AM)是临床治疗帕金森病的药物之一，也用于预防或治疗A型流感病毒的感染。其抗病毒机制尚未完全清楚，主要抑制病毒膜基质蛋白M2的合成，该蛋白为病毒进入宿主细胞所必需，因此可以抑制病毒穿入细胞。同时还可能有以下几种机制：封闭细胞膜上的病毒通道，抑制病毒脱壳，改变细胞表面电荷，抑制病毒增殖等。以往的研究及循证医学证据表明该药对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)有一定的抑制作用[1-4]。
联苯双脂(biphenyl dimethyl dicarboxylate,DDB)是我国中药五味子的提取物，能有效降低谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)的水平，长期作为一种传统的保肝药物用于急、慢性肝炎的治疗，动物实验研究发现DDB对小鼠受抑制的体液及细胞免疫功能具有一定的增强作用[5-6]。而Joo等[7-8]利用HBV体外复制细胞模型的研究发现：AM和DDB对HBV的复制具有抑制作用，二者联用抗病毒作用大大增强。其机制尚不清楚，可能通过激活干扰素样信号传导通路而实现的。崔速南等[9-10]在临床研究中也初步观察到，大剂量DDB有一定抗HBV的作用。
本研究拟进行动物实验，进一步验证以上两种药物是否具有抗HBV的作用。目前抗HBV药物的筛选主要用HBV转基因小鼠，但转基因小鼠的获得非常耗时、费力。而本实验小组建立的HBV复制型小鼠模型，具有简便、经济的特点，最重要的是使用该小鼠模型能够检测到目前抗病毒药物对HBV复制的抑制作用，可用于抗HBV药物的筛选[11-14]。所以本研究拟用HBV复制小鼠模型对以上两种药物抗HBV的作用进行体内研究。
1 材料与方法
1.1 主要试验材料
复制型HBV 重组质粒pHBV4.1由美国Scripps研究所Alan Mclachlan 教授惠赠，由本研究室保存；质粒DNA转化感受肽大肠杆菌JM109，扩增、提取及纯化采用QIAGEN TIP-500，操作按试剂盒说明书的程序进行。AM由江苏鹏鹞药业有限公司生产，批号：H32023575。DDB由浙江海翔药业股份有限公司提供。AM每日用药量为720 μg/kg，DDB的每日用量为450 μg/kg，根据体重计算出每只小鼠的用量，分两次给药。
1.2 实验方法
1.2.1 动物实验
雄性BALB/c小鼠,体重18～20 g,购自四川大学华西实验动物中心。将10 μg pHBV4.1质粒DNA溶于2 mL的生理盐水中，在5~8 s内通过尾静脉注入小鼠体内。注射24 h后，根据小鼠体重、年龄和血清HBeAg水平进行配对，将模型小鼠分成4组：AM组、DDB组、AM+DDB组和对照(NS)组，每组4只。实验组给予相应的药物灌胃，NS组给予生理盐水。用12号小鼠灌胃针灌胃，每日两次，共3 d。最后一次给药后6 h处死小鼠，留取小鼠的血清和肝脏。血清储存于-20 ℃。将小鼠肝组织立即置入液氮迅速冷冻，然后置于-70 ℃保存备用。动物实验过程如图 1所示。
图1
动物实验流程
Figure1.
The procedure of animal experiment
1.2.2 小鼠肝组织HBV DNA复制中间体的提取及检测
小鼠肝组织HBV DNA复制中间体的提取和检测按照我们已报道的方法进行[11]，具体如下：将冻存的肝组织在液氮中碾成粉末，用于提取HBV DNA复制中间体。将0.12 g肝粉溶入0.6 mL的细胞膜裂解液[100 mmol/L Tris.HCL(pH 8.0)、0.2%(vol/vol)NP40]中，14 000 r/min离心1 min。取上清加入MgOAC和DNAaseⅠ使其终浓度分别为6.75 mmol/L 和200 μg/mL，37 ℃孵育1 h。再依次加入 EDTA、SDS、NaCl、蛋白酶使其终浓度分别为10 mmol/L、0.8%(wt/vol)、100 mmol/L和1.6 mg/mL，37 ℃孵育1 h后。然后用酚/氯仿抽提2次，0.7倍体积的异丙醇沉淀DNA,DNA沉淀溶于30 μL[10 mmol/L Tris (pH 8.0),1 mmol/L EDTA],-20 ℃保存备用。取30 μL HBV DNA复制中间体以10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，用Southern杂交检测HBV DNA复制中间体，杂交采用地高辛标记的HBV全长基因组探针，并用地高辛发光检测试剂盒检测结果(Roche Applied Science)。
1.2.3 ELISA检测小鼠血清HBV相关抗原
分别取50 μL血清采用ELISA检测HBV表面抗原(HBV surface antigen,HBsAg)和HBV e抗原(HBV e antigen,HBeAg)，抗原的检测分别采用HBsAg和 HBeAg检测试剂盒(中国上海科华)。操作按试剂盒说明书进行。
2 结果
2.1 AM和DDB对小鼠体内HBV复制的影响
Southern杂交结果显示：与对照组相比，AM组和AM+DDB组小鼠肝脏中HBV 复制中间体DNA的水平均降低,经Quantity one 软件分析，两组HBV DNA 复制中间体均较对照组降低约30%，但两组间HBV DNA复制中间体的水平没有明显差别。DDB组小鼠肝脏中HBV DNA复制中间体水平与对照组无明显差异(见图 2)。
图2
AM和DDB对HBV转染小鼠体内病毒复制的影响
(a)Southern杂交检测HBV DNA复制中间体，HBV RC DNA为HBV 疏松环状DNA，HBV SS DNA为HBV 单链DNA；(b)HBV DNA复制中间体的定量分析，对照组小鼠HBV DNA复制中间体的量设为1.0，其它小鼠的水平与之相比计算出相对值,平均值及标准差来源于2次重复实验，共8只小鼠
Figure2. Effect of AM and DDB on viral replication in HBV transfected mice(a) DNA (Southern) filter hybridization analysis of HBV replication intermediate： HBV RC DNA: HBV relaxed DNA; HBV SS DNA： HBV single-stranded DNA; (b) quantitative analysis of the HBV DNA replication intermediates. The levels of HBV DNA intermediates were reported to the levels of the control mice,which were set at 1.0. The mean DNA levels plus standard deviation (indicated by error bars) from 8 mice of two repeated experiments were shown
2.2 AM和DDB对小鼠体内HBV抗原表达的影响
与对照组相比，AM组和AM+DDB组小鼠血清中HBsAg的水平下降，而这两组小鼠之间HBsAg水平没有明显差别。仅给予DDB处理的小鼠，血清HBsAg的水平与对照组相比没有明显变化。同样，各组小鼠血清HBeAg结果的比较与HBsAg相似：AM组和AM+DDB组小鼠HBeAg水平低于对照组，而这两组之间比较抗原水平无明显差异；DDB组小鼠HBeAg的水平与对照组比较无明显差异(见图 3)。
图3
AM和DDB对HBV转染小鼠血清HBsAg(左)和HBeAg(右)表达的影响
图中显示了两次重复实验8只小鼠的平均水平
Figure3. Effect of AM and DDB on HBsAg (left) and HBeAg (right) in HBV transfection micethe datd represented the mean value of eight mice from two repeated experiments
3 讨论
众所周知，HBV严重危害人类健康，我国属于乙型肝炎高发地区。全球许多科学家致力于乙型肝炎的相关研究，近年来取得了很大的进展，使乙型肝炎由“不治之症”变为可控性的疾病。近10余年，随着抗HBV药物的相继上市，慢性乙型肝炎患者的预后得到很大的改善。但是随着抗病毒药物应用的时间延长，其耐药性也显现出来，这使抗HBV的疗效受到影响。因此，寻找新的抗病毒药物仍然是这一领域的努力方向。新药研究包括了新的化合物的研发及老药新用的研究。体外研究发现AM和DDB具有抗HBV的作用，这两种药物均是临床常用药，价格低廉，安全性较好，如能证实确有抗HBV的作用，对于慢性乙型肝炎的治疗具有重要的意义。
AM是临床治疗帕金森病的药物之一，也用于预防或治疗A型流感病毒所引起的感染。AM在治疗、预防流感中已广泛使用十余年，并取得显著的疗效。多项多中心、随机、安慰剂对照的前瞻性临床研究发现，与标准二联方案(干扰素或长效干扰素+利巴韦林)相比，加入AM的三联方案能够提高慢性丙型肝炎的持续病毒应答率，尤其对于单用干扰素或标准二联方案无应答的患者，优势尤为突出[1-4]。循证医学证据也支持这一结论[15-16]。另有研究发现，在标准方案的基础上加入AM(每日200 mg，疗程12个月)不仅不会影响慢性丙型肝炎患者的日常生活质量，还可减轻患者的焦虑等情绪反应[3, 17]。以上的研究提示，AM对丙肝病毒具有抑制作用，且长期使用具有很好的安全性。而最近利用HBV体外复制细胞模型的研究发现，AM对HBV的复制有抑制作用。本研究结果发现，对HBV复制型小鼠单独给予AM或与DDB联合处理3 d后，小鼠肝脏中HBV DNA复制中间体和血清中HBsAg和HBeAg的水平均降低，提示该药对小鼠体内HBV病毒的复制和抗原的表达有抑制作用。其作用机制尚不清楚。体外研究发现，AM可以激活HepG2 2.2.15 细胞膜上的干扰素IFN-α受体(IFNAR)以及干扰素信号通路的多种细胞因子表达，如酪氨酸激酶JAK1、信号转导和转录激活因子STAT2、寡聚腺苷酸合成酶OAS等，且使HBV复制周期中的前基因组RNA(pgRNA)的水平降低，由此推测AM抗HBV的机制可能通过干扰素信号通路实现的。由于干扰素信号传导通路中需要多种激酶的参与，在体内的作用效果优于体外，因此可从这一方向设计动物实验进一步研究AM抗HBV的机制。虽然本研究未能涉及AM抗HBV机制，但在体外研究结果的基础上，进一步在动物体内证实了AM对HBV的抑制作用，为以后的相关深入研究和临床应用奠定基础。
DDB是我国中药五味子的提取物，能有效降低ALT的水平，自1974年首次问世以来一直作为一种传统的保肝药物用于急、慢性肝炎的治疗。其突出的优点是降酶速度快、毒副作用少、价格便宜。大量实验证实，DDB可以减轻毒性物质引起肝细胞膜的损伤，保护肝细胞内质网结构和功能的完整性。最近的体外实验证实，DDB对HBV的复制具有抑制作用[7-8],与AM联用抗病毒作用增强。而且，崔速南等在临床研究也初步观察到，大剂量DDB具有一定的抗HBV作用。但我们的研究结果提示，对HBV复制型小鼠，单独给予DDB处理，小鼠肝脏中HBV DNA复制中间体和血清中HBV相关抗原水平与对照组相比均无明显差别。而且，结果还提示AM对HBV复制型小鼠体内的病毒复制和表达有抑制作用，但与DDB联用后，抗病毒作用无明显变化。因此，以上结果提示DDB单独使用未能抑制小鼠体内HBV的复制和表达，也未能增强AM的抗HBV作用，与体外的实验结果不同[7-8]。其原因可能如下：该小鼠模型为一短期的HBV复制模型，HBV复制的高峰时间为转染后第3 d，而我们的药物处理持续时间为3 d，可能在如此短的时间内，药物抗HBV的作用尚未显示出来。因此，可使用长期HBV复制模型，延长给药时间，进一步证实该药在体内对HBV是否具有抑制作用。
总之，本研究在体外研究结果的基础上，应用HBV复制小鼠模型进一步在体内证实AM对HBV的复制和表达具有抑制作用，为进一步深入研究和临床应用提供基础。连续3 d给予DDB处理对HBV的复制表达无影响，这需要更进一步的研究，如延长给药时间来证实该药在小鼠体内对HBV是否具有抑制作用。
引言
乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，不仅发病人数众多，而且慢性乙型肝炎易发展成肝硬化和肝癌。慢性乙型肝炎治疗的关键是抗病毒，病毒的清除或抑制可以阻止或减轻肝脏的损害和疾病的进展。但因为目前尚无彻底清除乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的措施，所以目前慢性乙型肝炎的治疗目标是持续抑制HBV的复制，延缓肝病的进展，最终阻止肝硬化和肝癌的发生，药物主要是干扰素和核苷类似物。然而，现有抗HBV药物的疗效尚不令人满意，且核苷类似物的长期应用可能导致病毒耐药株的产生。因此，慢性乙型肝炎抗病毒这一领域的发展方向是寻找新的抗病毒措施，以替代目前抗HBV药物或与之联用，延缓或减少耐药的产生，增强抗HBV的疗效。
金刚烷胺(amantadine,AM)是临床治疗帕金森病的药物之一，也用于预防或治疗A型流感病毒的感染。其抗病毒机制尚未完全清楚，主要抑制病毒膜基质蛋白M2的合成，该蛋白为病毒进入宿主细胞所必需，因此可以抑制病毒穿入细胞。同时还可能有以下几种机制：封闭细胞膜上的病毒通道，抑制病毒脱壳，改变细胞表面电荷，抑制病毒增殖等。以往的研究及循证医学证据表明该药对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)有一定的抑制作用[1-4]。
联苯双脂(biphenyl dimethyl dicarboxylate,DDB)是我国中药五味子的提取物，能有效降低谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)的水平，长期作为一种传统的保肝药物用于急、慢性肝炎的治疗，动物实验研究发现DDB对小鼠受抑制的体液及细胞免疫功能具有一定的增强作用[5-6]。而Joo等[7-8]利用HBV体外复制细胞模型的研究发现：AM和DDB对HBV的复制具有抑制作用，二者联用抗病毒作用大大增强。其机制尚不清楚，可能通过激活干扰素样信号传导通路而实现的。崔速南等[9-10]在临床研究中也初步观察到，大剂量DDB有一定抗HBV的作用。
本研究拟进行动物实验，进一步验证以上两种药物是否具有抗HBV的作用。目前抗HBV药物的筛选主要用HBV转基因小鼠，但转基因小鼠的获得非常耗时、费力。而本实验小组建立的HBV复制型小鼠模型，具有简便、经济的特点，最重要的是使用该小鼠模型能够检测到目前抗病毒药物对HBV复制的抑制作用，可用于抗HBV药物的筛选[11-14]。所以本研究拟用HBV复制小鼠模型对以上两种药物抗HBV的作用进行体内研究。
1 材料与方法
1.1 主要试验材料
复制型HBV 重组质粒pHBV4.1由美国Scripps研究所Alan Mclachlan 教授惠赠，由本研究室保存；质粒DNA转化感受肽大肠杆菌JM109，扩增、提取及纯化采用QIAGEN TIP-500，操作按试剂盒说明书的程序进行。AM由江苏鹏鹞药业有限公司生产，批号：H32023575。DDB由浙江海翔药业股份有限公司提供。AM每日用药量为720 μg/kg，DDB的每日用量为450 μg/kg，根据体重计算出每只小鼠的用量，分两次给药。
1.2 实验方法
1.2.1 动物实验
雄性BALB/c小鼠,体重18～20 g,购自四川大学华西实验动物中心。将10 μg pHBV4.1质粒DNA溶于2 mL的生理盐水中，在5~8 s内通过尾静脉注入小鼠体内。注射24 h后，根据小鼠体重、年龄和血清HBeAg水平进行配对，将模型小鼠分成4组：AM组、DDB组、AM+DDB组和对照(NS)组，每组4只。实验组给予相应的药物灌胃，NS组给予生理盐水。用12号小鼠灌胃针灌胃，每日两次，共3 d。最后一次给药后6 h处死小鼠，留取小鼠的血清和肝脏。血清储存于-20 ℃。将小鼠肝组织立即置入液氮迅速冷冻，然后置于-70 ℃保存备用。动物实验过程如图 1所示。
图1
动物实验流程
Figure1.
The procedure of animal experiment
1.2.2 小鼠肝组织HBV DNA复制中间体的提取及检测
小鼠肝组织HBV DNA复制中间体的提取和检测按照我们已报道的方法进行[11]，具体如下：将冻存的肝组织在液氮中碾成粉末，用于提取HBV DNA复制中间体。将0.12 g肝粉溶入0.6 mL的细胞膜裂解液[100 mmol/L Tris.HCL(pH 8.0)、0.2%(vol/vol)NP40]中，14 000 r/min离心1 min。取上清加入MgOAC和DNAaseⅠ使其终浓度分别为6.75 mmol/L 和200 μg/mL，37 ℃孵育1 h。再依次加入 EDTA、SDS、NaCl、蛋白酶使其终浓度分别为10 mmol/L、0.8%(wt/vol)、100 mmol/L和1.6 mg/mL，37 ℃孵育1 h后。然后用酚/氯仿抽提2次，0.7倍体积的异丙醇沉淀DNA,DNA沉淀溶于30 μL[10 mmol/L Tris (pH 8.0),1 mmol/L EDTA],-20 ℃保存备用。取30 μL HBV DNA复制中间体以10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，用Southern杂交检测HBV DNA复制中间体，杂交采用地高辛标记的HBV全长基因组探针，并用地高辛发光检测试剂盒检测结果(Roche Applied Science)。
1.2.3 ELISA检测小鼠血清HBV相关抗原
分别取50 μL血清采用ELISA检测HBV表面抗原(HBV surface antigen,HBsAg)和HBV e抗原(HBV e antigen,HBeAg)，抗原的检测分别采用HBsAg和 HBeAg检测试剂盒(中国上海科华)。操作按试剂盒说明书进行。
2 结果
2.1 AM和DDB对小鼠体内HBV复制的影响
Southern杂交结果显示：与对照组相比，AM组和AM+DDB组小鼠肝脏中HBV 复制中间体DNA的水平均降低,经Quantity one 软件分析，两组HBV DNA 复制中间体均较对照组降低约30%，但两组间HBV DNA复制中间体的水平没有明显差别。DDB组小鼠肝脏中HBV DNA复制中间体水平与对照组无明显差异(见图 2)。
图2
AM和DDB对HBV转染小鼠体内病毒复制的影响
(a)Southern杂交检测HBV DNA复制中间体，HBV RC DNA为HBV 疏松环状DNA，HBV SS DNA为HBV 单链DNA；(b)HBV DNA复制中间体的定量分析，对照组小鼠HBV DNA复制中间体的量设为1.0，其它小鼠的水平与之相比计算出相对值,平均值及标准差来源于2次重复实验，共8只小鼠
Figure2. Effect of AM and DDB on viral replication in HBV transfected mice(a) DNA (Southern) filter hybridization analysis of HBV replication intermediate： HBV RC DNA: HBV relaxed DNA; HBV SS DNA： HBV single-stranded DNA; (b) quantitative analysis of the HBV DNA replication intermediates. The levels of HBV DNA intermediates were reported to the levels of the control mice,which were set at 1.0. The mean DNA levels plus standard deviation (indicated by error bars) from 8 mice of two repeated experiments were shown
2.2 AM和DDB对小鼠体内HBV抗原表达的影响
与对照组相比，AM组和AM+DDB组小鼠血清中HBsAg的水平下降，而这两组小鼠之间HBsAg水平没有明显差别。仅给予DDB处理的小鼠，血清HBsAg的水平与对照组相比没有明显变化。同样，各组小鼠血清HBeAg结果的比较与HBsAg相似：AM组和AM+DDB组小鼠HBeAg水平低于对照组，而这两组之间比较抗原水平无明显差异；DDB组小鼠HBeAg的水平与对照组比较无明显差异(见图 3)。
图3
AM和DDB对HBV转染小鼠血清HBsAg(左)和HBeAg(右)表达的影响
图中显示了两次重复实验8只小鼠的平均水平
Figure3. Effect of AM and DDB on HBsAg (left) and HBeAg (right) in HBV transfection micethe datd represented the mean value of eight mice from two repeated experiments
3 讨论
众所周知，HBV严重危害人类健康，我国属于乙型肝炎高发地区。全球许多科学家致力于乙型肝炎的相关研究，近年来取得了很大的进展，使乙型肝炎由“不治之症”变为可控性的疾病。近10余年，随着抗HBV药物的相继上市，慢性乙型肝炎患者的预后得到很大的改善。但是随着抗病毒药物应用的时间延长，其耐药性也显现出来，这使抗HBV的疗效受到影响。因此，寻找新的抗病毒药物仍然是这一领域的努力方向。新药研究包括了新的化合物的研发及老药新用的研究。体外研究发现AM和DDB具有抗HBV的作用，这两种药物均是临床常用药，价格低廉，安全性较好，如能证实确有抗HBV的作用，对于慢性乙型肝炎的治疗具有重要的意义。
AM是临床治疗帕金森病的药物之一，也用于预防或治疗A型流感病毒所引起的感染。AM在治疗、预防流感中已广泛使用十余年，并取得显著的疗效。多项多中心、随机、安慰剂对照的前瞻性临床研究发现，与标准二联方案(干扰素或长效干扰素+利巴韦林)相比，加入AM的三联方案能够提高慢性丙型肝炎的持续病毒应答率，尤其对于单用干扰素或标准二联方案无应答的患者，优势尤为突出[1-4]。循证医学证据也支持这一结论[15-16]。另有研究发现，在标准方案的基础上加入AM(每日200 mg，疗程12个月)不仅不会影响慢性丙型肝炎患者的日常生活质量，还可减轻患者的焦虑等情绪反应[3, 17]。以上的研究提示，AM对丙肝病毒具有抑制作用，且长期使用具有很好的安全性。而最近利用HBV体外复制细胞模型的研究发现，AM对HBV的复制有抑制作用。本研究结果发现，对HBV复制型小鼠单独给予AM或与DDB联合处理3 d后，小鼠肝脏中HBV DNA复制中间体和血清中HBsAg和HBeAg的水平均降低，提示该药对小鼠体内HBV病毒的复制和抗原的表达有抑制作用。其作用机制尚不清楚。体外研究发现，AM可以激活HepG2 2.2.15 细胞膜上的干扰素IFN-α受体(IFNAR)以及干扰素信号通路的多种细胞因子表达，如酪氨酸激酶JAK1、信号转导和转录激活因子STAT2、寡聚腺苷酸合成酶OAS等，且使HBV复制周期中的前基因组RNA(pgRNA)的水平降低，由此推测AM抗HBV的机制可能通过干扰素信号通路实现的。由于干扰素信号传导通路中需要多种激酶的参与，在体内的作用效果优于体外，因此可从这一方向设计动物实验进一步研究AM抗HBV的机制。虽然本研究未能涉及AM抗HBV机制，但在体外研究结果的基础上，进一步在动物体内证实了AM对HBV的抑制作用，为以后的相关深入研究和临床应用奠定基础。
DDB是我国中药五味子的提取物，能有效降低ALT的水平，自1974年首次问世以来一直作为一种传统的保肝药物用于急、慢性肝炎的治疗。其突出的优点是降酶速度快、毒副作用少、价格便宜。大量实验证实，DDB可以减轻毒性物质引起肝细胞膜的损伤，保护肝细胞内质网结构和功能的完整性。最近的体外实验证实，DDB对HBV的复制具有抑制作用[7-8],与AM联用抗病毒作用增强。而且，崔速南等在临床研究也初步观察到，大剂量DDB具有一定的抗HBV作用。但我们的研究结果提示，对HBV复制型小鼠，单独给予DDB处理，小鼠肝脏中HBV DNA复制中间体和血清中HBV相关抗原水平与对照组相比均无明显差别。而且，结果还提示AM对HBV复制型小鼠体内的病毒复制和表达有抑制作用，但与DDB联用后，抗病毒作用无明显变化。因此，以上结果提示DDB单独使用未能抑制小鼠体内HBV的复制和表达，也未能增强AM的抗HBV作用，与体外的实验结果不同[7-8]。其原因可能如下：该小鼠模型为一短期的HBV复制模型，HBV复制的高峰时间为转染后第3 d，而我们的药物处理持续时间为3 d，可能在如此短的时间内，药物抗HBV的作用尚未显示出来。因此，可使用长期HBV复制模型，延长给药时间，进一步证实该药在体内对HBV是否具有抑制作用。
总之，本研究在体外研究结果的基础上，应用HBV复制小鼠模型进一步在体内证实AM对HBV的复制和表达具有抑制作用，为进一步深入研究和临床应用提供基础。连续3 d给予DDB处理对HBV的复制表达无影响，这需要更进一步的研究，如延长给药时间来证实该药在小鼠体内对HBV是否具有抑制作用。
