引用本文： 田芳, 李文博, 黄亮瑜, 高美子, 赵今稚, 胡博杰, 张晓敏, 李筱荣, 东莉洁. 聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子对过氧化氢诱导下视网膜色素上皮细胞凋亡的影响. 中华眼底病杂志, 2018, 34(2): 159-163. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.02.012 复制
氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧（ROS）产生过多引发的一系列细胞毒效应，主要表现为DNA氧化损伤及蛋白质的表达异常[1]。视网膜色素上皮（ RPE）细胞具有吞噬降解光感受器细胞外节段、参与视循环、转运和分泌营养物质、清除自由基等功能，因此RPE细胞对维持视网膜的稳态平衡发挥重要的作用[2]。随着年龄增长RPE细胞因吸收眼内散射光及吞噬作用而产生大量ROS，极易诱发氧化应激反应的发生，导致RPE细胞遭受氧化损伤。聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子（PSF）是一种多功能蛋白[3, 4]。我们课题组前期研究发现PSF通过抑制RPE细胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/丝氨酸-苏氨酸蛋白（Akt）激酶信号通路的活化，从而抑制血管内皮生长因子（VEGF）的表达[5]。过氧化氢（H2O2）诱导的RPE细胞缺氧是常用的一种体外氧化应激模型[6, 7]，本研究将PSF蛋白引入RPE细胞氧化应激模型，观察PSF蛋白对RPE氧化损伤的影响以及潜在机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人RPE细胞株（ARPE-19细胞，广州吉妮欧生物科技有限公司）；pEGFP-PSF真核表达质粒由本实验室自行构建[8]。噻唑蓝（MTT）（北京索莱宝科技有限公司）；H2O2溶液、2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、细胞凋亡检测试剂盒（美国Sigma公司）；转染试剂脂质体2000（美国Invitrogen公司）；LIVE/DEAD®细胞活性/细胞毒性检测试剂盒（美国Thermo公司）。
1.2 方法
将ARPE-19细胞爬片于已预先放置盖玻片的24孔细胞培养板中，共12孔；待细胞融合度约80%时，将细胞分为正常细胞组、损伤组（N+H2O2组）、空载体对照组（Vec+H2O2组）、PSF高表达组（PSF+H2O2组）。应用脂质体2000将pEGFP空载体、pEGFP-PSF真核表达质粒分别导入Vec+H2O2组、PSF+H2O2组，N+H2O2组仅作转染处理，正常细胞组为常规培养细胞。细胞转染24 h后，各组细胞H2O2刺激2 h后更换为完全培养基继续培养24 h，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，3 min/次；4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗2次，1 min/次；0.5% TritonX-100/PBS破膜室温5 min，PBS洗2次，1 min/次；苏木精-伊红（HE）染色；酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察各组细胞形态。
蛋白免疫印迹法（Western blot）检测pEGFP-PSF真核表达质粒转染效果。接种6×105个/孔ARPE-19细胞于1 ml培养体系的6孔细胞培养板中，待细胞汇合度达到70%左右，将细胞分为正常细胞组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组。收集各组全细胞提取物，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白复合物，将PSF蛋白转至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，1倍洗膜缓冲液（TBST）洗膜3次，10 min/次；辣根过氧化物酶标记的二抗继续孵育1 h，1倍TBST洗膜3次，10 min/次；增强化学发光检测试剂盒发光显影。以甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照，检测各组细胞中PSF蛋白表达量。
MTT法定量测定细胞活性。将ARPE-19细胞接种于96孔细胞培养板中，共12孔。待细胞融合度约80%时，将细胞分为N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组。各组细胞H2O2刺激2 h后更换为完全培养基继续培养24 h，弃去培养液，每孔加入100 μl培养液与10 μl MTT溶液，继续孵箱4 h，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜溶液150 μl，常温下放置10 min。选择490 nm波长, 酶联免疫检测仪测定各孔细胞吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，每组设3个副孔，实验重复3次，取平均值。
LIVE/DEAD®细胞活性/细胞毒性试剂盒检测正常细胞组、N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞生存力。各组细胞H2O2刺激2 h后更换为完全培养基继续培养24 h，每孔加入50 μl配制的Live/Dead染色剂溶液，室温孵育30 min，终止染色，每孔加入50 μl PBS。每组设3个副孔，实验重复3次。细胞荧光显微镜观察拍照，活细胞呈绿色荧光，死亡细胞呈红色荧光。
细胞凋亡检测试剂盒检测N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞凋亡。各组细胞H2O2刺激2 h后更换为完全培养基继续培养24 h，参照说明书进行操作；每组设3个副孔，实验重复3次。
DCFH-DA法检测正常细胞组、N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞内ROS水平。应用ROS检测试剂盒，按照说明书流程操作，以酶联免疫检测仪测定N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞内ROS水平；每组设3个副孔，实验重复3次。
1.3 统计方法
采用SPSS18.0软件进行统计学分析。数据分析选择单因素方差分析（ANOVA）联合Dunnett统计学方法，即首先对数据进行方差齐性检验，再利用Dunnett进行各实验组与对照组之间的两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。经Graphprism软件对所获得数据进行图表整理。
2 结果
光学显微镜观察发现，正常细胞组细胞形态饱满，胞质染色均一，细胞核呈圆形，胞质丰富（图1A）；N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞体积缩小，胞质致密浓缩、嗜酸性染色增强（图1B，1C）；PSF+H2O2组细胞形态尚饱满，胞质染色较均匀，偶见体积缩小（图1D）。
图1
各组细胞光学显微镜像。1A～1D.分别为正常细胞组、N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组。正常细胞组细胞形态饱满，细胞核呈圆形；N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞体积缩小，胞质致密浓缩、嗜酸性染色增强（黑箭）；PSF+H2O2组细胞形态尚饱满，胞质染色较均匀，偶见体积缩小（黑箭）HE ×100
Western blot检测结果显示，与正常细胞组、Vec+H2O2组比较，PSF+H2O2组细胞PSF蛋白表达显著上调（图2）。
图2
正常细胞组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞PSF蛋白表达电泳图
MTT比色法检测结果显示，N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞生存力分别为0.58±0.06、0.55±0.08、0.97±0.15。与PSF+H2O2组比较，N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞活性下降，差异有统计学意义（F=46.98，P=0.000）（图3）
图3
N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞生存力比较。*P＜0.05
细胞荧光显微镜观察发现，正常细胞组细胞呈绿色荧光，偶见红色荧光（图4A）；N+H2O2组、Vec+H2O2组中呈红色荧光的死亡细胞数量明显增多，呈绿色荧光的活细胞数量显著减少（图4B，4C）；PSF+H2O2组活细胞数量明显增多，死亡细胞数量显著减少（图4D）。
图4
各组细胞荧光显微镜像。4A～4D.分别为正常细胞组、N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组。正常细胞组细胞偶见红色荧光（白箭头）；N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞中红色荧光明显增多（白箭头）；PSF+H2O2组细胞中红色荧光显著减少（白箭头）×100
细胞凋亡检测试剂盒检测结果显示，N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞A值分别为1.18±0.11、1.16±0.16、0.51±0.16；与N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞A值比较，PSF+H2O2组细胞A值显著下降，差异有统计学意义（F=62.24，P=0.000）（图5）。
图5
N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞凋亡比较。*P＜0.05
DCFH-DA法检测结果显示，N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞中ROS表达的A值分别为23 602.56±1 386.3、24 424.67±877.59、13 570±805.19；与N+H2O2组、Vec+H2O2组比较，PSF+H2O2组细胞中ROS表达量下降，差异有统计学意义（F=295.235，P=0.000）（图6）。
图6
N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞ROS含量比较。*P＜0.05
3 讨论
RPE细胞作为血视网膜屏障的重要组成成分具有重要的生物学及解剖学功能。RPE细胞的异常病理变化在多种视网膜疾病的发生发展过程中占重要地位[9]。其中氧化损伤引起的RPE细胞变性和死亡是老年性黄斑变性（AMD）的显著特征和主要诱因[10-13]。因此，保护RPE细胞免受氧化应激损伤成为延缓和治疗AMD的一条重要策略[14]。
PSF由707个氨基酸残基组成，相对分子质量为100×103的多功能蛋白，可参与基因转录调控、DNA损伤修复、premRNA的剪接加工[3, 4]。我们前期研究结果显示，PSF蛋白可以抑制氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的形成，下调VEGF表达，从而抑制新生血管的增生[5, 15, 16]。在此基础之上进一步明确了胰岛素生长因子-1刺激后PSF可通过调控体外培养的RPE细胞PI3K/Akt信号通路的活化程度来影响VEGF的表达[5]。研究发现，在氧化应激情况下，ROS调控VEGF表达，活化VEGF受体，活化下游信号，导致内皮细胞的增生和迁移以及新生血管的形成[17-19]。但PSF蛋白对ROS的表达调控以及效应发挥是否也存在潜在的调控作用尚不清楚。
在培养体系中添加H2O2是研究氧化应激的经典模型[20-23]。Kim等[24]研究发现H2O2可诱导RPE细胞凋亡；肿瘤坏死因子-α与H2O2联合应用可导致半胱天冬酶激活进而诱导RPE凋亡。基于此，本研究将PSF引入人RPE细胞模型中，并利用H2O2作为诱导剂刺激RPE细胞，目的在于观察PSF蛋白对RPE氧化损伤的影响以及潜在机制。结果显示，经H2O2刺激后细胞体积变小，细胞质浓缩，细胞的嗜酸性染色增强，相比之下，PSF+H2O2组细胞形态尚饱满，胞质相对丰富。与N+H2O2组比较，H2O2刺激后，PSF+H2O2组细胞生存力明显提高。提示H2O2刺激导致RPE细胞受损。为明确RPE细胞的损伤程度，采用LIVE/DEAD®细胞活性/细胞毒性试剂盒标记细胞死亡率。结果显示，H2O2刺激可以诱导RPE细胞的损伤，并导致死亡，PSF蛋白高表达可以显著下调H2O2诱导的RPE细胞的死亡水平。H2O2可以诱导细胞凋亡，而PSF蛋白高表达可以拮抗H2O2处理导致的RPE细胞凋亡。由此可见PSF高表达可有效改善H2O2诱导的RPE细胞的形态学改变，显著上调RPE细胞生存力，缓解H2O2诱导的RPE细胞损伤，下调RPE细胞凋亡率。
为明确H2O2是否可以诱导RPE细胞凋亡，本研究应用凋亡检测试剂盒对不同分组的RPE细胞进行定量分析。结果显示，诱导可以导致RPE细胞凋亡，而PSF+H2O2组细胞凋亡明显低于N+H2O2组、Vec+H2O2组，即PSF高表达可以抑制RPE细胞凋亡。提示PSF是RPE细胞凋亡的潜在保护因子。
氧化应激是指体内ROS的产生和抗氧化防御体系之间失衡，导致ROS聚集对组织造成损伤的病理状态。研究发现，大量ROS未能及时清除时可使机体发生氧化应激反应，诱导线粒体膜电位降低，线粒体通透性转换孔开放，线粒体细胞色素C释放入胞浆，由此触发并激活细胞的凋亡系统引起细胞凋亡[25-27]。为初步了解PSF蛋白抑制H2O2诱导的RPE细胞凋亡的途径，本研究检测PSF高表达对于H2O2诱导的RPE细胞ROS的表达情况的影响。结果显示，PSF+H2O2组可以显著下调H2O2诱导的RPE细胞ROS表达。
氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧（ROS）产生过多引发的一系列细胞毒效应，主要表现为DNA氧化损伤及蛋白质的表达异常[1]。视网膜色素上皮（ RPE）细胞具有吞噬降解光感受器细胞外节段、参与视循环、转运和分泌营养物质、清除自由基等功能，因此RPE细胞对维持视网膜的稳态平衡发挥重要的作用[2]。随着年龄增长RPE细胞因吸收眼内散射光及吞噬作用而产生大量ROS，极易诱发氧化应激反应的发生，导致RPE细胞遭受氧化损伤。聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子（PSF）是一种多功能蛋白[3, 4]。我们课题组前期研究发现PSF通过抑制RPE细胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/丝氨酸-苏氨酸蛋白（Akt）激酶信号通路的活化，从而抑制血管内皮生长因子（VEGF）的表达[5]。过氧化氢（H2O2）诱导的RPE细胞缺氧是常用的一种体外氧化应激模型[6, 7]，本研究将PSF蛋白引入RPE细胞氧化应激模型，观察PSF蛋白对RPE氧化损伤的影响以及潜在机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人RPE细胞株（ARPE-19细胞，广州吉妮欧生物科技有限公司）；pEGFP-PSF真核表达质粒由本实验室自行构建[8]。噻唑蓝（MTT）（北京索莱宝科技有限公司）；H2O2溶液、2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、细胞凋亡检测试剂盒（美国Sigma公司）；转染试剂脂质体2000（美国Invitrogen公司）；LIVE/DEAD®细胞活性/细胞毒性检测试剂盒（美国Thermo公司）。
1.2 方法
将ARPE-19细胞爬片于已预先放置盖玻片的24孔细胞培养板中，共12孔；待细胞融合度约80%时，将细胞分为正常细胞组、损伤组（N+H2O2组）、空载体对照组（Vec+H2O2组）、PSF高表达组（PSF+H2O2组）。应用脂质体2000将pEGFP空载体、pEGFP-PSF真核表达质粒分别导入Vec+H2O2组、PSF+H2O2组，N+H2O2组仅作转染处理，正常细胞组为常规培养细胞。细胞转染24 h后，各组细胞H2O2刺激2 h后更换为完全培养基继续培养24 h，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，3 min/次；4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗2次，1 min/次；0.5% TritonX-100/PBS破膜室温5 min，PBS洗2次，1 min/次；苏木精-伊红（HE）染色；酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察各组细胞形态。
蛋白免疫印迹法（Western blot）检测pEGFP-PSF真核表达质粒转染效果。接种6×105个/孔ARPE-19细胞于1 ml培养体系的6孔细胞培养板中，待细胞汇合度达到70%左右，将细胞分为正常细胞组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组。收集各组全细胞提取物，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白复合物，将PSF蛋白转至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，1倍洗膜缓冲液（TBST）洗膜3次，10 min/次；辣根过氧化物酶标记的二抗继续孵育1 h，1倍TBST洗膜3次，10 min/次；增强化学发光检测试剂盒发光显影。以甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照，检测各组细胞中PSF蛋白表达量。
MTT法定量测定细胞活性。将ARPE-19细胞接种于96孔细胞培养板中，共12孔。待细胞融合度约80%时，将细胞分为N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组。各组细胞H2O2刺激2 h后更换为完全培养基继续培养24 h，弃去培养液，每孔加入100 μl培养液与10 μl MTT溶液，继续孵箱4 h，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜溶液150 μl，常温下放置10 min。选择490 nm波长, 酶联免疫检测仪测定各孔细胞吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，每组设3个副孔，实验重复3次，取平均值。
LIVE/DEAD®细胞活性/细胞毒性试剂盒检测正常细胞组、N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞生存力。各组细胞H2O2刺激2 h后更换为完全培养基继续培养24 h，每孔加入50 μl配制的Live/Dead染色剂溶液，室温孵育30 min，终止染色，每孔加入50 μl PBS。每组设3个副孔，实验重复3次。细胞荧光显微镜观察拍照，活细胞呈绿色荧光，死亡细胞呈红色荧光。
细胞凋亡检测试剂盒检测N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞凋亡。各组细胞H2O2刺激2 h后更换为完全培养基继续培养24 h，参照说明书进行操作；每组设3个副孔，实验重复3次。
DCFH-DA法检测正常细胞组、N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞内ROS水平。应用ROS检测试剂盒，按照说明书流程操作，以酶联免疫检测仪测定N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞内ROS水平；每组设3个副孔，实验重复3次。
1.3 统计方法
采用SPSS18.0软件进行统计学分析。数据分析选择单因素方差分析（ANOVA）联合Dunnett统计学方法，即首先对数据进行方差齐性检验，再利用Dunnett进行各实验组与对照组之间的两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。经Graphprism软件对所获得数据进行图表整理。
2 结果
光学显微镜观察发现，正常细胞组细胞形态饱满，胞质染色均一，细胞核呈圆形，胞质丰富（图1A）；N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞体积缩小，胞质致密浓缩、嗜酸性染色增强（图1B，1C）；PSF+H2O2组细胞形态尚饱满，胞质染色较均匀，偶见体积缩小（图1D）。
图1
各组细胞光学显微镜像。1A～1D.分别为正常细胞组、N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组。正常细胞组细胞形态饱满，细胞核呈圆形；N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞体积缩小，胞质致密浓缩、嗜酸性染色增强（黑箭）；PSF+H2O2组细胞形态尚饱满，胞质染色较均匀，偶见体积缩小（黑箭）HE ×100
Western blot检测结果显示，与正常细胞组、Vec+H2O2组比较，PSF+H2O2组细胞PSF蛋白表达显著上调（图2）。
图2
正常细胞组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞PSF蛋白表达电泳图
MTT比色法检测结果显示，N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞生存力分别为0.58±0.06、0.55±0.08、0.97±0.15。与PSF+H2O2组比较，N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞活性下降，差异有统计学意义（F=46.98，P=0.000）（图3）
图3
N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞生存力比较。*P＜0.05
细胞荧光显微镜观察发现，正常细胞组细胞呈绿色荧光，偶见红色荧光（图4A）；N+H2O2组、Vec+H2O2组中呈红色荧光的死亡细胞数量明显增多，呈绿色荧光的活细胞数量显著减少（图4B，4C）；PSF+H2O2组活细胞数量明显增多，死亡细胞数量显著减少（图4D）。
图4
各组细胞荧光显微镜像。4A～4D.分别为正常细胞组、N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组。正常细胞组细胞偶见红色荧光（白箭头）；N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞中红色荧光明显增多（白箭头）；PSF+H2O2组细胞中红色荧光显著减少（白箭头）×100
细胞凋亡检测试剂盒检测结果显示，N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞A值分别为1.18±0.11、1.16±0.16、0.51±0.16；与N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞A值比较，PSF+H2O2组细胞A值显著下降，差异有统计学意义（F=62.24，P=0.000）（图5）。
图5
N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞凋亡比较。*P＜0.05
DCFH-DA法检测结果显示，N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞中ROS表达的A值分别为23 602.56±1 386.3、24 424.67±877.59、13 570±805.19；与N+H2O2组、Vec+H2O2组比较，PSF+H2O2组细胞中ROS表达量下降，差异有统计学意义（F=295.235，P=0.000）（图6）。
图6
N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞ROS含量比较。*P＜0.05
3 讨论
RPE细胞作为血视网膜屏障的重要组成成分具有重要的生物学及解剖学功能。RPE细胞的异常病理变化在多种视网膜疾病的发生发展过程中占重要地位[9]。其中氧化损伤引起的RPE细胞变性和死亡是老年性黄斑变性（AMD）的显著特征和主要诱因[10-13]。因此，保护RPE细胞免受氧化应激损伤成为延缓和治疗AMD的一条重要策略[14]。
PSF由707个氨基酸残基组成，相对分子质量为100×103的多功能蛋白，可参与基因转录调控、DNA损伤修复、premRNA的剪接加工[3, 4]。我们前期研究结果显示，PSF蛋白可以抑制氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的形成，下调VEGF表达，从而抑制新生血管的增生[5, 15, 16]。在此基础之上进一步明确了胰岛素生长因子-1刺激后PSF可通过调控体外培养的RPE细胞PI3K/Akt信号通路的活化程度来影响VEGF的表达[5]。研究发现，在氧化应激情况下，ROS调控VEGF表达，活化VEGF受体，活化下游信号，导致内皮细胞的增生和迁移以及新生血管的形成[17-19]。但PSF蛋白对ROS的表达调控以及效应发挥是否也存在潜在的调控作用尚不清楚。
在培养体系中添加H2O2是研究氧化应激的经典模型[20-23]。Kim等[24]研究发现H2O2可诱导RPE细胞凋亡；肿瘤坏死因子-α与H2O2联合应用可导致半胱天冬酶激活进而诱导RPE凋亡。基于此，本研究将PSF引入人RPE细胞模型中，并利用H2O2作为诱导剂刺激RPE细胞，目的在于观察PSF蛋白对RPE氧化损伤的影响以及潜在机制。结果显示，经H2O2刺激后细胞体积变小，细胞质浓缩，细胞的嗜酸性染色增强，相比之下，PSF+H2O2组细胞形态尚饱满，胞质相对丰富。与N+H2O2组比较，H2O2刺激后，PSF+H2O2组细胞生存力明显提高。提示H2O2刺激导致RPE细胞受损。为明确RPE细胞的损伤程度，采用LIVE/DEAD®细胞活性/细胞毒性试剂盒标记细胞死亡率。结果显示，H2O2刺激可以诱导RPE细胞的损伤，并导致死亡，PSF蛋白高表达可以显著下调H2O2诱导的RPE细胞的死亡水平。H2O2可以诱导细胞凋亡，而PSF蛋白高表达可以拮抗H2O2处理导致的RPE细胞凋亡。由此可见PSF高表达可有效改善H2O2诱导的RPE细胞的形态学改变，显著上调RPE细胞生存力，缓解H2O2诱导的RPE细胞损伤，下调RPE细胞凋亡率。
为明确H2O2是否可以诱导RPE细胞凋亡，本研究应用凋亡检测试剂盒对不同分组的RPE细胞进行定量分析。结果显示，诱导可以导致RPE细胞凋亡，而PSF+H2O2组细胞凋亡明显低于N+H2O2组、Vec+H2O2组，即PSF高表达可以抑制RPE细胞凋亡。提示PSF是RPE细胞凋亡的潜在保护因子。
氧化应激是指体内ROS的产生和抗氧化防御体系之间失衡，导致ROS聚集对组织造成损伤的病理状态。研究发现，大量ROS未能及时清除时可使机体发生氧化应激反应，诱导线粒体膜电位降低，线粒体通透性转换孔开放，线粒体细胞色素C释放入胞浆，由此触发并激活细胞的凋亡系统引起细胞凋亡[25-27]。为初步了解PSF蛋白抑制H2O2诱导的RPE细胞凋亡的途径，本研究检测PSF高表达对于H2O2诱导的RPE细胞ROS的表达情况的影响。结果显示，PSF+H2O2组可以显著下调H2O2诱导的RPE细胞ROS表达。
