引用本文： 徐敏, 田媛媛, 陈雪, 黄健成, 丁思加, 蒋超, 赵晨. 卷曲蛋白4基因新致病突变p.E160K引起家族性渗出性玻璃体视网膜病变. 中华眼底病杂志, 2016, 32(6): 582-586. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.06.005 复制
家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)的遗传方式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X连锁遗传。Norrie病(NDP)、卷曲蛋白4(FZD4)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)、四旋蛋白12(TSPAN12)、锌指蛋白408(ZNF408)基因等5个基因被证实与FEVR有关[1-6]。其中，NDP、FZD4、LRP5及TSPAN12等4个基因编码的蛋白质在调节视网膜血管生成和发育的Norrin/β-肌动蛋白信号通路中发挥着重要的作用，而ZNF408基因所编码蛋白在该通路中是如何发挥作用目前研究尚未证实[7, 8]。这5个基因的突变可以解释50%左右的FEVR病例[9]。本研究针对NDP、FZD4、LRP5、TSPAN12及ZNF408此5个候选基因的全部编码区及外显子-内含子交界区剪切位点附近的序列进行测序，借助共分离验证及生物信息学分析，明确了一FEVR家系新的致病突变位点FZD4基因p.E160K。现将结果报道如下。
1 对象和方法
本研究获南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准；严格遵守赫尔辛基宣言，所有受试者或未成年监护人均签署知情同意书。
一个3代常染色体显性遗传FEVR家系(图 1)中3例患者及1例患者的配偶纳入研究。先证者(Ⅲ1)，男，5岁。足月顺产，否认吸氧史；1岁时父母发现其视物目光呆滞伴反应迟钝。双眼最佳矫正视力(BCVA)均为0.2。眼底检查，双眼可见黄白色视网膜下渗出，视网膜受玻璃体牵拉折叠呈镰刀状皱襞样(图 2)。先证者母亲(Ⅱ2)，33岁。BCVA：右眼0.8，左眼1.0。眼底检查，双眼周边部视网膜下黄白色渗出。荧光素眼底血管造影(FFA)检查，双眼周边视网膜血管可见荧光素渗漏，血管分支较多，末端呈毛刷样吻合，视网膜血管止端无灌注区(图 3)。先证者外公(Ⅰ1)，70岁。10余年前外院诊断为FEVR并因视网膜脱离行玻璃体切割手术；双眼白内障摘除手术后，BCVA均为0.15。先证者父亲(Ⅱ3)，35岁。双眼BCVA均为1.0。眼底及FFA检查均未见明显异常。依据临床检查结果并结合家系分析，患者符合常染色体显性遗传FEVR诊断标准[10]。
图1
患者家系图。■：男性患者；●：女性患者；□：正常男性；○：正常女性；↑：先证者；G/A和G/G分别代表正常者和患者在FZD4基因第478位的基因型
图2
先证者双眼彩色眼底像。2A.右眼；2B.左眼。视网膜下黄白色渗出，视网膜受玻璃体牵拉折叠呈镰刀状皱襞样
图3
先证者母亲双眼FFA像。3A.右眼；3B.左眼。视网膜颞侧周边血管中断，呈毛刷样吻合，明显无灌注区，交界处可见荧光素渗漏`
采集家系中患者及先证者父亲外周静脉血10 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用德国QIAGEN公司血液基因组DNA提取试剂盒按照标准操作流程提取全基因组DNA。应用Primer 5.0引物设计软件，设计针对候选致病基因NDP、FZD4、LRP5、TSPAN12及ZNF408的全部编码区及外显子-内含子交界区剪切位点附近
的序列引物(
表1
NDP、FZD4、LRP5基因扩增和测序引物
表2
TSPAN12、ZNF408基因扩增和测序引物
采用Chromas软件对原始测序结果进行分析，查找存在的单核苷酸杂合变异；应用Vector NTI软件对测序结果和NCBI人类基因组DNA序列进行比对，查找出单核苷酸纯和变异以及插入和缺失变异(InDel)，得到候选基因的全部变异。将检测出的单核苷酸变异(SNV)及InDel首先在单核苷酸多态性数据库(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp144.txt.gz.)、国际单倍型数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)、千人基因组计划(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)、炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)、外显子组变异数据库(http://evs.gs.Washington.edu/EVS/)及外显子组集合联合数据库(http://exac.broadinstitute.org/)等6个SNP数据库中进行比对[
应用Vector NTI软件将所发现的突变位点的蛋白序列在人、猩猩、犬、牛、猪、鼠、鸡及斑马鱼等多个物种中进行同源性分析和比对；在线工具PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)及ALIGN-GVGD (http://agvgd.iarc.fr/)预测氨基酸突变对蛋白功能的影响[
2 结果
3例患者及先证者父亲共检测到5个SNV (表 3)，滤过MAF值高于0.001的高频变异位点4个，可疑致病突变位点1个即FZD4基因c.478G > A。该突变位点所对应的氨基酸改变为FZD4基因所编码蛋白的第160号氨基酸从谷氨酸突变为赖氨酸(p.E160K)(图 4)。基因型和表型共分离验证结果，FZD4 p.E160K为患者的致病突变位点。
表3
3例患者及先证者父亲携带的所有遗传突变
图4
FZD4基因测序图。4A.先证者，FZD4基因第2外显子的c.478G > A p.E160K错义突变(黑箭)；4B.先证者父亲，该位点不存在突变
蛋白序列同源性分析结果显示，FZD4 p.E160K突变所对应的第160号氨基酸位点在多个物种中均高度保守(图 5)。在线软件预测结果显示，该突变PolyPhen-2得分为0.804，提示为可能有害，ALIGN-GVGD等级为C55，提示为可能有害。晶体结构分析结果提示，该突变能够引起第160号氨基酸位点与第152号天冬酰胺间的氢键消失，从而影响蛋白的三级结构(图 6)。
图5
FZD4蛋白序列在多个物种中的保守性分析图。FZD4 p.E160K突变所对应的第160号氨基酸位点在人(H. sapiens)、猩猩(P. troglodytes)、犬(C. lupus)、牛(B. taurus)、猪(S. scrofa)、鼠(M. musculus)、鸡(G. Gallus)、斑马鱼(D. rerio)中均高度保守(黑箭)
图6
FZD4蛋白的晶体结构分析图。6A.野生型FZD4蛋白第160号氨基酸位点的谷氨酸与第152号氨基酸位点的天冬酰胺间存在氢键连接；6B.突变型FZD4蛋白第160号氨基酸位点的赖氨酸与第152号氨基酸位点的天冬酰胺间的氢键消失
3 讨论
本研究在一个3代常染色体显性遗传FEVR家系中发现了FZD4基因新的致病突变p.E160K。FZD4基因位于人类染色体11q14.2，基因全长7383个碱基，包含2个外显子，其编码的FZD4蛋白包含有537个氨基酸。FZD4蛋白属于卷曲蛋白家族，为7次
跨膜蛋白，结构类似于G蛋白偶联型受体。FZD4蛋白的胞外段含有一个由10个半胱氨酸组成的半胱氨酸富集区(CRD)，该区在卷曲蛋白家族中高度保守，并决定了其与Wnt配体结合的特异性[16]。FZD4作用于胞质内的蓬乱蛋白(Dsh)，Dsh能切断β-链蛋白(beta-catenin)的降解途径，从而使β-链蛋白在细胞质中积累，并进入细胞核，调节靶基因的表达[17]。Wnt信号通路在视网膜的血管发育过程中调控内皮细胞的生长和发育。本研究发现的错义突变FZD4 p.E160K就位于该CRD区，且突变所在的第160号氨基酸位点在多物种中均高度保守性，提示该突变可能会影响FZD4蛋白与配体的结合而引起严重的临床表型。
FZD4基因突变具有显著的临床异质性。不同的FZD4基因突变所引起的蛋白功能异常并不相同，故携带有不同FZD4基因突变的患者其临床表现各异[18]；此外，即使在携带有同一FZD4基因突变的同一家系内部，不同患者的临床表现也各不相同[19]。与既往研究结果相一致，本研究家系中3例患者的临床表现同样存在较大差异。此前有研究表明，在一个家系中可能存在多个FEVR的致病基因突变，同时携带FZD4和LRP5突变的患者其临床症状更为严重[20, 21]。FZD4、LRP5基因均位于11号染色体，LRP5基因所编码的LRP5蛋白的胞外段与FZD4蛋白相互结合形成受体复合物，与NDP基因所编码的Wnt信号通路非典型配体Norrin蛋白相互作用，从而将Wnt信号从细胞外传递到细胞内[8, 17]。Qin等[22]通过实验证实，相较于单一突变，FZD4 p.R417Q和LRP5 p.R444C联合突变能够导致Wnt信号通路的活性显著降低。在本家系中，先证者母亲视力正常，而先证者及其外公视力明显较差。因此，我们推测先证者及其外公所检测出的LRP5 p.A1330V单核苷酸多态性位点可能对患者的表型具有潜在的调节作用。具体是如何发挥调节作用的，需要更进一步的研究结果证实。
FEVR具有明显的临床异质性，部分患者早期无明显视力异常，常规眼科检查容易漏诊。对于有明显家族史的家系，基因筛查更能明确诊断。本研究采取的目的基因筛查，有助于帮助患者更加明确地了解致病原因，为产前诊断或是试管婴儿胚胎移植前基因诊断提供重要依据；相比于全外显子组测序或是全基因组测序具有更加快速、简便、经济的优点。还有很多与FEVR有关的致病基因尚未被认知，新的致病基因的发现及其致病机制的研究，将有助于我们对该疾病的进一步认识。
家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)的遗传方式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X连锁遗传。Norrie病(NDP)、卷曲蛋白4(FZD4)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)、四旋蛋白12(TSPAN12)、锌指蛋白408(ZNF408)基因等5个基因被证实与FEVR有关[1-6]。其中，NDP、FZD4、LRP5及TSPAN12等4个基因编码的蛋白质在调节视网膜血管生成和发育的Norrin/β-肌动蛋白信号通路中发挥着重要的作用，而ZNF408基因所编码蛋白在该通路中是如何发挥作用目前研究尚未证实[7, 8]。这5个基因的突变可以解释50%左右的FEVR病例[9]。本研究针对NDP、FZD4、LRP5、TSPAN12及ZNF408此5个候选基因的全部编码区及外显子-内含子交界区剪切位点附近的序列进行测序，借助共分离验证及生物信息学分析，明确了一FEVR家系新的致病突变位点FZD4基因p.E160K。现将结果报道如下。
1 对象和方法
本研究获南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准；严格遵守赫尔辛基宣言，所有受试者或未成年监护人均签署知情同意书。
一个3代常染色体显性遗传FEVR家系(图 1)中3例患者及1例患者的配偶纳入研究。先证者(Ⅲ1)，男，5岁。足月顺产，否认吸氧史；1岁时父母发现其视物目光呆滞伴反应迟钝。双眼最佳矫正视力(BCVA)均为0.2。眼底检查，双眼可见黄白色视网膜下渗出，视网膜受玻璃体牵拉折叠呈镰刀状皱襞样(图 2)。先证者母亲(Ⅱ2)，33岁。BCVA：右眼0.8，左眼1.0。眼底检查，双眼周边部视网膜下黄白色渗出。荧光素眼底血管造影(FFA)检查，双眼周边视网膜血管可见荧光素渗漏，血管分支较多，末端呈毛刷样吻合，视网膜血管止端无灌注区(图 3)。先证者外公(Ⅰ1)，70岁。10余年前外院诊断为FEVR并因视网膜脱离行玻璃体切割手术；双眼白内障摘除手术后，BCVA均为0.15。先证者父亲(Ⅱ3)，35岁。双眼BCVA均为1.0。眼底及FFA检查均未见明显异常。依据临床检查结果并结合家系分析，患者符合常染色体显性遗传FEVR诊断标准[10]。
图1
患者家系图。■：男性患者；●：女性患者；□：正常男性；○：正常女性；↑：先证者；G/A和G/G分别代表正常者和患者在FZD4基因第478位的基因型
图2
先证者双眼彩色眼底像。2A.右眼；2B.左眼。视网膜下黄白色渗出，视网膜受玻璃体牵拉折叠呈镰刀状皱襞样
图3
先证者母亲双眼FFA像。3A.右眼；3B.左眼。视网膜颞侧周边血管中断，呈毛刷样吻合，明显无灌注区，交界处可见荧光素渗漏`
采集家系中患者及先证者父亲外周静脉血10 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用德国QIAGEN公司血液基因组DNA提取试剂盒按照标准操作流程提取全基因组DNA。应用Primer 5.0引物设计软件，设计针对候选致病基因NDP、FZD4、LRP5、TSPAN12及ZNF408的全部编码区及外显子-内含子交界区剪切位点附近
的序列引物(
表1
NDP、FZD4、LRP5基因扩增和测序引物
表2
TSPAN12、ZNF408基因扩增和测序引物
采用Chromas软件对原始测序结果进行分析，查找存在的单核苷酸杂合变异；应用Vector NTI软件对测序结果和NCBI人类基因组DNA序列进行比对，查找出单核苷酸纯和变异以及插入和缺失变异(InDel)，得到候选基因的全部变异。将检测出的单核苷酸变异(SNV)及InDel首先在单核苷酸多态性数据库(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp144.txt.gz.)、国际单倍型数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)、千人基因组计划(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)、炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)、外显子组变异数据库(http://evs.gs.Washington.edu/EVS/)及外显子组集合联合数据库(http://exac.broadinstitute.org/)等6个SNP数据库中进行比对[
应用Vector NTI软件将所发现的突变位点的蛋白序列在人、猩猩、犬、牛、猪、鼠、鸡及斑马鱼等多个物种中进行同源性分析和比对；在线工具PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)及ALIGN-GVGD (http://agvgd.iarc.fr/)预测氨基酸突变对蛋白功能的影响[
2 结果
3例患者及先证者父亲共检测到5个SNV (表 3)，滤过MAF值高于0.001的高频变异位点4个，可疑致病突变位点1个即FZD4基因c.478G > A。该突变位点所对应的氨基酸改变为FZD4基因所编码蛋白的第160号氨基酸从谷氨酸突变为赖氨酸(p.E160K)(图 4)。基因型和表型共分离验证结果，FZD4 p.E160K为患者的致病突变位点。
表3
3例患者及先证者父亲携带的所有遗传突变
图4
FZD4基因测序图。4A.先证者，FZD4基因第2外显子的c.478G > A p.E160K错义突变(黑箭)；4B.先证者父亲，该位点不存在突变
蛋白序列同源性分析结果显示，FZD4 p.E160K突变所对应的第160号氨基酸位点在多个物种中均高度保守(图 5)。在线软件预测结果显示，该突变PolyPhen-2得分为0.804，提示为可能有害，ALIGN-GVGD等级为C55，提示为可能有害。晶体结构分析结果提示，该突变能够引起第160号氨基酸位点与第152号天冬酰胺间的氢键消失，从而影响蛋白的三级结构(图 6)。
图5
FZD4蛋白序列在多个物种中的保守性分析图。FZD4 p.E160K突变所对应的第160号氨基酸位点在人(H. sapiens)、猩猩(P. troglodytes)、犬(C. lupus)、牛(B. taurus)、猪(S. scrofa)、鼠(M. musculus)、鸡(G. Gallus)、斑马鱼(D. rerio)中均高度保守(黑箭)
图6
FZD4蛋白的晶体结构分析图。6A.野生型FZD4蛋白第160号氨基酸位点的谷氨酸与第152号氨基酸位点的天冬酰胺间存在氢键连接；6B.突变型FZD4蛋白第160号氨基酸位点的赖氨酸与第152号氨基酸位点的天冬酰胺间的氢键消失
3 讨论
本研究在一个3代常染色体显性遗传FEVR家系中发现了FZD4基因新的致病突变p.E160K。FZD4基因位于人类染色体11q14.2，基因全长7383个碱基，包含2个外显子，其编码的FZD4蛋白包含有537个氨基酸。FZD4蛋白属于卷曲蛋白家族，为7次
跨膜蛋白，结构类似于G蛋白偶联型受体。FZD4蛋白的胞外段含有一个由10个半胱氨酸组成的半胱氨酸富集区(CRD)，该区在卷曲蛋白家族中高度保守，并决定了其与Wnt配体结合的特异性[16]。FZD4作用于胞质内的蓬乱蛋白(Dsh)，Dsh能切断β-链蛋白(beta-catenin)的降解途径，从而使β-链蛋白在细胞质中积累，并进入细胞核，调节靶基因的表达[17]。Wnt信号通路在视网膜的血管发育过程中调控内皮细胞的生长和发育。本研究发现的错义突变FZD4 p.E160K就位于该CRD区，且突变所在的第160号氨基酸位点在多物种中均高度保守性，提示该突变可能会影响FZD4蛋白与配体的结合而引起严重的临床表型。
FZD4基因突变具有显著的临床异质性。不同的FZD4基因突变所引起的蛋白功能异常并不相同，故携带有不同FZD4基因突变的患者其临床表现各异[18]；此外，即使在携带有同一FZD4基因突变的同一家系内部，不同患者的临床表现也各不相同[19]。与既往研究结果相一致，本研究家系中3例患者的临床表现同样存在较大差异。此前有研究表明，在一个家系中可能存在多个FEVR的致病基因突变，同时携带FZD4和LRP5突变的患者其临床症状更为严重[20, 21]。FZD4、LRP5基因均位于11号染色体，LRP5基因所编码的LRP5蛋白的胞外段与FZD4蛋白相互结合形成受体复合物，与NDP基因所编码的Wnt信号通路非典型配体Norrin蛋白相互作用，从而将Wnt信号从细胞外传递到细胞内[8, 17]。Qin等[22]通过实验证实，相较于单一突变，FZD4 p.R417Q和LRP5 p.R444C联合突变能够导致Wnt信号通路的活性显著降低。在本家系中，先证者母亲视力正常，而先证者及其外公视力明显较差。因此，我们推测先证者及其外公所检测出的LRP5 p.A1330V单核苷酸多态性位点可能对患者的表型具有潜在的调节作用。具体是如何发挥调节作用的，需要更进一步的研究结果证实。
FEVR具有明显的临床异质性，部分患者早期无明显视力异常，常规眼科检查容易漏诊。对于有明显家族史的家系，基因筛查更能明确诊断。本研究采取的目的基因筛查，有助于帮助患者更加明确地了解致病原因，为产前诊断或是试管婴儿胚胎移植前基因诊断提供重要依据；相比于全外显子组测序或是全基因组测序具有更加快速、简便、经济的优点。还有很多与FEVR有关的致病基因尚未被认知，新的致病基因的发现及其致病机制的研究，将有助于我们对该疾病的进一步认识。
