引用本文： 冯宇梁, 张明, 王春明, 李佳, 旦巧荣. IBI302对实验性脉络膜新生血管的干预作用及机制研究. 中华眼底病杂志, 2016, 32(2): 177-183. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.02.015 复制
玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(VEGF)药物是目前治疗渗出型老年性黄斑变性(AMD)的常用方法，但存在需反复注射、停药后病变易复发，长期注射后视网膜出血、瘢痕形成以及接受治疗眼远期视力仍有下降可能等问题；此外，对萎缩型AMD无效[1-5]。研究发现，补体通路异常活化在AMD发生发展过程中具有重要作用，可能是导致抗VEGF药物临床不良后果的原因；因而成为AMD治疗研究的又一热点[6-10]。IBI302为重组人VEGF受体(VEGFR)-抗体-人补体受体1融合蛋白注射液，包含VEGF抑制结构域(VID)端、人IgG1的Fc段和补体抑制结构域(CID)端，一次给药可同时抑制VEGF和补体两个通路激活，起到联合治疗、减少眼内注射频率的作用。为了进一步验证探索IBI302对VEGF和补体通路的作用效果及其作用机制，本研究通过体外实验观察了IBI302对VEGF和补体生物活性的抑制作用，并通过与抗VEGF药物贝伐珠单抗治疗效果比较，观察探讨了IBI302对激光诱导的恒河猴脉络膜新生血管(CNV)的干预作用及其机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 实验材料
普通级恒河猴，生产许可证号SCXK(川) 2014-027(雅安普莱美生物科技有限公司)。IBI302(相对分子质量140 388.8 Da)、VID和CID[信达生物制药(苏州)有限公司]；贝伐珠单抗注射液(罗氏制药)。胎盘生长因子(PlGF)、VEGF-A165、VEGF-A121(美国R＆D公司)；C3b、C4b(南京肯特复合材料有限公司)；人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC，美国模式菌种收集中心)；HUVEC基础培养基(美国Allcells公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；细胞计数(CCK-8)显色试剂盒(日本同仁化学研究所)；96孔板、Transwell板、6孔板(美国Corning公司)；抗VEGFR、磷酸化VEGFR(P-VEGFR)、细胞外信号调节激酶 (Erk)、磷酸化Erk(P-Erk)、丝苏氨酸蛋白激酶(Akt)、磷酸化Akt(P-Akt)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；结晶紫染色液(上海碧云天生物技术研究所)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、增强化学发光(ECL)试剂盒(美国Millipore公司)；绵阳红细胞、兔抗绵羊红细胞血清(郑州百基生物科技有限公司)。人血清补体(美国Sigma公司)。酶标仪、台式冷冻离心机、CO2培养箱(美国Thermo公司)；紫外分光光度计(日本岛津公司)；倒置显微镜(德国徕卡公司)。
1.2 IBI302与VEGF、补体家族细胞因子亲和力试验
酶联免疫吸附测定法观察IBI302与VEGF家族细胞因子和补体蛋白的亲和力。碳酸盐缓冲液溶解VEGF-A165、VEGF-A121、PlGF至终浓度0.5 μg/ml和C3b、C4b至终浓度2.5 μg/ml。取96孔板5块板分别用于上述5种因子溶液，每板80孔加入一种因子溶液100 μl、另16孔加入磷酸盐缓冲液(PBS)，4℃条件下孵育过夜。然后用1%牛血清白蛋白溶液封闭1 h，弃去封闭液，每板已用的80孔加入IgG、VID、CID、IBI302溶液(每种10个不同浓度，每种每个浓度两份复孔)各100 μl，4℃条件下孵育过夜。每孔用PBS洗涤3次，加入辣根过氧化物酶-羊抗人二抗孵育1 h，PBS洗涤后加入四甲基联苯胺溶液显色，用酶标仪测定450 nm波长下的吸光度[A，旧称光密度(OD)]值。
1.3 IBI302对VEGF诱导HUVEC增生、迁移、管腔形成以及信号通路的影响
取对数生长期HUVEC调整细胞悬液密度为2×104个/ml，96孔板中每孔加入100 μl，用HUVEC基础培养基在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。将浓度为35 nmol/L的IgG、IBI302、VID、CID与浓度为0.3 nmol/L的VEGF-A165预孵育30 min，再作用于HUVEC，在37℃、5% CO2条件下再培养24 h。加入10%的CCK-8溶液，37℃放置4 h。酶标仪450 nm波长下测定A值。取对数生长期HUVEC，以细胞密度3×106个/μl 悬于含1% 胎牛血清的HUVEC基础培养基中并接种于Transwell板内室。将浓度为35 nmol/L的IgG、IBI302、VID、CID与浓度为0.3 nmol/L 的VEGF-A165预孵育30 min，加入Transwell外室。37℃孵育24 h后，弃孔中培养液乙醇固定细胞。棉签擦去内室上层未迁移的细胞，结晶紫常温染色，显微镜下观察HUVEC迁移情况并拍照。取对数生长期HUVEC以细胞密度3×106个/μl 悬于含1% 胎牛血清的HUVEC基础培养基中，加入浓度为350 nmol/L的IgG、IBI302、VID、CID，再加入浓度为0.3 nmol/L的VEGF-A165，混合均匀后接种于基质胶表面，在37℃、5% CO2条件下培养6 h后照相观察。取对数生长期HUVEC以细胞密度5×105个/孔 接种于6孔板，37℃、5% CO2条件下培养24 h后加入3 nmol/L的IgG、IBI302、VID、CID，作用30 min后再加入0.3 nmol/L的VEGF-A165，作用10 min后收集细胞。细胞用十二烷基磺酸钠(SDS)凝胶上样缓冲液裂解，沸水浴中加热解热变性。取上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后湿转系统将蛋白转移至PVDF膜，将膜置于一抗溶液中温育。用洗膜缓冲液洗涤。将膜置于二抗溶液中室温反应2 h，洗膜缓冲液洗涤3次后，ECL试剂发色显影。
1.4 IBI302对补体经典途径、补体旁路途径介导溶血的抑制作用
调整绵羊红细胞密度至1×109个/ml与1:1000稀释的兔抗绵羊红细胞血清等体积混合。置37℃恒温摇床180 r/min条件下震摇45 min后置于冰上45 min，致敏后用PBS洗涤并悬浮于PBS中，取0.5 ml细胞悬液加入7 ml超纯水中，541 nm波长下测定A值并按公式1×109个/ml×A541/0.7计算致敏绵羊红细胞密度。将0～500 nmol/L的IBI302、VID、CID加到96孔板中，每孔100 μl，以50 μl/孔加入10倍稀释的补体置于37℃恒温摇床，在180 r/min条件下震摇45 min。每孔以4×108个/ml细胞密度 加入致敏绵羊红细胞50 μl，置于37℃恒温摇床180 r/min 条件下震摇45 min。15℃温度下以1000×g离心3 min，取上清液100 μl加到另一96孔板中，用酶标仪测量405 nm波长下A值。取兔红细胞PBS洗涤至澄清后再重新悬浮，取0.5 ml细胞悬液加到7 ml超纯水中，紫外分光计在541 nm波长测定A值并按公式1×109个/ml×A541/0.7计算红细胞密度。将0～500 nmol/L的IBI302、VID、CID加到96孔板中，每孔100 μl，再以25 μl/孔加入补体置于37℃恒温摇 床180 r/min条件下震摇45 min。每孔以3×108个/ml 细胞密度加入兔红细胞50 μl，置于37℃恒温摇床180 r/min条件下震摇45 min。15℃温度下以1000×g 离心3 min，取上清液100 μl加到另一96孔板中，用酶标仪测量405 nm波长下A值。
1.5 IBI302对激光诱导恒河猴CNV的干预作用
恒河猴麻醉、散瞳，经全视网膜镜行激光光凝。光斑直径50 μm，能量0.6 W，曝光时间0.05 s，围绕黄斑中心凹之外共9个点。以提示Bruch膜被击破的气泡产生为CNV模型建立成功。激光光凝前以及激光光凝后20d分别采用TOPCON眼底造影系统行眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影(FFA)检查。选择双眼造模成功的25只恒河猴分为模型对照组、贝伐珠单抗注射组以及IBI302 0.25、0.50、1.25 mg组，每组5只猴，雌雄兼有。激光光凝后21 d，模型对照组、贝伐珠单抗注射组恒河猴分别经玻璃体腔单次注射0.9%氯化钠注射液或1.25 mg贝伐珠单抗注射液，每只眼注射50 μl；IBI302 0.25、0.50、1.25 mg组恒河猴经玻璃体腔单次注射相应浓度IBI302，每只眼注射50 μl。给药后14、28 d行FFA，并采用海德堡光相干断层扫描(OCT)仪行OCT检查。观察IBI302对激光诱导恒河猴CNV模型眼底荧光素渗漏面积及视网膜厚度的影响。其中，渗漏面积以TOPCON眼底造影系统自带测量工具及计算软件进行测量计算；视网膜厚度以海德堡OCT5.3版本软件自带测量工具直接测量而得。给药后29 d，对比分析各组恒河猴房水中VEGF水平；同时对眼球标本苏木精-伊红(HE)及马松三色染色，观察IBI302对激光诱导恒河猴CNV模型眼组织病理学改变的影响。
1.6 统计学方法
SPSS 13.0统计软件行统计学分析。单因素方差分析对数据行方差齐性检验。方差齐性时，组间比较采用Dunnet-T检验；方差不齐时，组间比较采用Dunnet-T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
IBI302和VID对VEGF-A121和PlGF均有较强的亲和性，且两者亲和力相当，差异无统计学意义(P＞0.05)。IBI302和VEGF-A165有特异性高度亲和，其亲和力略低于VID，但差异无统计学意义(P＞0.05)。IBI302和CID对C3b和C4b蛋白有一定的亲和性；两者对C3b的亲和力相当，差异无统计学意义(P＞0.05)；IBI302对C4b的亲和力明显高于CID，差异有统计学意义(P＜0.05)(图 1)。
图1
IBI302与VEGF家族蛋 白、补体家族蛋白的亲和曲线。1A.VEGF-A121；1B.VEGF-A165；1C.PIGF；1D.C3b；1E.C4b
IBI302和VID均能明显抑制VEGF诱导的HUVEC增生；两者作用效果相当，差异无统计学意义(P＞0.05)(图 2)。IBI302、VID、CID对VEGF诱导的HUVEC迁移均具有明显的抑制作用；IBI302和VID作用效果相当，差异无统计学意义(P＞0.05)；IBI302和VID的作用效果均明显优于CID，差异有统计学意义(P＜0.05)(图 3)。IBI302和VID均能明显抑制VEGF诱导的HUVEC管腔形成；两者作用效果相当，差异无统计学意义(P＞0.05)。CID对VEGF诱导的HUVEC管腔形成无明显作用(图 4)。IBI302和VID均可抑制VEGF诱导的HUVEC的VEGFR、Erk和Akt磷酸化，降低p-VEGFR、p-Erk、p-Akt与VEGFR、Erk、Akt的比值；两者作用效果相当，差异无统计学意义(P＞0.05)。CID对VEGF诱导的HUVEC信号通路无明显影响(图 5)。
图2
不同药物对VEGF诱导HUVEC增生的抑制作用比较
图3
不同药物抑制VEGF诱导HUVEC迁移染色像。3A.HUVEC基础培养基；3B.VEGF；3C.IgG+VEGF；3D.VID+VEGF；3E.CID+VEGF；3F.IBI302+VEGF。可见经IBI302、VID、CID培养后，迁移的HUVEC明显减少 结晶紫 ×20 图 4 不同药物抑制VEGF诱导HUVEC管腔形成实验像。4A.HUVEC基础培养基；4B.VEGF；4C.IgG+VEGF；4D.VID+VEGF；4E.CID+VEGF；4F.IBI302+VEGF。可见经IBI302、VID培养后，HUVEC管腔形成明显减少 ×20
图5
不同药物阻断VEGF诱导HUVEC信号通路电泳像
IBI302和CID均可抑制补体经典途径介导的绵羊红细胞溶血；两者作用效果相当，差异无统计学意义(P＞0.05)。VID对补体经典途径介导的绵羊红细胞溶血没有影响。IBI302和CID均可抑制补体旁路途径介导的兔红细胞溶血；两者作用效果相当，差异无统计学意义(P＞0.05)。VID对补体旁路途径介导的兔红细胞溶血没有影响(图 6)。
图6
不同药物对补体经典途径和旁路途径介导溶血的抑制作用比较
给药后14、28 d，IBI302 0.25、0.50、1.25 mg组恒河猴眼底荧光斑及荧光素渗漏面积明显减小；3组之间荧光素渗漏面积及渗漏面积减小率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。贝伐珠单抗注射组恒河猴眼底 的荧光斑和荧光素渗漏面积也明显减小，其荧光素渗漏面积减小率较IBI302各浓度组偏小，但差异无统计学意义(P＞0.05)(图 7，8)。
图7
各组荧光素渗漏面积比较
图8
各组荧光素渗漏面积改善率比较
给药后14、28 d，IBI302 0.25、0.50、1.25 mg组恒河猴视网膜厚度均明显下降；3组之间视网膜厚度比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。贝伐珠单抗注射组恒河猴视网膜厚度也明显下降，其视网膜厚度下降率较IBI302各浓度组偏小，差异有统计学意义(P＜0.05)(图 9，10)。
图9
各组视网膜厚度比较
图10
各组视网膜厚度下降率比较
给药后29 d，模型对照组、贝伐珠单抗注射组恒河猴房水VEGF浓度分别为(94.203±17.360)、(38.644±6..21) pg/ml；贝伐珠单抗注射组恒河猴房水VEGF浓度较模型对照组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。IBI302各浓度组恒河猴房水VEGF浓度均低于定量下限31.300 pg/ml。HE染色结果显示，模型对照组、贝伐珠单抗注射组及IBI302各浓度组所有眼球标本均出现了灶性视网膜脉络膜纤维组织增生，分别有3、4、1、0、4只眼球出现灶性神经上皮脱离。贝伐珠单抗注射组及IBI302各浓度组上述病变的严重程度均较模型对照组轻(图 11)。马松三色染色结果显示，与模型对照组比较，贝伐珠单抗注射组及IBI302各浓度组增生纤维组织阳性强度无明显差异；贝伐珠单抗注射组及IBI302 各浓度组的阳性分布明显减少，其中IBI302 1.25 mg组1 只眼球未见阳性染色(图 12)。
图11
眼球标本HE染色像。11A.模型对照组；11B.贝伐珠单抗注射组；11C.IBI302 1.25 mg组。均可见局灶性视网膜脉络膜纤维组织增生和局灶性神经上皮脱离，贝伐珠单抗注射组和IBI302 1.25 mg组病变程度更轻 HE ×200 图 12 眼球标本马松三色染色像。12A.模型对照组；12B.贝伐珠单抗注射组；12C.IBI302 1.25 mg组。均可见病灶内增生纤维组织呈蓝色染色，贝伐珠单抗注射组及IBI302 1.25 mg组蓝色染色分布较模型对照组明显减少 马松三色 ×200
3 讨论
AMD可以分为萎缩型和渗出型。萎缩型与渗出型AMD之间可以相互转化，二者甚至可以同时出现在同一患眼中。大约10%～15%的轻度萎缩型AMD可以发展为渗出型AMD。尽管两种形式的AMD临床表现存在一定差异，但其主要病变组织位点是相同的，即视网膜色素上皮(RPE)和Bruch膜之间有细胞外物质沉积以及血视网膜屏障和Bruch膜完整性丧失[11]。补体系统的激活对RPE损伤有直接作用，一方面导致RPE萎缩，诱导视网膜中心细胞萎缩，从而形成地图样萎缩；另一方面破坏血视网膜屏障，导致炎症发生，VEGF-A高表达，新生血管生成，从而形成渗出型AMD。虽然目前以雷珠单抗为代表的抗VEGF药物已经成为AMD的一线治疗药物，但仍然存在很多问题[2, 12-14]，如有效率低、长期用药后疗效降低、停药后复发以及对萎缩型AMD无效等。
IBI302为双特异性重组全人源融合蛋白，包含VID端和CID端。VID端由VEGFR-1的免疫球蛋白样区域2和VEGFR-2的免疫球蛋白样区域3构成；CID端由CR1的免疫球蛋白样区域1、2、3组成，CR1是补体活化调节因子家族成员之一，通过特异性结合C4b和C3b而抑制C3和C5转化酶的活性并阻断补体通路的过度活化。VID端能够阻断VEGF的活性，抑制VEGF诱导的血管新生；CID端能够阻断补体通路的活化，抑制补体介导的炎症反应。IBI302同时具有抗VEGF和抗补体的活性，预期对AMD的治疗作用优于单纯的VEGF抑制剂。
本研究通过抗VEGF和抗补体两方面的实验考察了IBI302对VEGF通路和补体通路的双重抑制作用，并与VID和CID进行比较。结果表明，IBI302与VEGF家族细胞因子VEGF-A165、VEGF-A121和PlGF的亲和力与VID基本相同，IBI302与C3b和C4b的亲和力与CID基本相同。提示IBI302的分子结构符合预期设计目标。IBI302对VEGF诱导的HUVEC增生、迁移和管腔形成具有明显的抑制作用，其作用机制可能与抑制VEGFR、Erk和Akt的磷酸化有关。IBI302的作用效果与VID基本相同，但是CID对VEGF的生物活性没有明显影响。IBI302对补体经典途径和旁路途径介导溶血的抑制作用与CID基本相同，但是VID对补体介导的溶血没有明显影响。提示IBI302的作用机制符合预期，能够双重阻断VEGF和补体的生物活性。在激光诱导恒河猴CNV模型中，IBI302能够显著降低荧光斑的大小、减小渗漏面积和降低视网膜厚度、降低房水内VEGF的水平和减轻眼组织的病理组织学损伤，且IBI302的作用效果优于贝伐珠单抗注射液。提示IBI302不仅通过抑制VEGF的活性而治疗CNV，而且可能通过阻断补体活性治疗CNV。由于IBI302的双重作用机制，使其作用效果优于贝伐珠单抗注射液。以上结果提示IBI302不仅能够通过VID结合并阻断VEGF与VEGFR-1和VEGFR-2的结合，抑制VEGF介导的血管新生；而且能够通过CID结合C3b和C4b并阻断补体异常活化介导的炎症反应，对AMD的治疗效果可能优于现有的抗VEGF药物。
本研究结果表明，IBI302作为一种双靶向生物药物，具有对VEGF通路和补体通路的双重抑制作用，不仅可能对渗出型AMD具有非常好的治疗前景，而且可能用于萎缩型AMD的治疗，有望成为新一代抗AMD药物。但我们在体内研究中未探索IBI302对补体指标的作用效果，也未设计萎缩型AMD动物模型探索IBI302对萎缩型AMD的干预作用。此外，本研究未直接比较IBI302的作用效果与VID和CID联合作用的效果，这主要是考虑本实验中所用的体外模型通常是由VEGF或者补体中一种因素诱导。上述的研究缺陷有待后期通过恰当的动物模型进行深入研究。
玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(VEGF)药物是目前治疗渗出型老年性黄斑变性(AMD)的常用方法，但存在需反复注射、停药后病变易复发，长期注射后视网膜出血、瘢痕形成以及接受治疗眼远期视力仍有下降可能等问题；此外，对萎缩型AMD无效[1-5]。研究发现，补体通路异常活化在AMD发生发展过程中具有重要作用，可能是导致抗VEGF药物临床不良后果的原因；因而成为AMD治疗研究的又一热点[6-10]。IBI302为重组人VEGF受体(VEGFR)-抗体-人补体受体1融合蛋白注射液，包含VEGF抑制结构域(VID)端、人IgG1的Fc段和补体抑制结构域(CID)端，一次给药可同时抑制VEGF和补体两个通路激活，起到联合治疗、减少眼内注射频率的作用。为了进一步验证探索IBI302对VEGF和补体通路的作用效果及其作用机制，本研究通过体外实验观察了IBI302对VEGF和补体生物活性的抑制作用，并通过与抗VEGF药物贝伐珠单抗治疗效果比较，观察探讨了IBI302对激光诱导的恒河猴脉络膜新生血管(CNV)的干预作用及其机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 实验材料
普通级恒河猴，生产许可证号SCXK(川) 2014-027(雅安普莱美生物科技有限公司)。IBI302(相对分子质量140 388.8 Da)、VID和CID[信达生物制药(苏州)有限公司]；贝伐珠单抗注射液(罗氏制药)。胎盘生长因子(PlGF)、VEGF-A165、VEGF-A121(美国R＆D公司)；C3b、C4b(南京肯特复合材料有限公司)；人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC，美国模式菌种收集中心)；HUVEC基础培养基(美国Allcells公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；细胞计数(CCK-8)显色试剂盒(日本同仁化学研究所)；96孔板、Transwell板、6孔板(美国Corning公司)；抗VEGFR、磷酸化VEGFR(P-VEGFR)、细胞外信号调节激酶 (Erk)、磷酸化Erk(P-Erk)、丝苏氨酸蛋白激酶(Akt)、磷酸化Akt(P-Akt)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；结晶紫染色液(上海碧云天生物技术研究所)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、增强化学发光(ECL)试剂盒(美国Millipore公司)；绵阳红细胞、兔抗绵羊红细胞血清(郑州百基生物科技有限公司)。人血清补体(美国Sigma公司)。酶标仪、台式冷冻离心机、CO2培养箱(美国Thermo公司)；紫外分光光度计(日本岛津公司)；倒置显微镜(德国徕卡公司)。
1.2 IBI302与VEGF、补体家族细胞因子亲和力试验
酶联免疫吸附测定法观察IBI302与VEGF家族细胞因子和补体蛋白的亲和力。碳酸盐缓冲液溶解VEGF-A165、VEGF-A121、PlGF至终浓度0.5 μg/ml和C3b、C4b至终浓度2.5 μg/ml。取96孔板5块板分别用于上述5种因子溶液，每板80孔加入一种因子溶液100 μl、另16孔加入磷酸盐缓冲液(PBS)，4℃条件下孵育过夜。然后用1%牛血清白蛋白溶液封闭1 h，弃去封闭液，每板已用的80孔加入IgG、VID、CID、IBI302溶液(每种10个不同浓度，每种每个浓度两份复孔)各100 μl，4℃条件下孵育过夜。每孔用PBS洗涤3次，加入辣根过氧化物酶-羊抗人二抗孵育1 h，PBS洗涤后加入四甲基联苯胺溶液显色，用酶标仪测定450 nm波长下的吸光度[A，旧称光密度(OD)]值。
1.3 IBI302对VEGF诱导HUVEC增生、迁移、管腔形成以及信号通路的影响
取对数生长期HUVEC调整细胞悬液密度为2×104个/ml，96孔板中每孔加入100 μl，用HUVEC基础培养基在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。将浓度为35 nmol/L的IgG、IBI302、VID、CID与浓度为0.3 nmol/L的VEGF-A165预孵育30 min，再作用于HUVEC，在37℃、5% CO2条件下再培养24 h。加入10%的CCK-8溶液，37℃放置4 h。酶标仪450 nm波长下测定A值。取对数生长期HUVEC，以细胞密度3×106个/μl 悬于含1% 胎牛血清的HUVEC基础培养基中并接种于Transwell板内室。将浓度为35 nmol/L的IgG、IBI302、VID、CID与浓度为0.3 nmol/L 的VEGF-A165预孵育30 min，加入Transwell外室。37℃孵育24 h后，弃孔中培养液乙醇固定细胞。棉签擦去内室上层未迁移的细胞，结晶紫常温染色，显微镜下观察HUVEC迁移情况并拍照。取对数生长期HUVEC以细胞密度3×106个/μl 悬于含1% 胎牛血清的HUVEC基础培养基中，加入浓度为350 nmol/L的IgG、IBI302、VID、CID，再加入浓度为0.3 nmol/L的VEGF-A165，混合均匀后接种于基质胶表面，在37℃、5% CO2条件下培养6 h后照相观察。取对数生长期HUVEC以细胞密度5×105个/孔 接种于6孔板，37℃、5% CO2条件下培养24 h后加入3 nmol/L的IgG、IBI302、VID、CID，作用30 min后再加入0.3 nmol/L的VEGF-A165，作用10 min后收集细胞。细胞用十二烷基磺酸钠(SDS)凝胶上样缓冲液裂解，沸水浴中加热解热变性。取上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后湿转系统将蛋白转移至PVDF膜，将膜置于一抗溶液中温育。用洗膜缓冲液洗涤。将膜置于二抗溶液中室温反应2 h，洗膜缓冲液洗涤3次后，ECL试剂发色显影。
1.4 IBI302对补体经典途径、补体旁路途径介导溶血的抑制作用
调整绵羊红细胞密度至1×109个/ml与1:1000稀释的兔抗绵羊红细胞血清等体积混合。置37℃恒温摇床180 r/min条件下震摇45 min后置于冰上45 min，致敏后用PBS洗涤并悬浮于PBS中，取0.5 ml细胞悬液加入7 ml超纯水中，541 nm波长下测定A值并按公式1×109个/ml×A541/0.7计算致敏绵羊红细胞密度。将0～500 nmol/L的IBI302、VID、CID加到96孔板中，每孔100 μl，以50 μl/孔加入10倍稀释的补体置于37℃恒温摇床，在180 r/min条件下震摇45 min。每孔以4×108个/ml细胞密度 加入致敏绵羊红细胞50 μl，置于37℃恒温摇床180 r/min 条件下震摇45 min。15℃温度下以1000×g离心3 min，取上清液100 μl加到另一96孔板中，用酶标仪测量405 nm波长下A值。取兔红细胞PBS洗涤至澄清后再重新悬浮，取0.5 ml细胞悬液加到7 ml超纯水中，紫外分光计在541 nm波长测定A值并按公式1×109个/ml×A541/0.7计算红细胞密度。将0～500 nmol/L的IBI302、VID、CID加到96孔板中，每孔100 μl，再以25 μl/孔加入补体置于37℃恒温摇 床180 r/min条件下震摇45 min。每孔以3×108个/ml 细胞密度加入兔红细胞50 μl，置于37℃恒温摇床180 r/min条件下震摇45 min。15℃温度下以1000×g 离心3 min，取上清液100 μl加到另一96孔板中，用酶标仪测量405 nm波长下A值。
1.5 IBI302对激光诱导恒河猴CNV的干预作用
恒河猴麻醉、散瞳，经全视网膜镜行激光光凝。光斑直径50 μm，能量0.6 W，曝光时间0.05 s，围绕黄斑中心凹之外共9个点。以提示Bruch膜被击破的气泡产生为CNV模型建立成功。激光光凝前以及激光光凝后20d分别采用TOPCON眼底造影系统行眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影(FFA)检查。选择双眼造模成功的25只恒河猴分为模型对照组、贝伐珠单抗注射组以及IBI302 0.25、0.50、1.25 mg组，每组5只猴，雌雄兼有。激光光凝后21 d，模型对照组、贝伐珠单抗注射组恒河猴分别经玻璃体腔单次注射0.9%氯化钠注射液或1.25 mg贝伐珠单抗注射液，每只眼注射50 μl；IBI302 0.25、0.50、1.25 mg组恒河猴经玻璃体腔单次注射相应浓度IBI302，每只眼注射50 μl。给药后14、28 d行FFA，并采用海德堡光相干断层扫描(OCT)仪行OCT检查。观察IBI302对激光诱导恒河猴CNV模型眼底荧光素渗漏面积及视网膜厚度的影响。其中，渗漏面积以TOPCON眼底造影系统自带测量工具及计算软件进行测量计算；视网膜厚度以海德堡OCT5.3版本软件自带测量工具直接测量而得。给药后29 d，对比分析各组恒河猴房水中VEGF水平；同时对眼球标本苏木精-伊红(HE)及马松三色染色，观察IBI302对激光诱导恒河猴CNV模型眼组织病理学改变的影响。
1.6 统计学方法
SPSS 13.0统计软件行统计学分析。单因素方差分析对数据行方差齐性检验。方差齐性时，组间比较采用Dunnet-T检验；方差不齐时，组间比较采用Dunnet-T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
IBI302和VID对VEGF-A121和PlGF均有较强的亲和性，且两者亲和力相当，差异无统计学意义(P＞0.05)。IBI302和VEGF-A165有特异性高度亲和，其亲和力略低于VID，但差异无统计学意义(P＞0.05)。IBI302和CID对C3b和C4b蛋白有一定的亲和性；两者对C3b的亲和力相当，差异无统计学意义(P＞0.05)；IBI302对C4b的亲和力明显高于CID，差异有统计学意义(P＜0.05)(图 1)。
图1
IBI302与VEGF家族蛋 白、补体家族蛋白的亲和曲线。1A.VEGF-A121；1B.VEGF-A165；1C.PIGF；1D.C3b；1E.C4b
IBI302和VID均能明显抑制VEGF诱导的HUVEC增生；两者作用效果相当，差异无统计学意义(P＞0.05)(图 2)。IBI302、VID、CID对VEGF诱导的HUVEC迁移均具有明显的抑制作用；IBI302和VID作用效果相当，差异无统计学意义(P＞0.05)；IBI302和VID的作用效果均明显优于CID，差异有统计学意义(P＜0.05)(图 3)。IBI302和VID均能明显抑制VEGF诱导的HUVEC管腔形成；两者作用效果相当，差异无统计学意义(P＞0.05)。CID对VEGF诱导的HUVEC管腔形成无明显作用(图 4)。IBI302和VID均可抑制VEGF诱导的HUVEC的VEGFR、Erk和Akt磷酸化，降低p-VEGFR、p-Erk、p-Akt与VEGFR、Erk、Akt的比值；两者作用效果相当，差异无统计学意义(P＞0.05)。CID对VEGF诱导的HUVEC信号通路无明显影响(图 5)。
图2
不同药物对VEGF诱导HUVEC增生的抑制作用比较
图3
不同药物抑制VEGF诱导HUVEC迁移染色像。3A.HUVEC基础培养基；3B.VEGF；3C.IgG+VEGF；3D.VID+VEGF；3E.CID+VEGF；3F.IBI302+VEGF。可见经IBI302、VID、CID培养后，迁移的HUVEC明显减少 结晶紫 ×20 图 4 不同药物抑制VEGF诱导HUVEC管腔形成实验像。4A.HUVEC基础培养基；4B.VEGF；4C.IgG+VEGF；4D.VID+VEGF；4E.CID+VEGF；4F.IBI302+VEGF。可见经IBI302、VID培养后，HUVEC管腔形成明显减少 ×20
图5
不同药物阻断VEGF诱导HUVEC信号通路电泳像
IBI302和CID均可抑制补体经典途径介导的绵羊红细胞溶血；两者作用效果相当，差异无统计学意义(P＞0.05)。VID对补体经典途径介导的绵羊红细胞溶血没有影响。IBI302和CID均可抑制补体旁路途径介导的兔红细胞溶血；两者作用效果相当，差异无统计学意义(P＞0.05)。VID对补体旁路途径介导的兔红细胞溶血没有影响(图 6)。
图6
不同药物对补体经典途径和旁路途径介导溶血的抑制作用比较
给药后14、28 d，IBI302 0.25、0.50、1.25 mg组恒河猴眼底荧光斑及荧光素渗漏面积明显减小；3组之间荧光素渗漏面积及渗漏面积减小率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。贝伐珠单抗注射组恒河猴眼底 的荧光斑和荧光素渗漏面积也明显减小，其荧光素渗漏面积减小率较IBI302各浓度组偏小，但差异无统计学意义(P＞0.05)(图 7，8)。
图7
各组荧光素渗漏面积比较
图8
各组荧光素渗漏面积改善率比较
给药后14、28 d，IBI302 0.25、0.50、1.25 mg组恒河猴视网膜厚度均明显下降；3组之间视网膜厚度比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。贝伐珠单抗注射组恒河猴视网膜厚度也明显下降，其视网膜厚度下降率较IBI302各浓度组偏小，差异有统计学意义(P＜0.05)(图 9，10)。
图9
各组视网膜厚度比较
图10
各组视网膜厚度下降率比较
给药后29 d，模型对照组、贝伐珠单抗注射组恒河猴房水VEGF浓度分别为(94.203±17.360)、(38.644±6..21) pg/ml；贝伐珠单抗注射组恒河猴房水VEGF浓度较模型对照组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。IBI302各浓度组恒河猴房水VEGF浓度均低于定量下限31.300 pg/ml。HE染色结果显示，模型对照组、贝伐珠单抗注射组及IBI302各浓度组所有眼球标本均出现了灶性视网膜脉络膜纤维组织增生，分别有3、4、1、0、4只眼球出现灶性神经上皮脱离。贝伐珠单抗注射组及IBI302各浓度组上述病变的严重程度均较模型对照组轻(图 11)。马松三色染色结果显示，与模型对照组比较，贝伐珠单抗注射组及IBI302各浓度组增生纤维组织阳性强度无明显差异；贝伐珠单抗注射组及IBI302 各浓度组的阳性分布明显减少，其中IBI302 1.25 mg组1 只眼球未见阳性染色(图 12)。
图11
眼球标本HE染色像。11A.模型对照组；11B.贝伐珠单抗注射组；11C.IBI302 1.25 mg组。均可见局灶性视网膜脉络膜纤维组织增生和局灶性神经上皮脱离，贝伐珠单抗注射组和IBI302 1.25 mg组病变程度更轻 HE ×200 图 12 眼球标本马松三色染色像。12A.模型对照组；12B.贝伐珠单抗注射组；12C.IBI302 1.25 mg组。均可见病灶内增生纤维组织呈蓝色染色，贝伐珠单抗注射组及IBI302 1.25 mg组蓝色染色分布较模型对照组明显减少 马松三色 ×200
3 讨论
AMD可以分为萎缩型和渗出型。萎缩型与渗出型AMD之间可以相互转化，二者甚至可以同时出现在同一患眼中。大约10%～15%的轻度萎缩型AMD可以发展为渗出型AMD。尽管两种形式的AMD临床表现存在一定差异，但其主要病变组织位点是相同的，即视网膜色素上皮(RPE)和Bruch膜之间有细胞外物质沉积以及血视网膜屏障和Bruch膜完整性丧失[11]。补体系统的激活对RPE损伤有直接作用，一方面导致RPE萎缩，诱导视网膜中心细胞萎缩，从而形成地图样萎缩；另一方面破坏血视网膜屏障，导致炎症发生，VEGF-A高表达，新生血管生成，从而形成渗出型AMD。虽然目前以雷珠单抗为代表的抗VEGF药物已经成为AMD的一线治疗药物，但仍然存在很多问题[2, 12-14]，如有效率低、长期用药后疗效降低、停药后复发以及对萎缩型AMD无效等。
IBI302为双特异性重组全人源融合蛋白，包含VID端和CID端。VID端由VEGFR-1的免疫球蛋白样区域2和VEGFR-2的免疫球蛋白样区域3构成；CID端由CR1的免疫球蛋白样区域1、2、3组成，CR1是补体活化调节因子家族成员之一，通过特异性结合C4b和C3b而抑制C3和C5转化酶的活性并阻断补体通路的过度活化。VID端能够阻断VEGF的活性，抑制VEGF诱导的血管新生；CID端能够阻断补体通路的活化，抑制补体介导的炎症反应。IBI302同时具有抗VEGF和抗补体的活性，预期对AMD的治疗作用优于单纯的VEGF抑制剂。
本研究通过抗VEGF和抗补体两方面的实验考察了IBI302对VEGF通路和补体通路的双重抑制作用，并与VID和CID进行比较。结果表明，IBI302与VEGF家族细胞因子VEGF-A165、VEGF-A121和PlGF的亲和力与VID基本相同，IBI302与C3b和C4b的亲和力与CID基本相同。提示IBI302的分子结构符合预期设计目标。IBI302对VEGF诱导的HUVEC增生、迁移和管腔形成具有明显的抑制作用，其作用机制可能与抑制VEGFR、Erk和Akt的磷酸化有关。IBI302的作用效果与VID基本相同，但是CID对VEGF的生物活性没有明显影响。IBI302对补体经典途径和旁路途径介导溶血的抑制作用与CID基本相同，但是VID对补体介导的溶血没有明显影响。提示IBI302的作用机制符合预期，能够双重阻断VEGF和补体的生物活性。在激光诱导恒河猴CNV模型中，IBI302能够显著降低荧光斑的大小、减小渗漏面积和降低视网膜厚度、降低房水内VEGF的水平和减轻眼组织的病理组织学损伤，且IBI302的作用效果优于贝伐珠单抗注射液。提示IBI302不仅通过抑制VEGF的活性而治疗CNV，而且可能通过阻断补体活性治疗CNV。由于IBI302的双重作用机制，使其作用效果优于贝伐珠单抗注射液。以上结果提示IBI302不仅能够通过VID结合并阻断VEGF与VEGFR-1和VEGFR-2的结合，抑制VEGF介导的血管新生；而且能够通过CID结合C3b和C4b并阻断补体异常活化介导的炎症反应，对AMD的治疗效果可能优于现有的抗VEGF药物。
本研究结果表明，IBI302作为一种双靶向生物药物，具有对VEGF通路和补体通路的双重抑制作用，不仅可能对渗出型AMD具有非常好的治疗前景，而且可能用于萎缩型AMD的治疗，有望成为新一代抗AMD药物。但我们在体内研究中未探索IBI302对补体指标的作用效果，也未设计萎缩型AMD动物模型探索IBI302对萎缩型AMD的干预作用。此外，本研究未直接比较IBI302的作用效果与VID和CID联合作用的效果，这主要是考虑本实验中所用的体外模型通常是由VEGF或者补体中一种因素诱导。上述的研究缺陷有待后期通过恰当的动物模型进行深入研究。
