引用本文： 孟凡超, 孙世龙, 苏建, 石佩玉, 周伟民, 王书香, 楚金亭. 髓样细胞表达触发受体在缺血性视神经病变中的表达. 中华眼底病杂志, 2018, 34(5): 471-474. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.05.012 复制
髓样细胞表达触发受体（TREM）是免疫球蛋白超家族成员中的一个受体家族，包括TREM-1、TREM-2、TREM-3等；已在急性炎症、非肿瘤性炎性疾病、神经退行性疾病中得到广泛研究[1]。TREM-1主要在单核细胞和中性粒细胞表面表达，是免疫球蛋白超家族的一类细胞表面受体。TREM-2不表达于外周血单核细胞，而主要表达于新近分化的巨噬细胞、小胶质细胞、树突状细胞等[2]。研究证实小胶质细胞TREM-2在缺血中具有神经保护作用。关于小胶质细胞的炎症反应，在小鼠中编码促炎细胞因子如白细胞介素（IL）-1b和肿瘤坏死因子（TNF）-α的基因被下调[3]，表明TREM-2刺激小胶质细胞的促炎反应。既往文献报道，神经系统中仅在小胶质细胞发现TREM-2，少突胶质细胞或其他类型的脑细胞未发现其存在[4, 5]。目前已知TREM/ DNAX激活蛋白12（DAP12）受体复合物可激活细胞外磷脂酰肌醇-3激酶、细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/ERK2和鸟嘌呤核苷酸交换因子Vav蛋白3，以及诱导细胞内Ca2+动员、肌动蛋白（actin）细胞骨架的重排，同时也调节神经系统的凋亡[6]。为了解TREM在缺血性视神经病变中的表达及其作用，我们观察了大鼠双侧颈内动脉结扎后视神经组织中TREM-1、TREM-2、半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3）、IL-6的表达。现将结果报道如下。
1 材料和方法
健康Sprague Dawley大鼠20只，雌雄各半，2月龄，体重280～320 g，清洁级，河南省实验动物中心提供。动物生产许可证：SCXK（豫）2010-0001；使用许可证：SYXK（豫）2010-0001。实验动物的管理和使用符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。
采用数字表法随机将大鼠分为模型组、对照组，各为10只大鼠。两组大鼠均按40 mg/kg的剂量腹腔注射水合氯醛进行麻醉，无菌条件下颈正中切口分离肌肉和筋膜后充分暴露双侧颈内动脉，实验组大鼠5-0的丝线结扎双侧颈内动脉，保留颈外动脉建立亚急性缺血性视神经病变动物模型。对照组大鼠只分离双侧颈总动脉，不进行结扎。建模后14 d，大鼠水合氯醛麻醉后，仰卧位固定于手术台，剪开右心耳，以0.9%生理盐水200 ml快速滴入，4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液（PBS）灌注固定；快速断头取视神经于冰盘上，置于冻存管内，进行后续实验。
实时定量荧光聚合酶链反应（RT-PCR）检测模型组、对照组大鼠视神经组织中TREM-1、TREM-2、Caspase-3、IL-6 mRNA相对表达量。视神经组织匀浆，按照酚-异硫氰酸胍一步法提取各组总RNA。微量紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度。每个标本取200 ng总RNA，按逆转录试剂盒说明在20 μl体系中合成cDNA。根据NCBI数据库中的TREM-1、TREM-2、Caspase-3、IL-6以及β-actin基因序列，以Premier 5.0软件设计引物，由上海生工生物工程公司合成（表1）。荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪进行RT-PCR反应，扩增条件94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性3 min，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸3 min。每个样本取10 μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，应用Alpha Imager图像分析系统测定吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，以β-actin为内参照基因，样本相对表达含量=样本A值/样本β-actin A值。
表1
TREM-1、TREM-2、Caspase-3、IL-6、β-actin基因扩增测序引物
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测模型组、对照组大鼠视神经组织中TREM-1、TREM-2、Caspase-3、IL-6蛋白相对表达量。PBS冲洗视神经组织后加入RIPA裂解液冰上裂解，提取总蛋白。提取的蛋白经8%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，洗膜缓冲液（TBST）漂洗3次，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入兔抗大鼠TREM-1单克隆抗体（1:1000）、兔抗大鼠TREM-2单克隆抗体（1:1000）、兔抗大鼠Caspase-3单克隆抗体（1:2000）、兔抗大鼠IL-6单克隆抗体（1:1000）和兔抗大鼠β-actin单克隆抗体（1:1000），4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次后加入1:2000稀释的HRP标记羊抗兔IgG二抗，常温孵育2 h，TBST充分洗涤后电化学发光法显影，暗室曝光，二氨基联苯胺（DAB）显色并拍照。采用Image J图像分析系统进行灰度分析，以β-actin作为内参照。
采用SPSS17.0软件进行统计学分析。正态分布的数据以均数±标准差（
）表示。两组间mRNA和蛋白比较采用t检验。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
RT-PCR检测结果显示，与对照组比较，模型组大鼠视神经组织中TREM-1（t=6.058，P=0.037）、Caspase-3（t=7.860，P=0.001）、IL-6（t=6.055，P=0.004） mRNA表达升高，TREM-2 mRNA（t=6.992，P=0.002）表达降低，差异均有统计学意义（图1）。
图1
对照组、模型组大鼠视神经组织中TREM-1、TREM-2、Caspase-3、IL-6 mRNA相对表达含量。*与对照组比较，P＜0.05 图 2 对照组、模型组大鼠视神经组织中TREM-1、TREM-2、Caspase-3、IL-6 蛋白相对表达含量。2A.电泳图；2B.两组大鼠视神经组织中TREM-1、TRE-2、Caspase-3、IL-6蛋白表达结果。*与对照组相比，P＜0.05
Western blot检测结果显示，与对照组比较，模型组大鼠视神经组织中TREM-1（t=9.671，P=0.001）、Caspase-3（t=9.524，P=0.001）、IL-6（t=14.501，P=0.000）蛋白表达升高，TREM-2（t=9.283，P=0.001）蛋白表达降低，差异均有统计学意义（图2）。
3 讨论
TREM是免疫球蛋白家族中的一个受体家族，其基因位于人染色体6p21[5, 6]，是一种与激活自然杀伤细胞受体同源的IgG样受体。有研究表明，TREM-1高度表达于嗜中性粒细胞和部分单核细胞和（或）巨噬细胞亚群[7]，特别是肺泡巨噬细胞[8]；TREM-2表达于不成熟的树突状细胞、破骨细胞和小胶质细胞表面[9]。两者是具有相似结构[相对分子质量（25～30）×103]的跨膜糖蛋白。目前已知TREM-2基因敲除与Nasu-Hakola病即多囊脂性骨发育不良与硬化性脑白质病、神经退行性疾病、缺血性脑卒中的发病具有直接相关性。
本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠视神经组织中TREM-1、Caspase-3、IL-6 mRNA和蛋白相对表达升高，TREM-2 mRNA和蛋白相对表达降低，差异均有统计学意义。有研究结果表明，TREM-1的触发可导致TNF-α、IL-8和单核细胞趋化蛋白1分泌增加并引发嗜中性粒细胞脱颗粒和以及髓过氧化物酶和一氧化氮的释放[10]。TREM-1与单克隆抗体的结合刺激多种促炎细胞因子和趋化因子的产生[11, 12]。在Toll样受体-2或Toll样受体-4配体存在下TREM-1激活可增强促炎细胞因子（TNF、IL-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）的产生，同时抑制IL-10的释放[13]。TREM-2总体上具有促抗炎和促吞噬作用[3]：（1）TREM-2与配体结合后通过TREM-2/DAP12介导的信号转导通路，激活ERK和酪氨酸蛋白激酶等，从而参与活化T细胞应答，影响小胶质细胞的自噬，是体内中枢神经系统炎症调节的重要通路，同时EPK信号通路参与抑制脂多糖刺激后树突状细胞的凋亡[14]；（2）巨噬细胞中TREM-2缺乏可诱导促炎症细胞因子的产生，包括IL-6和TNF-α[15]；（3）高表达TREM-2可以促进吞噬作用及减轻炎症反应。由于TREM-1的促进炎症反应作用以及TREM-2的抗炎作用，目前国内外研究发现TREM受体家族与风湿性疾病、脓毒血症、多发性硬化、心肌梗死等多种疾病有关，但目前关于TREM受体家族与缺血性视神经病的关系研究较少。
本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠视神经中TREM-1、Caspase-3、IL-6 mRNA和蛋白相对表达升高，TREM-2 mRNA和蛋白相对表达降低，差异均有统计学意义。这一结果表明TREM-1及TREM-2的表达与缺血性视神经病有一定关系。在一定程度上提示TREM-1的表达及其相关炎症因子可能会通过加重炎症反应从而加重缺血性视神经疾病模型中视神经的损伤，TREM-2的表达可能会通过抗炎、抗凋亡作用而发挥保护作用，这为临床治疗缺血性视神经疾病提供了通过调控缺血性视神经病患者TREM受体家族的表达水平从而减轻视神经的损伤这一治疗新思路。
髓样细胞表达触发受体（TREM）是免疫球蛋白超家族成员中的一个受体家族，包括TREM-1、TREM-2、TREM-3等；已在急性炎症、非肿瘤性炎性疾病、神经退行性疾病中得到广泛研究[1]。TREM-1主要在单核细胞和中性粒细胞表面表达，是免疫球蛋白超家族的一类细胞表面受体。TREM-2不表达于外周血单核细胞，而主要表达于新近分化的巨噬细胞、小胶质细胞、树突状细胞等[2]。研究证实小胶质细胞TREM-2在缺血中具有神经保护作用。关于小胶质细胞的炎症反应，在小鼠中编码促炎细胞因子如白细胞介素（IL）-1b和肿瘤坏死因子（TNF）-α的基因被下调[3]，表明TREM-2刺激小胶质细胞的促炎反应。既往文献报道，神经系统中仅在小胶质细胞发现TREM-2，少突胶质细胞或其他类型的脑细胞未发现其存在[4, 5]。目前已知TREM/ DNAX激活蛋白12（DAP12）受体复合物可激活细胞外磷脂酰肌醇-3激酶、细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/ERK2和鸟嘌呤核苷酸交换因子Vav蛋白3，以及诱导细胞内Ca2+动员、肌动蛋白（actin）细胞骨架的重排，同时也调节神经系统的凋亡[6]。为了解TREM在缺血性视神经病变中的表达及其作用，我们观察了大鼠双侧颈内动脉结扎后视神经组织中TREM-1、TREM-2、半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3）、IL-6的表达。现将结果报道如下。
1 材料和方法
健康Sprague Dawley大鼠20只，雌雄各半，2月龄，体重280～320 g，清洁级，河南省实验动物中心提供。动物生产许可证：SCXK（豫）2010-0001；使用许可证：SYXK（豫）2010-0001。实验动物的管理和使用符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。
采用数字表法随机将大鼠分为模型组、对照组，各为10只大鼠。两组大鼠均按40 mg/kg的剂量腹腔注射水合氯醛进行麻醉，无菌条件下颈正中切口分离肌肉和筋膜后充分暴露双侧颈内动脉，实验组大鼠5-0的丝线结扎双侧颈内动脉，保留颈外动脉建立亚急性缺血性视神经病变动物模型。对照组大鼠只分离双侧颈总动脉，不进行结扎。建模后14 d，大鼠水合氯醛麻醉后，仰卧位固定于手术台，剪开右心耳，以0.9%生理盐水200 ml快速滴入，4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液（PBS）灌注固定；快速断头取视神经于冰盘上，置于冻存管内，进行后续实验。
实时定量荧光聚合酶链反应（RT-PCR）检测模型组、对照组大鼠视神经组织中TREM-1、TREM-2、Caspase-3、IL-6 mRNA相对表达量。视神经组织匀浆，按照酚-异硫氰酸胍一步法提取各组总RNA。微量紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度。每个标本取200 ng总RNA，按逆转录试剂盒说明在20 μl体系中合成cDNA。根据NCBI数据库中的TREM-1、TREM-2、Caspase-3、IL-6以及β-actin基因序列，以Premier 5.0软件设计引物，由上海生工生物工程公司合成（表1）。荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪进行RT-PCR反应，扩增条件94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性3 min，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸3 min。每个样本取10 μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，应用Alpha Imager图像分析系统测定吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，以β-actin为内参照基因，样本相对表达含量=样本A值/样本β-actin A值。
表1
TREM-1、TREM-2、Caspase-3、IL-6、β-actin基因扩增测序引物
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测模型组、对照组大鼠视神经组织中TREM-1、TREM-2、Caspase-3、IL-6蛋白相对表达量。PBS冲洗视神经组织后加入RIPA裂解液冰上裂解，提取总蛋白。提取的蛋白经8%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，洗膜缓冲液（TBST）漂洗3次，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入兔抗大鼠TREM-1单克隆抗体（1:1000）、兔抗大鼠TREM-2单克隆抗体（1:1000）、兔抗大鼠Caspase-3单克隆抗体（1:2000）、兔抗大鼠IL-6单克隆抗体（1:1000）和兔抗大鼠β-actin单克隆抗体（1:1000），4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次后加入1:2000稀释的HRP标记羊抗兔IgG二抗，常温孵育2 h，TBST充分洗涤后电化学发光法显影，暗室曝光，二氨基联苯胺（DAB）显色并拍照。采用Image J图像分析系统进行灰度分析，以β-actin作为内参照。
采用SPSS17.0软件进行统计学分析。正态分布的数据以均数±标准差（
）表示。两组间mRNA和蛋白比较采用t检验。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
RT-PCR检测结果显示，与对照组比较，模型组大鼠视神经组织中TREM-1（t=6.058，P=0.037）、Caspase-3（t=7.860，P=0.001）、IL-6（t=6.055，P=0.004） mRNA表达升高，TREM-2 mRNA（t=6.992，P=0.002）表达降低，差异均有统计学意义（图1）。
图1
对照组、模型组大鼠视神经组织中TREM-1、TREM-2、Caspase-3、IL-6 mRNA相对表达含量。*与对照组比较，P＜0.05 图 2 对照组、模型组大鼠视神经组织中TREM-1、TREM-2、Caspase-3、IL-6 蛋白相对表达含量。2A.电泳图；2B.两组大鼠视神经组织中TREM-1、TRE-2、Caspase-3、IL-6蛋白表达结果。*与对照组相比，P＜0.05
Western blot检测结果显示，与对照组比较，模型组大鼠视神经组织中TREM-1（t=9.671，P=0.001）、Caspase-3（t=9.524，P=0.001）、IL-6（t=14.501，P=0.000）蛋白表达升高，TREM-2（t=9.283，P=0.001）蛋白表达降低，差异均有统计学意义（图2）。
3 讨论
TREM是免疫球蛋白家族中的一个受体家族，其基因位于人染色体6p21[5, 6]，是一种与激活自然杀伤细胞受体同源的IgG样受体。有研究表明，TREM-1高度表达于嗜中性粒细胞和部分单核细胞和（或）巨噬细胞亚群[7]，特别是肺泡巨噬细胞[8]；TREM-2表达于不成熟的树突状细胞、破骨细胞和小胶质细胞表面[9]。两者是具有相似结构[相对分子质量（25～30）×103]的跨膜糖蛋白。目前已知TREM-2基因敲除与Nasu-Hakola病即多囊脂性骨发育不良与硬化性脑白质病、神经退行性疾病、缺血性脑卒中的发病具有直接相关性。
本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠视神经组织中TREM-1、Caspase-3、IL-6 mRNA和蛋白相对表达升高，TREM-2 mRNA和蛋白相对表达降低，差异均有统计学意义。有研究结果表明，TREM-1的触发可导致TNF-α、IL-8和单核细胞趋化蛋白1分泌增加并引发嗜中性粒细胞脱颗粒和以及髓过氧化物酶和一氧化氮的释放[10]。TREM-1与单克隆抗体的结合刺激多种促炎细胞因子和趋化因子的产生[11, 12]。在Toll样受体-2或Toll样受体-4配体存在下TREM-1激活可增强促炎细胞因子（TNF、IL-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）的产生，同时抑制IL-10的释放[13]。TREM-2总体上具有促抗炎和促吞噬作用[3]：（1）TREM-2与配体结合后通过TREM-2/DAP12介导的信号转导通路，激活ERK和酪氨酸蛋白激酶等，从而参与活化T细胞应答，影响小胶质细胞的自噬，是体内中枢神经系统炎症调节的重要通路，同时EPK信号通路参与抑制脂多糖刺激后树突状细胞的凋亡[14]；（2）巨噬细胞中TREM-2缺乏可诱导促炎症细胞因子的产生，包括IL-6和TNF-α[15]；（3）高表达TREM-2可以促进吞噬作用及减轻炎症反应。由于TREM-1的促进炎症反应作用以及TREM-2的抗炎作用，目前国内外研究发现TREM受体家族与风湿性疾病、脓毒血症、多发性硬化、心肌梗死等多种疾病有关，但目前关于TREM受体家族与缺血性视神经病的关系研究较少。
本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠视神经中TREM-1、Caspase-3、IL-6 mRNA和蛋白相对表达升高，TREM-2 mRNA和蛋白相对表达降低，差异均有统计学意义。这一结果表明TREM-1及TREM-2的表达与缺血性视神经病有一定关系。在一定程度上提示TREM-1的表达及其相关炎症因子可能会通过加重炎症反应从而加重缺血性视神经疾病模型中视神经的损伤，TREM-2的表达可能会通过抗炎、抗凋亡作用而发挥保护作用，这为临床治疗缺血性视神经疾病提供了通过调控缺血性视神经病患者TREM受体家族的表达水平从而减轻视神经的损伤这一治疗新思路。
