引用本文： 邢小丽, 黄亮瑜, 苏睿虹, 刘勋, 赵今稚, 高美子, 张晓敏, 李筱荣, 东莉洁. 丁基苯酞对过氧化氢诱导下视网膜Müller细胞凋亡的影响. 中华眼底病杂志, 2018, 34(5): 481-486. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.05.014 复制
氧化应激可破坏视网膜Müller细胞膜屏障，严重时甚至引起细胞死亡。Müller细胞损伤可导致谷氨酸积累，阻碍血管调节，以致血视网膜屏障损伤[1, 2]。丁基苯酞（NBP）是我国具有自主知识产权的药物，可作用于缺血性脑卒中所致脑损伤、脊髓损伤的多个病理环节，减轻神经功能损伤程度[3-5]。研究表明，NBP在抑制缺血缺氧、细胞凋亡及氧自由基产生等方面保护神经细胞免受氧化应激损伤[6, 7]。但目前用于神经胶质细胞保护作用研究鲜见报道。为此，我们将NBP引入Müller细胞氧化应激模型，以观察NBP对氧化应激损伤的Müller细胞的保护作用，旨在为寻找Müller细胞保护药物提供实验基础。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人Müller细胞系（MIO-M1）由天津医科大学眼科医院柯屹峰老师惠赠。NBP（石药集团有限公司）；LIVE/DEAD®细胞活性/细胞毒性检测试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]，Hoechst 33258染色剂（上海翊圣生物科技有限公司），噻唑蓝（MTT）（北京索莱宝科技有限公司），2’, 7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，美国Sigma公司），内质网（ER）红色荧光探针（ER-Tracker Red，上海碧云天生物技术有限公司）。兔抗鼠谷氨酰胺合成酶（GS）单克隆抗体（美国Abcam公司），4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美国英杰生命技术有限公司），山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor® 488，ab150077，美国Abcam公司) ，Olymplus荧光显微镜（BX51，日本Olympus公司）。
1.2 方法
参照文献[8]的方法培养Müller细胞，取对数生长期细胞用于实验。
免疫荧光染色法鉴定Müller细胞，GS抗体、GFAP抗体和DAPI染色观察Müller细胞形态。Müller细胞以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，4%多聚甲醛固定在盖玻片上10 min，加入含0.1%Triton X-100的PBS通透10 min，牛血清白蛋白室温下封闭30 min。细胞与GS抗体、GFAP抗体在4 ℃湿盒中孵育过夜。PBS洗涤盖玻片，加入山羊抗兔二抗在室温下孵育2 h。PBS洗涤后，DAPI染色，滴加适量的抗荧光淬灭剂于细胞上，荧光显微镜下观察。
纯化的Müller细胞分为正常对照组、模型组（H2O2组）、实验组（H2O2+NBP组）。H2O2组、H2O2+NBP组细胞培养液中加入200 μmol/L H2O2刺激2 h后，H2O2组更换为完全培养基，H2O2+NBP组更换为含1 μmol/L NBP的完全培养基。正常对照组为常规培养细胞。
苏木精-伊红（HE）染色观察正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组Müller细胞形态改变。各组细胞以3.0×104个/孔的细胞密度接种于24孔板，常规HE染色后光学显微镜观察拍照。
MTT比色法检测正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞活性。各组细胞以3.5×104个/孔的细胞密度接种于96孔板，细胞融合至70%～80%时，H2O2+NBP组更换为含1 μmol/L NBP的完全培养基作用24、48 h。各组细胞加入MTT孵育4 h后吸除原液，加入150 μl二甲基亚砜，室温静置10 min，酶联免疫检测仪490 nm波长处读取吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。每组设定3个副孔，实验重复进行3次，取平均值。
Hoechst33258染色观察正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞凋亡情况。各组细胞以3.5×104个/孔的细胞密度接种于96孔板，加入1 μg/ml Hoechst33258，2 h后中止，荧光显微镜下观察各组细胞形态。每组设定3个副孔，实验重复3次。
LIVE/DEAD®细胞活性/细胞毒性试剂盒检测正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞生存力。各组细胞以3.5×104个/孔的细胞密度接种于96孔板，继续培养24 h，每孔加入30 μl配制的Live/Dead染色剂溶液，室温静置30 min，终止染色，PBS清洗。每组设3个副孔，实验重复3次。细胞荧光显微镜观察拍照，活细胞呈绿色荧光，死亡细胞呈红色荧光。
DCFH-DA+ER-Tracker Red双染色观察正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞ER中活性氧（ROS）的表达水平。各组细胞以3.5×104个/孔的细胞密度接种于96孔板，每孔加入30 μl配制的ER-Tracker RED和DCFH-DA染色剂溶液，避光孵育20 min，PBS清洗。每组设3个副孔，实验重复进行3次。细胞荧光显微镜观察拍照，ER-Tracker Red染色呈红色荧光示踪ER；DCFH-DA染色ROS呈绿色荧光。
1.3 统计学方法
采用SPSS18.0软件行统计分析。数据分析选择单因素方差分析联合Dunnett统计学方法，即首先对数据进行方差齐性检验，再利用Dunnett进行各组之间的两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。经Graphprism软件对所获得数据进行图表整理。
2 结果
倒置相差显微镜观察发现，培养的Müller细胞呈长梭形交织生长。荧光显微镜观察发现，95%以上Müller细胞GFAP（图1）、GS（图2）染色阳性；细胞体大，细胞浆丰富，绿色荧光均匀一致；DAPI标记的细胞核呈圆形或卵圆形，边界清晰，蓝色荧光均匀一致。
图1
Müller细胞荧光显微镜像。1A. GFAP标记的细胞质及细胞核呈绿色荧光。1B. DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光。1C. 共定位，培养的Müller细胞，形态规则，呈长梭形交织生长；染色阳性率＞95% 标尺：100 μm
图2
Müller细胞荧光显微镜像。2A. GS标记的细胞质及细胞核呈绿色荧光。2B. DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光。2C. 共定位，培养的Müller细胞，形态规则，呈长梭形交织生长；染色阳性率＞95% 标尺：100 μm
光学显微镜观察发现，正常对照组细胞呈长梭形，胞质边界清晰、形态均一；H2O2组细胞数量减少，细胞形态狭长，细胞核浓缩，细胞质减少； H2O2+NBP组细胞数量较H2O2组增加，较正常对照组减少，细胞质边界清晰，部分细胞呈长梭形（图3）。
图3
各组细胞光学显微镜像。3A～3C. 分别为正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组。正常对照组细胞呈长梭形，细胞质边界清晰；H2O2组细胞数量较正常对照组少，细胞核浓缩，细胞质减少；H2O2+NBP组细胞数量较正常对照组减少，但比H2O2组增多，细胞核较正常对照组略减小，较H2O2组细胞核大，细胞质多 HE 标尺: 100 μm
MTT比色法检测结果显示，NBP作用24 h后，正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞生存力分别为0.97±0.05、0.16±0.01、0.33±0.08；正常对照组与H2O2组、H2O2组与H2O2+NBP组细胞生存力比较，差异均有统计学意义（t=28.96、3.658，P＜0.001、0.022）。48 h后，正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞生存力分别为1.35±0.03、0.45±0.03、0.92±0.05；正常对照组与H2O2组、H2O2组与H2O2+NBP组Müller细胞生存力比较，差异均有统计学意义（t=47.58、20.33，P＜0.001、＜0.001）（图4）。
图4
正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞生存力比较。4A. 24 h；4B. 48 h。*P＜0.05；##P＜0.001
荧光显微镜观察结果显示，正常对照组细胞核蓝色荧光均匀一致，形态完整；H2O2组细胞的细胞核固缩、碎裂，蓝色荧光增强；H2O2+NBP组细胞少数细胞核边集呈新月状且细胞核碎裂减少，其余细胞蓝色荧光均匀（图5）。
图5
各组细胞荧光显微镜像。5A～5C. 分别为正常对照组、H2O2组、H2O2＋NBP组。正常对照组细胞染色呈圆形，蓝色荧光均匀一致；H2O2组细胞浓集呈亮蓝色，部分为碎片状（白箭）；H2O2＋NBP组仅少数细胞呈亮蓝色（白箭），其余细胞蓝色荧光均匀 Hoechst33258标尺：100 μm
细胞荧光显微镜观察发现，正常对照组细胞呈绿色荧光；H2O2组中可见较多呈红色荧光的死亡细胞，呈绿色荧光的活细胞数量显著减少；H2O2+NBP组呈绿色荧光的活细胞数量增多，红色荧光的死亡细胞减少（图6）。
图6
各组细胞荧光显微镜像。6A～6C. 分别为正常对照组、H2O2组、H2O2＋NBP组。正常对照组细胞呈绿色荧光；H2O2组细胞中红色荧光增多；H2O2+NBP组细胞中红色荧光显著减少 标尺：100 μm
细胞荧光显微镜观察发现，正常对照组细胞ER中隐约可见绿色荧光；H2O2组细胞ER中绿色荧光强度明显增强；H2O2+NBP组细胞ER中绿色荧光强度较H2O2组明显降低（图7）。
图7
各组细胞ROS＋ER荧光共定位像。7A. 正常对照组细胞ER中隐约可见绿色荧光；7B. H2O2组细胞ER中绿色荧光强度明显增强；7C. H2O2＋NBP组细胞ER中绿色荧光强度较H2O2组明显降低。绿色荧光为DCFH-DA标记的ROS，红色荧光为ER-Tracker Red示踪的ER标尺：100 μm
3 讨论
Müller细胞是贯穿于全层视网膜的大神经胶质细胞，主要负责视网膜保护、营养及代谢、调节神经递质等。有研究表明，Müller细胞在很多眼缺血性疾病早期就出现形态及功能的变化。本研究结果显示，Müller细胞在H2O2的刺激下，产生凋亡的一系列病理生理改变，模拟眼缺血性疾病早期出现的缺血缺氧状态，在此基础之上研究其可能的机制，为今后疾病的治疗开拓新的思路。
NBP国内主要用于缺血性脑卒中的治疗。大量研究表明，NBP可在抑制缺血缺氧、细胞凋亡、氧自由基产生等多个环节起到保护神经细胞免受氧化应激损伤的作用[9, 10]。
本研究结果显示，经H2O2刺激后Müller细胞数量减少，形态呈长梭形，细胞质浓缩；细胞生存力下降。提示H2O2刺激导致细胞受损以及细胞凋亡程序的启动。加入NBP作用后，细胞数量较H2O2组明显增加，细胞质边界清晰，部分细胞呈长梭形，细胞生存力提高；缓解了H2O2诱导的细胞氧化损伤。提示NBP是Müller细胞凋亡的潜在保护因子。
ROS包括超氧自由基、过氧化氢及其下游产物过氧化物和羟化物等，可参与细胞生长增生、发育分化、衰老和凋亡等生理及病理过程。为初步了解抑制H2O2诱导的Müller细胞凋亡的途径，本研究应用DCFH-DA检测NBP高表达对H2O2诱导的Müller细胞ER中ROS的表达影响。结果发现，H2O2刺激后Müller细胞的ROS水平明显增高，而给予NBP作用后，细胞中ROS水平显著下降。提示NBP可抑制氧化应激水平。
ER是真核细胞中分泌和折叠合成蛋白及膜结合蛋白的的重要亚细胞器，在许多神经疾病中起着至关重要的作用，如神经退行性疾病、硬化症和脑缺血等[11]。研究显示，ER应激在糖尿病视网膜病变中有重要作用[12, 13]。为明确H2O2诱导的氧化应激是否与ER应激存在潜在联系，本研究采用ER-Tracker染色，观察细胞ER中ROS表达情况。ER-Tracker Red是一种ER红色荧光探针，可以用于活细胞ER特异性荧光染色。DCFH-DA本身没有荧光，可以穿过细胞膜，进入细胞内后被细胞内的酯酶水解生成DCFH。在ROS存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，检测荧光DCF可了解细胞内ROS水平。绿色荧光的强度与细胞内ROS水平成正比。结果显示，NBP作用后可有效缓解ER中ROS的堆积，进而下调ER应激水平。Zheng等[5]发现NBP可以在脊髓损伤后，抑制ER应激。本研究结果与此一致。
既往对NBP的研究主要集中于神经系统，如脑缺血、脊髓损伤等[7-9]。NBP是一种多靶点的神经保护剂，可以显著降低氧化损伤，改善线粒体功能，减少神经元的凋亡，并可抑制炎症反应。最近研究表明，NBP在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型中可抑制白内障形成，降低血糖[14]。其机制是减少ROS、丙二醛等氧化应激指标。
本研究仅对NBP在体外培养的Müller细胞氧化应激条件下作用进行初步探讨，今后尚需对NBP作用下Müller抗氧化应激机制，Müller与视网膜神经节细胞之间的相互作用以及分子机制等进行深入研究。
氧化应激可破坏视网膜Müller细胞膜屏障，严重时甚至引起细胞死亡。Müller细胞损伤可导致谷氨酸积累，阻碍血管调节，以致血视网膜屏障损伤[1, 2]。丁基苯酞（NBP）是我国具有自主知识产权的药物，可作用于缺血性脑卒中所致脑损伤、脊髓损伤的多个病理环节，减轻神经功能损伤程度[3-5]。研究表明，NBP在抑制缺血缺氧、细胞凋亡及氧自由基产生等方面保护神经细胞免受氧化应激损伤[6, 7]。但目前用于神经胶质细胞保护作用研究鲜见报道。为此，我们将NBP引入Müller细胞氧化应激模型，以观察NBP对氧化应激损伤的Müller细胞的保护作用，旨在为寻找Müller细胞保护药物提供实验基础。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人Müller细胞系（MIO-M1）由天津医科大学眼科医院柯屹峰老师惠赠。NBP（石药集团有限公司）；LIVE/DEAD®细胞活性/细胞毒性检测试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]，Hoechst 33258染色剂（上海翊圣生物科技有限公司），噻唑蓝（MTT）（北京索莱宝科技有限公司），2’, 7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，美国Sigma公司），内质网（ER）红色荧光探针（ER-Tracker Red，上海碧云天生物技术有限公司）。兔抗鼠谷氨酰胺合成酶（GS）单克隆抗体（美国Abcam公司），4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美国英杰生命技术有限公司），山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor® 488，ab150077，美国Abcam公司) ，Olymplus荧光显微镜（BX51，日本Olympus公司）。
1.2 方法
参照文献[8]的方法培养Müller细胞，取对数生长期细胞用于实验。
免疫荧光染色法鉴定Müller细胞，GS抗体、GFAP抗体和DAPI染色观察Müller细胞形态。Müller细胞以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，4%多聚甲醛固定在盖玻片上10 min，加入含0.1%Triton X-100的PBS通透10 min，牛血清白蛋白室温下封闭30 min。细胞与GS抗体、GFAP抗体在4 ℃湿盒中孵育过夜。PBS洗涤盖玻片，加入山羊抗兔二抗在室温下孵育2 h。PBS洗涤后，DAPI染色，滴加适量的抗荧光淬灭剂于细胞上，荧光显微镜下观察。
纯化的Müller细胞分为正常对照组、模型组（H2O2组）、实验组（H2O2+NBP组）。H2O2组、H2O2+NBP组细胞培养液中加入200 μmol/L H2O2刺激2 h后，H2O2组更换为完全培养基，H2O2+NBP组更换为含1 μmol/L NBP的完全培养基。正常对照组为常规培养细胞。
苏木精-伊红（HE）染色观察正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组Müller细胞形态改变。各组细胞以3.0×104个/孔的细胞密度接种于24孔板，常规HE染色后光学显微镜观察拍照。
MTT比色法检测正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞活性。各组细胞以3.5×104个/孔的细胞密度接种于96孔板，细胞融合至70%～80%时，H2O2+NBP组更换为含1 μmol/L NBP的完全培养基作用24、48 h。各组细胞加入MTT孵育4 h后吸除原液，加入150 μl二甲基亚砜，室温静置10 min，酶联免疫检测仪490 nm波长处读取吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。每组设定3个副孔，实验重复进行3次，取平均值。
Hoechst33258染色观察正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞凋亡情况。各组细胞以3.5×104个/孔的细胞密度接种于96孔板，加入1 μg/ml Hoechst33258，2 h后中止，荧光显微镜下观察各组细胞形态。每组设定3个副孔，实验重复3次。
LIVE/DEAD®细胞活性/细胞毒性试剂盒检测正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞生存力。各组细胞以3.5×104个/孔的细胞密度接种于96孔板，继续培养24 h，每孔加入30 μl配制的Live/Dead染色剂溶液，室温静置30 min，终止染色，PBS清洗。每组设3个副孔，实验重复3次。细胞荧光显微镜观察拍照，活细胞呈绿色荧光，死亡细胞呈红色荧光。
DCFH-DA+ER-Tracker Red双染色观察正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞ER中活性氧（ROS）的表达水平。各组细胞以3.5×104个/孔的细胞密度接种于96孔板，每孔加入30 μl配制的ER-Tracker RED和DCFH-DA染色剂溶液，避光孵育20 min，PBS清洗。每组设3个副孔，实验重复进行3次。细胞荧光显微镜观察拍照，ER-Tracker Red染色呈红色荧光示踪ER；DCFH-DA染色ROS呈绿色荧光。
1.3 统计学方法
采用SPSS18.0软件行统计分析。数据分析选择单因素方差分析联合Dunnett统计学方法，即首先对数据进行方差齐性检验，再利用Dunnett进行各组之间的两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。经Graphprism软件对所获得数据进行图表整理。
2 结果
倒置相差显微镜观察发现，培养的Müller细胞呈长梭形交织生长。荧光显微镜观察发现，95%以上Müller细胞GFAP（图1）、GS（图2）染色阳性；细胞体大，细胞浆丰富，绿色荧光均匀一致；DAPI标记的细胞核呈圆形或卵圆形，边界清晰，蓝色荧光均匀一致。
图1
Müller细胞荧光显微镜像。1A. GFAP标记的细胞质及细胞核呈绿色荧光。1B. DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光。1C. 共定位，培养的Müller细胞，形态规则，呈长梭形交织生长；染色阳性率＞95% 标尺：100 μm
图2
Müller细胞荧光显微镜像。2A. GS标记的细胞质及细胞核呈绿色荧光。2B. DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光。2C. 共定位，培养的Müller细胞，形态规则，呈长梭形交织生长；染色阳性率＞95% 标尺：100 μm
光学显微镜观察发现，正常对照组细胞呈长梭形，胞质边界清晰、形态均一；H2O2组细胞数量减少，细胞形态狭长，细胞核浓缩，细胞质减少； H2O2+NBP组细胞数量较H2O2组增加，较正常对照组减少，细胞质边界清晰，部分细胞呈长梭形（图3）。
图3
各组细胞光学显微镜像。3A～3C. 分别为正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组。正常对照组细胞呈长梭形，细胞质边界清晰；H2O2组细胞数量较正常对照组少，细胞核浓缩，细胞质减少；H2O2+NBP组细胞数量较正常对照组减少，但比H2O2组增多，细胞核较正常对照组略减小，较H2O2组细胞核大，细胞质多 HE 标尺: 100 μm
MTT比色法检测结果显示，NBP作用24 h后，正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞生存力分别为0.97±0.05、0.16±0.01、0.33±0.08；正常对照组与H2O2组、H2O2组与H2O2+NBP组细胞生存力比较，差异均有统计学意义（t=28.96、3.658，P＜0.001、0.022）。48 h后，正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞生存力分别为1.35±0.03、0.45±0.03、0.92±0.05；正常对照组与H2O2组、H2O2组与H2O2+NBP组Müller细胞生存力比较，差异均有统计学意义（t=47.58、20.33，P＜0.001、＜0.001）（图4）。
图4
正常对照组、H2O2组、H2O2+NBP组细胞生存力比较。4A. 24 h；4B. 48 h。*P＜0.05；##P＜0.001
荧光显微镜观察结果显示，正常对照组细胞核蓝色荧光均匀一致，形态完整；H2O2组细胞的细胞核固缩、碎裂，蓝色荧光增强；H2O2+NBP组细胞少数细胞核边集呈新月状且细胞核碎裂减少，其余细胞蓝色荧光均匀（图5）。
图5
各组细胞荧光显微镜像。5A～5C. 分别为正常对照组、H2O2组、H2O2＋NBP组。正常对照组细胞染色呈圆形，蓝色荧光均匀一致；H2O2组细胞浓集呈亮蓝色，部分为碎片状（白箭）；H2O2＋NBP组仅少数细胞呈亮蓝色（白箭），其余细胞蓝色荧光均匀 Hoechst33258标尺：100 μm
细胞荧光显微镜观察发现，正常对照组细胞呈绿色荧光；H2O2组中可见较多呈红色荧光的死亡细胞，呈绿色荧光的活细胞数量显著减少；H2O2+NBP组呈绿色荧光的活细胞数量增多，红色荧光的死亡细胞减少（图6）。
图6
各组细胞荧光显微镜像。6A～6C. 分别为正常对照组、H2O2组、H2O2＋NBP组。正常对照组细胞呈绿色荧光；H2O2组细胞中红色荧光增多；H2O2+NBP组细胞中红色荧光显著减少 标尺：100 μm
细胞荧光显微镜观察发现，正常对照组细胞ER中隐约可见绿色荧光；H2O2组细胞ER中绿色荧光强度明显增强；H2O2+NBP组细胞ER中绿色荧光强度较H2O2组明显降低（图7）。
图7
各组细胞ROS＋ER荧光共定位像。7A. 正常对照组细胞ER中隐约可见绿色荧光；7B. H2O2组细胞ER中绿色荧光强度明显增强；7C. H2O2＋NBP组细胞ER中绿色荧光强度较H2O2组明显降低。绿色荧光为DCFH-DA标记的ROS，红色荧光为ER-Tracker Red示踪的ER标尺：100 μm
3 讨论
Müller细胞是贯穿于全层视网膜的大神经胶质细胞，主要负责视网膜保护、营养及代谢、调节神经递质等。有研究表明，Müller细胞在很多眼缺血性疾病早期就出现形态及功能的变化。本研究结果显示，Müller细胞在H2O2的刺激下，产生凋亡的一系列病理生理改变，模拟眼缺血性疾病早期出现的缺血缺氧状态，在此基础之上研究其可能的机制，为今后疾病的治疗开拓新的思路。
NBP国内主要用于缺血性脑卒中的治疗。大量研究表明，NBP可在抑制缺血缺氧、细胞凋亡、氧自由基产生等多个环节起到保护神经细胞免受氧化应激损伤的作用[9, 10]。
本研究结果显示，经H2O2刺激后Müller细胞数量减少，形态呈长梭形，细胞质浓缩；细胞生存力下降。提示H2O2刺激导致细胞受损以及细胞凋亡程序的启动。加入NBP作用后，细胞数量较H2O2组明显增加，细胞质边界清晰，部分细胞呈长梭形，细胞生存力提高；缓解了H2O2诱导的细胞氧化损伤。提示NBP是Müller细胞凋亡的潜在保护因子。
ROS包括超氧自由基、过氧化氢及其下游产物过氧化物和羟化物等，可参与细胞生长增生、发育分化、衰老和凋亡等生理及病理过程。为初步了解抑制H2O2诱导的Müller细胞凋亡的途径，本研究应用DCFH-DA检测NBP高表达对H2O2诱导的Müller细胞ER中ROS的表达影响。结果发现，H2O2刺激后Müller细胞的ROS水平明显增高，而给予NBP作用后，细胞中ROS水平显著下降。提示NBP可抑制氧化应激水平。
ER是真核细胞中分泌和折叠合成蛋白及膜结合蛋白的的重要亚细胞器，在许多神经疾病中起着至关重要的作用，如神经退行性疾病、硬化症和脑缺血等[11]。研究显示，ER应激在糖尿病视网膜病变中有重要作用[12, 13]。为明确H2O2诱导的氧化应激是否与ER应激存在潜在联系，本研究采用ER-Tracker染色，观察细胞ER中ROS表达情况。ER-Tracker Red是一种ER红色荧光探针，可以用于活细胞ER特异性荧光染色。DCFH-DA本身没有荧光，可以穿过细胞膜，进入细胞内后被细胞内的酯酶水解生成DCFH。在ROS存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，检测荧光DCF可了解细胞内ROS水平。绿色荧光的强度与细胞内ROS水平成正比。结果显示，NBP作用后可有效缓解ER中ROS的堆积，进而下调ER应激水平。Zheng等[5]发现NBP可以在脊髓损伤后，抑制ER应激。本研究结果与此一致。
既往对NBP的研究主要集中于神经系统，如脑缺血、脊髓损伤等[7-9]。NBP是一种多靶点的神经保护剂，可以显著降低氧化损伤，改善线粒体功能，减少神经元的凋亡，并可抑制炎症反应。最近研究表明，NBP在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型中可抑制白内障形成，降低血糖[14]。其机制是减少ROS、丙二醛等氧化应激指标。
本研究仅对NBP在体外培养的Müller细胞氧化应激条件下作用进行初步探讨，今后尚需对NBP作用下Müller抗氧化应激机制，Müller与视网膜神经节细胞之间的相互作用以及分子机制等进行深入研究。
