本文旨在研究川芎嗪及大鼠结缔组织生长因子(CTGF) miRNA质粒对高糖刺激大鼠肝星状细胞(HSC)的CTGF和转化生长因子-beta (TGF-beta) mRNA表达量、蛋白表达量及Ⅰ型胶原表达量的作用。首先体外培养大鼠HSC以及稳定表达大鼠CTGF miRNA和稳定表达阴性质粒的大鼠HSC,高糖及川芎嗪作用后提取总RNA、总蛋白及收集细胞上清液,检测川芎嗪及大鼠CTGF miRNA质粒对高糖刺激HSC的CTGF、TGF-beta及Ⅰ型胶原表达量。实验结果表明,高糖导致HSC的CTGF mRNA、CTGF蛋白、TGF-beta mRNA、TGF-beta蛋白及Ⅰ型胶原表达量增加(P＜0.05)。川芎嗪组CTGF mRNA、CTGF蛋白、TGF-beta mRNA、TGF-beta蛋白及Ⅰ型胶原的表达量较高糖组低(P＜0.05)。大鼠CTGF miRNA质粒干扰组CTGF mRNA、CTGF蛋白、TGF-beta mRNA、TGF-beta蛋白及Ⅰ型胶原的表达量较高糖组低(P＜0.05)。川芎嗪组与大鼠CTGF miRNA质粒干扰组相比,CTGF mRNA及CTGF蛋白的表达量差异无统计学意义(P＞0.05),川芎嗪组Ⅰ型胶原的表达量明显低于大鼠CTGF miRNA质粒干扰组(P＜0.05)。因此,高糖可刺激CTGF、TGF-beta、Ⅰ型胶原的表达,而川芎嗪、大鼠CTGF miRNA质粒可导致CTGF、TGF-beta、Ⅰ型胶原的表达量下降。
引用本文： 阳宏, 李军, 邢旎旎, 向颖, 沈艳, 李孝生. 川芎嗪及大鼠CTGFmiRNA质粒对高糖刺激肝星状细胞结缔组织生长因子、转化生长因子-beta的影响. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(2): 394-399. doi: 10.7507/1001-5515.20140074 复制
引言
肝纤维化为各种病因如肝炎病毒、乙醇、高糖(葡萄糖浓度大于血糖正常值简称高糖)等的持续作用下导致细胞外基质在肝内大量沉积的病理过程，是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经阶段。肝硬化不可逆，但是肝纤维化为可逆的，故对肝纤维化的发生发展机制、早期诊断、预防及治疗方面的研究一直是肝病学研究的热点之一。多项研究证实了肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纤维化发生发展的中心环节。在各种慢性病因的作用下，肝实质细胞损伤激活HSC，HSC激活后转化为肌成纤维样细胞，产生各种细胞因子如转化生长因子-beta(transforming growth factor-beta，TGF-beta)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)促进肝纤维化的发生发展[1-2]。近年来一些研究发现，高糖是非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、乙型肝炎、丙型肝炎发展为肝纤维化的重要危险因素[3-4]，能促进肝纤维化发生和加重肝纤维化的进展。随着糖尿病发病率的逐渐增高，越来越多的学者加入到探索高糖在肝纤维化发生发展中的作用机制的研究，以期找到预防高糖所致肝纤维化的有效药物。
川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)又称为四甲基吡嗪，是从中药川芎中提取的有效成分，为一种生物碱单体，具有钙拮抗作用、抗氧化作用、抑制细胞凋亡、抗纤维化作用、改善微循环及脑血流的作用，曾应用于脑栓塞、脉管炎、冠心病等疾病的治疗。近年来，川芎嗪抗肝纤维化的作用得到了广泛的认可，本课题组在体外、体内实验也证实川芎嗪对肝纤维化的预防、治疗均有显著效果[5-6]，但对其具体作用机制，尤其对高糖刺激的肝纤维化的作用及机制不够清楚。因此，我们在以往研究基础上，设计本课题以观察川芎嗪及大鼠CTGF miRNA质粒对高糖刺激HSC的CTGF、TGF-beta及Ⅰ型胶原表达的影响，从细胞分子水平探讨防治肝纤维化的作用机制，为探寻防治肝纤维化的新方法提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞
大鼠肝星状细胞(用HSC表示)由重庆医科大学附属第二医院超声研究所实验室惠赠。稳定表达大鼠CTGF miRNA 质粒的大鼠肝星状细胞(用HSC2表示)及稳定表达阴性质粒(阴性质粒即空载质粒中插入非特异性序列，对质粒的基因及蛋白表达无影响，插入的序列位置及碱基数与大鼠CTGF miRNA 质粒相同)的大鼠肝星状细胞(用HSC3表示)为前期实验获得。
1.2 主要试剂
根据大鼠CTGF、TGF-beta、beta-actin基因序列(NCBI编号分别为NM_022266.2，NM_021578.2，NM_031144.2)设计并合成目的基因及内参引物。三种基因引物序列：CTGF(370 bp)：(上游)5′GCCAGGGAGTAAGGGACACG 3′(下游)5′CCCTCCCCTGTCACACTCCAAA 3′；TGF-beta(410 bp)：(上游)5′AGACATCACACACAGTA 3′(下游)5′ AGGTGTTGAGCCCTTTCCAG3′；actin(170 bp)：(上游) 5′GCCCTGGACTTCGAGCAAGA3′(下游)5′TGCCAGGGTACATGGTGGTG3′。其中CTGF、actin引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成，而TGF-beta引用文献序列[9]，上海生工生物工程股份有限公司合成。胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司生产，DMEM低糖培养基购于Hyclone公司，胰酶、EDTA购自美国Amresco公司，葡萄糖购于北京易莱西诺生物科技有限公司，甘露醇为北京北瑞达医药科技有限公司生产，川芎嗪购自哈药集团医药有限公司。Trizol试剂、RT试剂盒、PCR试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司。EB、琼脂糖购于北京昌盛生物技术有限责任公司。哺乳动物蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、0.22 μm孔径的PVDF膜购于北京康为世纪生物科技有限公司，彩色预染Marker购于Fermentas，兔抗大鼠CTGF多克隆抗体为Abcam公司产品，兔抗大鼠TGF-beta多克隆抗体购自上海生工生物工程股份有限公司，小鼠抗大鼠actin、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG购于碧云天生物技术研究所，DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.3 细胞培养
培养细胞(HSC、HSC2、HSC3)用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基，培养于37 ℃、5% CO2培养箱内。细胞贴壁约80%时用胰酶-EDTA(0.05%胰蛋白酶、0.02% EDTA)消化1 min后加含10%胎牛血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞成单个悬浮细胞后于1 000 r/min离心3 min，离心后弃上清液加含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基轻轻吹打混匀后细胞计数，然后各取10万个细胞加入到6孔培养板或培养瓶进一步培养。
1.4 实验分组
参考本课题组前期的研究[5-6]，选用川芎嗪的适宜抑制浓度为200 mg/L进行实验。本实验共分为6个组：① 低糖对照组，HSC加入DMEM低糖培养基，葡萄糖终浓度1.5 g/L；② 高渗对照组，HSC加入DMEM低糖培养基及甘露醇，使得葡萄糖终浓度1.5 g/L、甘露醇终浓度3.0 g/L；③ 高糖组，HSC加入DMEM低糖培养基及葡萄糖，使得葡萄糖终浓度为4.5 g/L；④ 阴性质粒对照组，HSC3加入DMEM低糖培养基及葡萄糖，使得葡萄糖终浓度为4.5 g/L；⑤ 川芎嗪组，HSC加入DMEM低糖培养基、葡萄糖、甘露醇，使得葡萄糖终浓度为4.5 g/L，川芎嗪终浓度为200 mg/L；⑥ 大鼠CTGF miRNA质粒干扰组，HSC2加入DMEM低糖培养基及葡萄糖，使得葡萄糖终浓度为4.5 g/L。葡萄糖、甘露醇、川芎嗪为细胞贴壁后同时加入。
1.5 检测细胞中CTGF、TGF-beta mRNA转录水平
运用RT-PCR法检测细胞中CTGF、TGF-beta基因表达量。按照RNA提取试剂说明书操作步骤，运用Trizol试剂提取高糖及川芎嗪作用24 h后的细胞总RNA，核酸蛋白仪(SmartSpecTM lus)测定RNA浓度后，按照逆转录试剂盒说明书操作，各组取1 μg RNA作为模板进行逆转录，逆转录后的cDNA取相同量进行PCR扩增，扩增条件为94 ℃预变性； 94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s 72 ℃延伸30 s，其中CTGF为25个循环，beta-actin、TGF-beta为30个循环；最后72 ℃延伸2 min补齐末端。 PCR产物经0.5 μg /mL浓度的EB(核酸染色剂)及2%琼脂糖凝胶电泳分离DNA，用Quantity One图像分析仪(美国Biorad公司)进行电泳条带的扫描及条带吸光度分析，目的基因与对应内参beta-actin吸光度的比值作为目的基因表达量。
1.6 检测细胞中CTGF、TGF-beta蛋白表达量
采用Western blot法检测细胞中CTGF、TGF-beta蛋白表达量。按照蛋白提取试剂盒说明书提取收集的各实验组细胞高糖及川芎嗪作用48 h后的总蛋白，然后用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度；于提取的蛋白中加入上样缓冲液混匀后100 ℃加热5 min使蛋白变性。加热变性后蛋白可用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，剩余的于-20 ℃保存。各组分别取50 μg蛋白以4% SDS-PAGE浓缩胶、12%SDS-PAGE分离胶电泳分离不同分子量的蛋白；电泳后250 mA恒流140 min的湿转法使蛋白转至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭2 h后；一抗孵育过夜，TBST洗膜3次,每次15 min；二抗孵育1 h后再次TBST洗膜三次，每次15 min；DAB辣根过氧化物酶显色试剂进行显色，用Image Lab图像分析仪(美国Biorad公司)对蛋白条带扫描、分析。目的蛋白与内参条带灰度比值为蛋白表达的相对含量。
1.7 检测细胞Ⅰ型胶原表达水平
运用ELISA法检测各组细胞的Ⅰ型胶原表达量。按照ELISA试剂盒说明书提取各实验组细胞高糖及川芎嗪作用48 h后的上清液，将待检测的上清液及标准品各100 μL分别加入到酶标板内，每组设6个复孔，然后每个孔内加入50 μL酶标记溶液，于25 ℃孵育90 min后弃上清液，清洗3次，再于各孔内分别加入底物A、B各50 μL，于25 ℃孵育15 min，然后与各孔内加入50 μL的终止液终止反应，运用酶标仪检测492 nm波长的吸光值，对照绘制的标准曲线得出各实验组Ⅰ型胶原表达量。
1.8 统计学分析
采用SPSS17.0软件(美国SPSS公司)进行统计数据处理，实验数据以(
2 结果
2.1 各组CTGF表达量
各组于不同的刺激因素作用24 h后提取RNA行RT-PCR检测 CTGF mRNA表达水平，于不同刺激因素作用48 h后提取总蛋白行Western blot检测 CTGF 蛋白表达水平。各组CTGF mRNA及蛋白表达的电泳结果如图 1、2所示，各组CTGF mRNA及蛋白表达水平如表 1所示。结果显示：高渗对照组与低糖对照组相比差别无统计学意义(P＞0.05)；高糖组表达量比低糖对照组高，且差别有统计学意义(P＜0.05)；高糖组与阴性质粒对照组相比差别无统计学意义(P＞0.05)；川芎嗪组表达量较高糖组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)；大鼠CTGF miRNA干扰组表达量较高糖组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)；川芎嗪组与大鼠CTGF miRNA干扰组相比差别无统计学意义(P＞0.05)。
图1
RT-PCR检测各组CTGF mRNA表达水平
M：marker;1：低糖对照组；2：高渗对照组；3：高糖组；4：阴性质粒对照组；5：川芎嗪组；6：大鼠CTGF miRNA质粒干扰组
Figure1. CTGF mRNA expression levels of each group were detected by RT-PCRM: Marker; 1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3： high glucose group； 4： control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGF miRNA plasmid interference group
图2
Western blot检测各组CTGF蛋白表达水平
1：低糖对照组；2：高渗对照组；3：高糖组；4：阴性质粒对照组；5：川芎嗪组；6：大鼠CTGF miRNA质粒干扰组
Figure2. CTGF protein expression levels of each group were detected by Western blot1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3：high glucose group； 4： control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGF miRNA plasmid interference group
表1
各组CTGF mRNA及蛋白的表达水平(n=6,2.2 各组TGF-beta 表达量
各组于不同的刺激因素作用24 h后提取RNA行RT-PCR检测 TGF-beta mRNA表达水平，于不同刺激因素作用48 h后提取总蛋白行Western blot检测 TGF-beta 蛋白表达水平。各组TGF-beta mRNA及蛋白表达的电泳结果如图 3、4所示，各组TGF-beta mRNA及蛋白表达水平如表 2所示。结果显示：高渗对照组与低糖对照组相比差别无统计学意义(P＞0.05)；高糖组表达量比低糖对照组高，且差别有统计学意义(P＜0.05)；川芎嗪组表达量较高糖组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)；高糖组表达量与阴性质粒组相比差别无统计学意义(P＞0.05)；大鼠CTGF miRNA干扰组表达量较高糖组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)；川芎嗪组大表达量较大鼠CTGF miRNA干扰组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)。
图3
RT-PCR检测各组TGF-beta mRNA表达水平
M：marker; 1：低糖对照组；2：高渗对照组；3：高糖组；4：阴性质粒对照组；5：川芎嗪组；6：大鼠CTGF miRNA质粒干扰组
Figure3. TGF-beta mRNA expression levels of each group were detected by RT-PCRM: Marker; 1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3： high glucose group； 4： control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGF miRNA plasmid interference group
图4
Western blot检测各组TGF-beta蛋白表达水平
1：低糖对照组；2：高渗对照组；3：高糖组；4：阴性质粒对照组；5：川芎嗪组；6：大鼠CTGF miRNA质粒干扰组
Figure4. TGF-beta protein expression levels of each group were detected by Western blot1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3： high glucose group； 4：control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGFmiRNA plasmid interference group
表2
各组TGF-beta mRNA及蛋白的表达水平(n=6,±s)
Table2.
TGF-beta mRNA and protein expression levels of each group(n=6,±s)
2.3 各组Ⅰ型胶原表达量
不同的刺激因素作用48 h后，收集各组上清液，通过ELISA法检测上清液Ⅰ型胶原表达量，结果如表 3所示。Ⅰ型胶原检测结果显示：高渗对照组与低糖对照组相比差别无统计学意义(P＞0.05)，高糖组表达量比低糖对照组高，且差别有统计学意义(P＜0.05)；高糖组表达量与阴性质粒对照组相比差别无统计学意义(P＞0.05)，川芎嗪组表达量比高糖组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)；大鼠CTGF miRNA质粒干扰组表达量比高糖组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)；川芎嗪组表达量较大鼠CTGF miRNA干扰组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)。
表3
各组I型胶原的表达水平(n=6,3 讨论
CTGF为近期新发现的致纤维化的重要细胞因子，在肝纤维化、肺纤维化及肾纤维化等各种器官的纤维化中均起着非常重要的作用[7-8]。在正常的生理状况下，CTGF的表达量较低，且主要在间质细胞中表达，主要作用也限于结缔组织。但在肝纤维化过程中，CTGF可在各种细胞因子及有害因素的刺激下表达增加，主要刺激因素有TGF-beta、血管内皮生长因子、脂质过氧化产物如丙二醛、乙醛、高糖及血小板衍生因子，其中以TGF-beta刺激作用最强，经刺激后CTGF主要表现为促进血管平滑肌细胞增生、刺激细胞外基质合成及抑制细胞外基质的降解，使细胞外基质在肝内过度沉积，从而导致纤维化[9-10]。
TGF-beta在肝纤维化的发生发展中也起着重要的作用，在各种慢性肝损伤时，TGF-beta持续过度表达，可促进HSC活化、增殖并分泌大量细胞外基质成分，从而促进肝纤维化的形成。此外，TGF-beta还可以上调CTGF表达。CTGF作为TGF-beta的下游效应介质，可促进Ⅰ、Ⅲ型胶原特别是Ⅰ型胶原显著增加，特异性地介导TGF-beta的促纤维化效应[8]。但是，TGF-beta的生物学作用除了促进肝纤维化外，还有其他重要的抗炎、调节免疫等作用，完全阻断TGF-beta虽可以抗纤维化，但还可能出现其他的全身炎症反应、免疫抑制异常等不良后果，而且除了TGF-beta外还有其他的刺激因素如脂质过氧化物、高糖等均可导致CTGF表达增多，故下调CTGF的表达成为抗肝纤维化的研究重点。微小RNA干扰(miRNA)是近年发展起来的一项新兴分子生物学技术，可高效、特异地下调细胞中基因的表达，可用于抗肝纤维化药物的作用机制研究[11-12]。
本实验显示高糖组CTGF、TGF-beta的表达量较低糖对照组高，川芎嗪组及大鼠CTGF miRNA质粒干扰组CTGF、TGF-beta和Ⅰ型胶原的表达量较高糖组低，由此推论川芎嗪可能通过抑制CTGF、TGF-beta的表达，从而阻断Ⅰ型胶原的合成，发挥抗高糖刺激的肝纤维化效应，这可能是其抗肝纤维化的一个重要分子机制。本实验还发现，大鼠CTGF miRNA干扰组CTGF的表达量与川芎嗪组相比，差别无统计学意义，而川芎嗪组Ⅰ型胶原表达量比大鼠CTGF miRNA干扰组低，且差别有统计学意义，由此推论川芎嗪下调Ⅰ型胶原表达量的作用机制可能不只通过下调TGF、CTGF途径，还有其他的机制，但具体什么作用机制有待进一步研究。
引言
肝纤维化为各种病因如肝炎病毒、乙醇、高糖(葡萄糖浓度大于血糖正常值简称高糖)等的持续作用下导致细胞外基质在肝内大量沉积的病理过程，是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经阶段。肝硬化不可逆，但是肝纤维化为可逆的，故对肝纤维化的发生发展机制、早期诊断、预防及治疗方面的研究一直是肝病学研究的热点之一。多项研究证实了肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纤维化发生发展的中心环节。在各种慢性病因的作用下，肝实质细胞损伤激活HSC，HSC激活后转化为肌成纤维样细胞，产生各种细胞因子如转化生长因子-beta(transforming growth factor-beta，TGF-beta)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)促进肝纤维化的发生发展[1-2]。近年来一些研究发现，高糖是非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、乙型肝炎、丙型肝炎发展为肝纤维化的重要危险因素[3-4]，能促进肝纤维化发生和加重肝纤维化的进展。随着糖尿病发病率的逐渐增高，越来越多的学者加入到探索高糖在肝纤维化发生发展中的作用机制的研究，以期找到预防高糖所致肝纤维化的有效药物。
川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)又称为四甲基吡嗪，是从中药川芎中提取的有效成分，为一种生物碱单体，具有钙拮抗作用、抗氧化作用、抑制细胞凋亡、抗纤维化作用、改善微循环及脑血流的作用，曾应用于脑栓塞、脉管炎、冠心病等疾病的治疗。近年来，川芎嗪抗肝纤维化的作用得到了广泛的认可，本课题组在体外、体内实验也证实川芎嗪对肝纤维化的预防、治疗均有显著效果[5-6]，但对其具体作用机制，尤其对高糖刺激的肝纤维化的作用及机制不够清楚。因此，我们在以往研究基础上，设计本课题以观察川芎嗪及大鼠CTGF miRNA质粒对高糖刺激HSC的CTGF、TGF-beta及Ⅰ型胶原表达的影响，从细胞分子水平探讨防治肝纤维化的作用机制，为探寻防治肝纤维化的新方法提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞
大鼠肝星状细胞(用HSC表示)由重庆医科大学附属第二医院超声研究所实验室惠赠。稳定表达大鼠CTGF miRNA 质粒的大鼠肝星状细胞(用HSC2表示)及稳定表达阴性质粒(阴性质粒即空载质粒中插入非特异性序列，对质粒的基因及蛋白表达无影响，插入的序列位置及碱基数与大鼠CTGF miRNA 质粒相同)的大鼠肝星状细胞(用HSC3表示)为前期实验获得。
1.2 主要试剂
根据大鼠CTGF、TGF-beta、beta-actin基因序列(NCBI编号分别为NM_022266.2，NM_021578.2，NM_031144.2)设计并合成目的基因及内参引物。三种基因引物序列：CTGF(370 bp)：(上游)5′GCCAGGGAGTAAGGGACACG 3′(下游)5′CCCTCCCCTGTCACACTCCAAA 3′；TGF-beta(410 bp)：(上游)5′AGACATCACACACAGTA 3′(下游)5′ AGGTGTTGAGCCCTTTCCAG3′；actin(170 bp)：(上游) 5′GCCCTGGACTTCGAGCAAGA3′(下游)5′TGCCAGGGTACATGGTGGTG3′。其中CTGF、actin引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成，而TGF-beta引用文献序列[9]，上海生工生物工程股份有限公司合成。胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司生产，DMEM低糖培养基购于Hyclone公司，胰酶、EDTA购自美国Amresco公司，葡萄糖购于北京易莱西诺生物科技有限公司，甘露醇为北京北瑞达医药科技有限公司生产，川芎嗪购自哈药集团医药有限公司。Trizol试剂、RT试剂盒、PCR试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司。EB、琼脂糖购于北京昌盛生物技术有限责任公司。哺乳动物蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、0.22 μm孔径的PVDF膜购于北京康为世纪生物科技有限公司，彩色预染Marker购于Fermentas，兔抗大鼠CTGF多克隆抗体为Abcam公司产品，兔抗大鼠TGF-beta多克隆抗体购自上海生工生物工程股份有限公司，小鼠抗大鼠actin、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG购于碧云天生物技术研究所，DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.3 细胞培养
培养细胞(HSC、HSC2、HSC3)用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基，培养于37 ℃、5% CO2培养箱内。细胞贴壁约80%时用胰酶-EDTA(0.05%胰蛋白酶、0.02% EDTA)消化1 min后加含10%胎牛血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞成单个悬浮细胞后于1 000 r/min离心3 min，离心后弃上清液加含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基轻轻吹打混匀后细胞计数，然后各取10万个细胞加入到6孔培养板或培养瓶进一步培养。
1.4 实验分组
参考本课题组前期的研究[5-6]，选用川芎嗪的适宜抑制浓度为200 mg/L进行实验。本实验共分为6个组：① 低糖对照组，HSC加入DMEM低糖培养基，葡萄糖终浓度1.5 g/L；② 高渗对照组，HSC加入DMEM低糖培养基及甘露醇，使得葡萄糖终浓度1.5 g/L、甘露醇终浓度3.0 g/L；③ 高糖组，HSC加入DMEM低糖培养基及葡萄糖，使得葡萄糖终浓度为4.5 g/L；④ 阴性质粒对照组，HSC3加入DMEM低糖培养基及葡萄糖，使得葡萄糖终浓度为4.5 g/L；⑤ 川芎嗪组，HSC加入DMEM低糖培养基、葡萄糖、甘露醇，使得葡萄糖终浓度为4.5 g/L，川芎嗪终浓度为200 mg/L；⑥ 大鼠CTGF miRNA质粒干扰组，HSC2加入DMEM低糖培养基及葡萄糖，使得葡萄糖终浓度为4.5 g/L。葡萄糖、甘露醇、川芎嗪为细胞贴壁后同时加入。
1.5 检测细胞中CTGF、TGF-beta mRNA转录水平
运用RT-PCR法检测细胞中CTGF、TGF-beta基因表达量。按照RNA提取试剂说明书操作步骤，运用Trizol试剂提取高糖及川芎嗪作用24 h后的细胞总RNA，核酸蛋白仪(SmartSpecTM lus)测定RNA浓度后，按照逆转录试剂盒说明书操作，各组取1 μg RNA作为模板进行逆转录，逆转录后的cDNA取相同量进行PCR扩增，扩增条件为94 ℃预变性； 94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s 72 ℃延伸30 s，其中CTGF为25个循环，beta-actin、TGF-beta为30个循环；最后72 ℃延伸2 min补齐末端。 PCR产物经0.5 μg /mL浓度的EB(核酸染色剂)及2%琼脂糖凝胶电泳分离DNA，用Quantity One图像分析仪(美国Biorad公司)进行电泳条带的扫描及条带吸光度分析，目的基因与对应内参beta-actin吸光度的比值作为目的基因表达量。
1.6 检测细胞中CTGF、TGF-beta蛋白表达量
采用Western blot法检测细胞中CTGF、TGF-beta蛋白表达量。按照蛋白提取试剂盒说明书提取收集的各实验组细胞高糖及川芎嗪作用48 h后的总蛋白，然后用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度；于提取的蛋白中加入上样缓冲液混匀后100 ℃加热5 min使蛋白变性。加热变性后蛋白可用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，剩余的于-20 ℃保存。各组分别取50 μg蛋白以4% SDS-PAGE浓缩胶、12%SDS-PAGE分离胶电泳分离不同分子量的蛋白；电泳后250 mA恒流140 min的湿转法使蛋白转至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭2 h后；一抗孵育过夜，TBST洗膜3次,每次15 min；二抗孵育1 h后再次TBST洗膜三次，每次15 min；DAB辣根过氧化物酶显色试剂进行显色，用Image Lab图像分析仪(美国Biorad公司)对蛋白条带扫描、分析。目的蛋白与内参条带灰度比值为蛋白表达的相对含量。
1.7 检测细胞Ⅰ型胶原表达水平
运用ELISA法检测各组细胞的Ⅰ型胶原表达量。按照ELISA试剂盒说明书提取各实验组细胞高糖及川芎嗪作用48 h后的上清液，将待检测的上清液及标准品各100 μL分别加入到酶标板内，每组设6个复孔，然后每个孔内加入50 μL酶标记溶液，于25 ℃孵育90 min后弃上清液，清洗3次，再于各孔内分别加入底物A、B各50 μL，于25 ℃孵育15 min，然后与各孔内加入50 μL的终止液终止反应，运用酶标仪检测492 nm波长的吸光值，对照绘制的标准曲线得出各实验组Ⅰ型胶原表达量。
1.8 统计学分析
采用SPSS17.0软件(美国SPSS公司)进行统计数据处理，实验数据以(
2 结果
2.1 各组CTGF表达量
各组于不同的刺激因素作用24 h后提取RNA行RT-PCR检测 CTGF mRNA表达水平，于不同刺激因素作用48 h后提取总蛋白行Western blot检测 CTGF 蛋白表达水平。各组CTGF mRNA及蛋白表达的电泳结果如图 1、2所示，各组CTGF mRNA及蛋白表达水平如表 1所示。结果显示：高渗对照组与低糖对照组相比差别无统计学意义(P＞0.05)；高糖组表达量比低糖对照组高，且差别有统计学意义(P＜0.05)；高糖组与阴性质粒对照组相比差别无统计学意义(P＞0.05)；川芎嗪组表达量较高糖组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)；大鼠CTGF miRNA干扰组表达量较高糖组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)；川芎嗪组与大鼠CTGF miRNA干扰组相比差别无统计学意义(P＞0.05)。
图1
RT-PCR检测各组CTGF mRNA表达水平
M：marker;1：低糖对照组；2：高渗对照组；3：高糖组；4：阴性质粒对照组；5：川芎嗪组；6：大鼠CTGF miRNA质粒干扰组
Figure1. CTGF mRNA expression levels of each group were detected by RT-PCRM: Marker; 1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3： high glucose group； 4： control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGF miRNA plasmid interference group
图2
Western blot检测各组CTGF蛋白表达水平
1：低糖对照组；2：高渗对照组；3：高糖组；4：阴性质粒对照组；5：川芎嗪组；6：大鼠CTGF miRNA质粒干扰组
Figure2. CTGF protein expression levels of each group were detected by Western blot1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3：high glucose group； 4： control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGF miRNA plasmid interference group
表1
各组CTGF mRNA及蛋白的表达水平(n=6,2.2 各组TGF-beta 表达量
各组于不同的刺激因素作用24 h后提取RNA行RT-PCR检测 TGF-beta mRNA表达水平，于不同刺激因素作用48 h后提取总蛋白行Western blot检测 TGF-beta 蛋白表达水平。各组TGF-beta mRNA及蛋白表达的电泳结果如图 3、4所示，各组TGF-beta mRNA及蛋白表达水平如表 2所示。结果显示：高渗对照组与低糖对照组相比差别无统计学意义(P＞0.05)；高糖组表达量比低糖对照组高，且差别有统计学意义(P＜0.05)；川芎嗪组表达量较高糖组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)；高糖组表达量与阴性质粒组相比差别无统计学意义(P＞0.05)；大鼠CTGF miRNA干扰组表达量较高糖组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)；川芎嗪组大表达量较大鼠CTGF miRNA干扰组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)。
图3
RT-PCR检测各组TGF-beta mRNA表达水平
M：marker; 1：低糖对照组；2：高渗对照组；3：高糖组；4：阴性质粒对照组；5：川芎嗪组；6：大鼠CTGF miRNA质粒干扰组
Figure3. TGF-beta mRNA expression levels of each group were detected by RT-PCRM: Marker; 1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3： high glucose group； 4： control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGF miRNA plasmid interference group
图4
Western blot检测各组TGF-beta蛋白表达水平
1：低糖对照组；2：高渗对照组；3：高糖组；4：阴性质粒对照组；5：川芎嗪组；6：大鼠CTGF miRNA质粒干扰组
Figure4. TGF-beta protein expression levels of each group were detected by Western blot1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3： high glucose group； 4：control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGFmiRNA plasmid interference group
表2
各组TGF-beta mRNA及蛋白的表达水平(n=6,±s)
Table2.
TGF-beta mRNA and protein expression levels of each group(n=6,±s)
2.3 各组Ⅰ型胶原表达量
不同的刺激因素作用48 h后，收集各组上清液，通过ELISA法检测上清液Ⅰ型胶原表达量，结果如表 3所示。Ⅰ型胶原检测结果显示：高渗对照组与低糖对照组相比差别无统计学意义(P＞0.05)，高糖组表达量比低糖对照组高，且差别有统计学意义(P＜0.05)；高糖组表达量与阴性质粒对照组相比差别无统计学意义(P＞0.05)，川芎嗪组表达量比高糖组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)；大鼠CTGF miRNA质粒干扰组表达量比高糖组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)；川芎嗪组表达量较大鼠CTGF miRNA干扰组低，且差别有统计学意义(P＜0.05)。
表3
各组I型胶原的表达水平(n=6,3 讨论
CTGF为近期新发现的致纤维化的重要细胞因子，在肝纤维化、肺纤维化及肾纤维化等各种器官的纤维化中均起着非常重要的作用[7-8]。在正常的生理状况下，CTGF的表达量较低，且主要在间质细胞中表达，主要作用也限于结缔组织。但在肝纤维化过程中，CTGF可在各种细胞因子及有害因素的刺激下表达增加，主要刺激因素有TGF-beta、血管内皮生长因子、脂质过氧化产物如丙二醛、乙醛、高糖及血小板衍生因子，其中以TGF-beta刺激作用最强，经刺激后CTGF主要表现为促进血管平滑肌细胞增生、刺激细胞外基质合成及抑制细胞外基质的降解，使细胞外基质在肝内过度沉积，从而导致纤维化[9-10]。
TGF-beta在肝纤维化的发生发展中也起着重要的作用，在各种慢性肝损伤时，TGF-beta持续过度表达，可促进HSC活化、增殖并分泌大量细胞外基质成分，从而促进肝纤维化的形成。此外，TGF-beta还可以上调CTGF表达。CTGF作为TGF-beta的下游效应介质，可促进Ⅰ、Ⅲ型胶原特别是Ⅰ型胶原显著增加，特异性地介导TGF-beta的促纤维化效应[8]。但是，TGF-beta的生物学作用除了促进肝纤维化外，还有其他重要的抗炎、调节免疫等作用，完全阻断TGF-beta虽可以抗纤维化，但还可能出现其他的全身炎症反应、免疫抑制异常等不良后果，而且除了TGF-beta外还有其他的刺激因素如脂质过氧化物、高糖等均可导致CTGF表达增多，故下调CTGF的表达成为抗肝纤维化的研究重点。微小RNA干扰(miRNA)是近年发展起来的一项新兴分子生物学技术，可高效、特异地下调细胞中基因的表达，可用于抗肝纤维化药物的作用机制研究[11-12]。
本实验显示高糖组CTGF、TGF-beta的表达量较低糖对照组高，川芎嗪组及大鼠CTGF miRNA质粒干扰组CTGF、TGF-beta和Ⅰ型胶原的表达量较高糖组低，由此推论川芎嗪可能通过抑制CTGF、TGF-beta的表达，从而阻断Ⅰ型胶原的合成，发挥抗高糖刺激的肝纤维化效应，这可能是其抗肝纤维化的一个重要分子机制。本实验还发现，大鼠CTGF miRNA干扰组CTGF的表达量与川芎嗪组相比，差别无统计学意义，而川芎嗪组Ⅰ型胶原表达量比大鼠CTGF miRNA干扰组低，且差别有统计学意义，由此推论川芎嗪下调Ⅰ型胶原表达量的作用机制可能不只通过下调TGF、CTGF途径，还有其他的机制，但具体什么作用机制有待进一步研究。
