引用本文： 程谷萌, 贺涛, 邢怡桥. 钙结合蛋白S100A4基因静默对氧诱导视网膜新生血管的抑制作用及其机制. 中华眼底病杂志, 2016, 32(1): 52-57. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.01.013 复制
视网膜组织缺血缺氧可引起视网膜新生血管(RNV)的形成，但其形成机制目前还不甚明了。钙结合蛋白S100A4是S100钙结合蛋白家族成员之一，其EF双螺旋氨基酸序列结构能与钙离子结合从而发挥其生物学效应。S100A4分布于细胞核、细胞浆及细胞间隙并具有调节新生血管生成、细胞存活、迁移等生物学功能[1]。已有研究证实，S100A4蛋白作为促血管发生因子，可通过增强内皮细胞的移动性，减少血管生成抑制因子的产生而促进肿瘤新生血管的生成[2]。而目前关于S100A4在眼部新生血管，尤其是RNV形成中的作用及机制尚不明确。为此，本研究通过静默氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠视网膜S100A4基因，探讨S100A4在RNV形成中的作用及其机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
7日龄C57/BL6小鼠150只，雌雄不限，由武汉大学A3实验动物中心提供。携带针对S100A4小干扰RNA的重组腺病毒载体(Ad-S100A4-RNAi)、带绿色荧光蛋白(GFP)的空白腺病毒载体(Ad-GFP)由上海吉凯基因有限公司提供，病毒滴度均为4.0×109 PFU/ml。采用随机数字表法将小鼠分为正常组、正常-病毒对照组、基因治疗组、单纯模型组、空白载体组，每组30只。正常组、正常-病毒对照组小鼠在常氧环境下饲养。其余3组小鼠与哺乳母鼠同置于氧浓度为(75±2)%的氧箱内，测氧仪每日4次监测氧箱内氧浓度；饲养5 d后即小鼠12日龄时取出小鼠，转移至正常氧浓度环境中继续饲养5 d，建立OIR模型[3]。小鼠12日龄时，基因治疗组及空白载体组小鼠于角巩缘后0.5 mm处用配有32G针头的微量注射器(美国Hamilton公司)分别对双眼行玻璃体腔注射病毒滴度为1.0×109 PFU/ml的Ad-S100A4-RNAi和Ad-GFP各1.0μl；正常-病毒对照组小鼠玻璃体腔注射同样滴度的等量Ad-S100A4-RNAi。注射完毕后针头停留在眼内约10~15 s后迅速拔出，给予妥布霉素眼膏涂眼。正常组及单纯模型组小鼠不做任何处理。
小鼠15日龄时，取基因治疗组和正常组小鼠各2只，颈椎脱臼法处死摘除眼球后行视网膜冻头制作[4]。用冰切机(CM1900，德国莱卡公司)将视杯经视神经矢状切成12μm的切片，用抗GFP抗体孵育(ab190203，美国Abcam公司)加强其绿色荧光后在荧光显微镜下观察病毒转染情况。
小鼠17日龄时，取各组小鼠4~6只，颈椎脱臼法处死后摘除眼球。放入4%多聚甲醛溶液4℃固定24 h。常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，与视神经矢状轴平行连续切片，相邻2张切片间隔30μm。每只眼球取切片10张行苏木精-伊红(HE)染色，双盲计数法在光学显微镜400倍镜下，每张切片取3个视野计数，统计突破内界膜的血管内皮细胞核数目。
小鼠17日龄时，取各组小鼠4只，颈椎脱臼法处死后摘除眼球。去除眼前节后于4%多聚甲醛固定1 h，PBS溶液中漂洗后显微镜下去除巩膜及色素膜，平铺视网膜后去除表面玻璃体。PBS溶液漂洗视网膜后于5%牛血清白蛋白封闭液(BSAT)中室温封闭2 h，加入西非单叶豆凝集素(1：200，美国Invitrogen公司)孵育3 d。孵育完成后再次将视网膜置于PBS溶液中漂洗后封片。荧光显微镜下观察视网膜血管变化。
采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测S100A4、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(bcl-2)、半胱天冬酶(Caspase)-3及环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)蛋白表达。小鼠17日龄时，取各组小鼠10只，断椎处死后摘除眼球，取出视网膜组织，于-80℃冰箱保存。提取蛋白后，二喹啉甲酸法测蛋白浓度。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、封闭、孵育S100A4(1：100)、bcl-2(1：1000)、Caspase-3(1：1000)、CREB(1：1000)、β-肌动蛋白(β-actin，1：10 000)等相应抗体后行显色、定影、显影。采用Image-J分析条带灰度值，以目的蛋白与β-actin的灰度值之比反映目的蛋白的表达水平。
采用实时PCR检测S100A4、bcl-2、Caspase-3及CREB mRNA表达。小鼠17日龄时，取各组小鼠10只，断椎处死后摘除眼球，取出视网膜组织匀浆提取总RNA，逆转录合成cDNA。配制25μl PCR反应体系。S100A4：上游引物5′-GTGTCCACCTTCCA CAAATACTCA-3′，下游引物5′-ACTTCATTGTC CCTGTTGCTGTC-3′，扩增片段长度173碱基对(bp)；bcl-2：上游引物5′-AGCCCACCGTAACAA TCAAG-3′，下游引物5′-CCTGTCCCTTTGTCTT CAGC-3′，扩增片段长度147 bp；Caspase-3：上游引物5′-GGGCCTGTTGAACTGA-3′，下游引物5′-CCGTCCTTTGAATTTCTCCA-3′，扩增片段长度242 bp；CREB：上游引物5′-TCAGCCGGGTACTA CCATTC-3′，下游引物5′-CTCTCTCTTCCGTGCT GCTT-3′，扩增片段长度217 bp；β-actin：上游引物5′-CTGAGAGGGA AATCGTGCGT-3′，下游引物5′-CCACAGGATTCC ATACCCAAGA-3′，扩增片段长度240 bp。
采用SPSS13.0统计学软件行统计学分析，实验数据以均数±标准差(
2 结果
荧光显微镜观察发现，正常组小鼠视网膜未见病毒绿色荧光，仅可见少量自身荧光(图 1A)；基因治疗组小鼠视网膜神经节细胞层(GCL)、内丛状层(IPL)、内核层(INL)、外丛状层(OPL)可见病毒绿色强荧光，外核层(ONL)可见少量弱荧光(图 1B)。
图1
小鼠视网膜荧光显微镜像。1A.正常组，各层视网膜自身弱荧光；1B.基因治疗组，小鼠视网膜GCL、IPL、INL、OPL均见强荧光，ONL可见少量弱荧光标尺：50μm
光学显微镜观察发现，正常组、正常-病毒对照组小鼠视网膜均未见突破内界膜的血管内皮细胞核(图 2A，2B)；基因治疗组小鼠视网膜仅见少许突破内界膜的血管内皮细胞核(图 2C)；单纯模型组、空白载体组小鼠视网膜均可见大量突破内界膜伸向玻璃体腔的血管内皮细胞核(图 2D，2E)。5组间突破内界膜的血管内皮细胞核计数比较，差异有统计学意义(F=144.20，P＜0.05)。单纯模型组突破内界膜的血管内皮细胞核计数较正常组明显增加比较，差异有统计学意义(t=15.68，P＜0.05)；基因治疗组突破内界膜的血管内皮细胞核计数较单纯模型组、空白载体组明显下降，差异均有统计学意义(t=13.61、14.64，P＜0.05)(图 3)。
图2
小鼠视网膜光学显微镜像。2A.正常组；2B.正常-病毒对照组；2C.基因治疗组；2D.单纯模型组；2E.空白载体组。正常组、正常-病毒对照组小鼠视网膜均未见突破内界膜的血管内皮细胞核；基因治疗组小鼠视网膜仅见少许突出内界膜的血管内皮细胞核(黑箭)；单纯模型组、空白载体组小鼠视网膜均可见大量突破内界膜伸向玻璃体腔的血管内皮细胞核(黑箭) HE标尺：100μm
图3
各组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核计数比较。*P＜0.05
荧光显微镜观察发现，正常组、正常-病毒对照组小鼠视网膜表层与深层血管分布均匀，未见血管闭塞以及新生血管(图 4A，4B)；基因治疗组小鼠视网膜血管走行基本均匀，可见少量无灌注区及新生血管(图 4C)；单纯模型组小鼠视网膜中周部大量新生血管形成，后极部大片无灌注区(图 4D)；空白载体组小鼠视网膜中周部大片无灌注区及大量新生血管形成(图 4E)。5组小鼠RNV面积、无灌注区面积比较，差异均有统计学意义(F=149.50、122.50，P＜0.05)。与单纯模型组、空白载体组比较，基因治疗组小鼠RNV面积(t=12.75、11.37)、无灌注区面积(t=12.09、10.89)明显减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图 5)。
图4
小鼠视网膜荧光显微镜像。4A.正常组；4B.正常-病毒对照组；4C.基因治疗组；4D.单纯模型组；4E.空白载体组。正常组、正常-病毒对照组小鼠视网膜表层与深层血管分布均匀，未见血管闭塞以及新生血管；基因治疗组小鼠视网膜血管走行基本均匀，可见少量新生血管(白箭)及无灌注区(黄箭)；单纯模型组小鼠视网膜中周部大量新生血管形成(白箭)，后极部大片无灌注区(黄箭)；空白载体组小鼠视网膜中周部大量新生血管形成(白箭)及大片无灌注区(黄箭)标尺：2500μm
图5
各组小鼠视网膜无灌注区及RNV面积比较。*基因治疗组与单纯模型组间、空白载体组间比较，P＜0.05
Western blot检测结果显示，5组小鼠视网膜S100A4、bcl-2、Caspase-3和CREB蛋白表达比较，差异均有统计学意义(F=32.41，P＜0.05)。与正常组比较，正常-病毒对照组、基因治疗组小鼠视网膜S100A4蛋白表达明显下调，差异有统计学意义(t=4.12、3.42，P＜0.05)。与单纯模型组、空白载体组比较，基因治疗组小鼠视网膜S100A4(t=5.85、6.13)、bcl-2(t=3.63、3.36)、CREB(t=2.96、3.40)蛋白表达明显下调，差异均有统计学意义(P＜0.05)；Caspase-3蛋白表达明显上调，差异有统计学意义(t=3.55、3.14，P＜0.05)(图 6)。
图6
各组小鼠视网膜S100A4、bcl-2、Caspase-3、CREB蛋白表达比较。*P＜0.05
实时PCR检测结果显示，5组小鼠视网膜S100A4、bcl-2、Caspase-3、CREB mRNA表达比较，差异均有统计学意义(F=184.60，P＜0.05)。与正常组比较，正常-病毒对照组、基因治疗组小鼠视网膜S100A4 mRNA表达明显下调，差异有统计学意义(t=6.03、4.09，P＜0.05)。与单纯模型组、空白载体组比较，基因治疗组小鼠视网膜S100A4(t=11.29、10.44)、bcl-2(t=4.09、2.81)、CREB(t=6.37、5.38)mRNA表达明显下调，差异均有统计学意义(P＜0.05)；Caspase-3 mRNA表达明显上调，差异有统计学意义(t=4.37、3.67，P＜0.05)(图 7)。
图7
各组小鼠视网膜S100A4、bcl-2、Caspase-3、CREB mRNA表达比较。*P＜0.05
3 讨论
S100蛋白最初是从牛脑中分离出的一种可溶性酸性蛋白，隶属于钙离子结合蛋白家族，作为S100蛋白家族成员之一在体内具有多种生物学功能[5]。既往研究表明，S100A4可通过增加肿瘤细胞的运动性，减少肿瘤细胞间的黏附，抑制细胞凋亡来促进肿瘤的侵袭与转移[6-8]。近年来研究发现，S100A4在肿瘤新生血管的形成过程中也扮演着重要的角色[2]。但有关S100A4在眼部新生血管形成过程中是否发挥作用及其机制尚不明确。因此，我们通过建立OIR模型，观察探讨了S100A4基因静默对氧诱导RNV形成的抑制作用及其可能机制。
本研究结果显示，单纯模型组突破内界膜的血管内皮细胞核计数、新生血管面积均大于正常组。说明OIR模型建立成功。在预实验中，我们通过设定重组腺病毒滴度梯度最终确定玻璃体腔注射病毒滴度为1.0×109 PFU/ml，转染时间为3 d时其转染效率最佳。通过对不同组别S100A4蛋白表达量的检测发现，基因治疗组和正常-病毒对照组S100A4蛋白表达量较其他组明显下降。证实S100A4-RNAi重组腺病毒可有效抑制S100A4蛋白的表达。
我们还发现，基因治疗组突破内界膜的血管内皮细胞核数目较单纯模型组和空白载体组明显减少。说明抑制S100A4蛋白的表达可减少RNV的形成。此外，我们通过对视网膜铺片的血管染色观察，发现基因治疗组小鼠新生血管面积较单纯模型组和空白载体组明显减少。进一步证明抑制S100A4蛋白的表达对新生血管的抑制作用。视网膜无灌注区的形成是诱发后期RNV形成的重要因素，其面积的大小与病理性新生血管形成的严重程度密切相关。本研究结果也证实了抑制S100A4蛋白的表达可明显减小视网膜无灌注区的面积。因此，我们认为，抑制S100A4蛋白的表达对RNV的形成具有显著的抑制作用。
CREB是一种真核生物细胞核内蛋白质，作为转录因子在不同的组织和器官中都能起到调节新生血管发生发展的作用[9-11]。作为CREB的目标基因，bcl-2的-1640与-1529位点之间有一个环磷酸腺苷反应元件蛋白，在被CREB激活后可调控bcl-2的表达水平[12, 13]。而bcl-2具有抑制凋亡的作用，并且在新生血管的发生发展中具有促进作用。我们通过检测各组小鼠视网膜中上述因子的蛋白和mRNA表达，以期探讨S100A4基因静默对RNV抑制作用的可能机制。结果显示，单纯模型组bcl-2、CREB的蛋白和mRNA表达量较正常组均有上调。这可能是因为缺氧导致CREB的激活增加从而促进了bcl-2的抗凋亡效应。相反的是，基因治疗组bcl-2、CREB的蛋白和mRNA表达量较单纯模型组和空白载体组明显降低。这可能是由于S100A4基因静默能减少CREB的表达，进而降低了bcl-2的抗凋亡作用。
Caspase-3可通过内源性和外源性凋亡通路被激活，引起bcl-2蛋白的激活[14]。且已有研究证实Caspase-3在抗肿瘤新生血管中的作用[15, 16]。为了进一步证实S100A4基因静默可抑制RNV形成这一结论，我们对Caspase-3蛋白和mRNA表达进行了检测。结果显示，基因治疗组小鼠视网膜Caspase-3的蛋白和mRNA表达量较单纯模型组和空白载体组明显上调。说明在OIR小鼠模型中，S100A4基因静默可促进Caspase-3的促凋亡作用。
本研究结果表明，在OIR小鼠模型中，S100A4基因静默可减少视网膜病理性新生血管，减小视网膜无灌注区面积。这一作用可能是由S100A4基因静默可降低CREB的表达量从而减弱bcl-2的抗凋亡效应，而同时促进Caspase-3的促凋亡效应引起的。提示S100A4可能成为治疗RNV疾病的新靶点。
视网膜组织缺血缺氧可引起视网膜新生血管(RNV)的形成，但其形成机制目前还不甚明了。钙结合蛋白S100A4是S100钙结合蛋白家族成员之一，其EF双螺旋氨基酸序列结构能与钙离子结合从而发挥其生物学效应。S100A4分布于细胞核、细胞浆及细胞间隙并具有调节新生血管生成、细胞存活、迁移等生物学功能[1]。已有研究证实，S100A4蛋白作为促血管发生因子，可通过增强内皮细胞的移动性，减少血管生成抑制因子的产生而促进肿瘤新生血管的生成[2]。而目前关于S100A4在眼部新生血管，尤其是RNV形成中的作用及机制尚不明确。为此，本研究通过静默氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠视网膜S100A4基因，探讨S100A4在RNV形成中的作用及其机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
7日龄C57/BL6小鼠150只，雌雄不限，由武汉大学A3实验动物中心提供。携带针对S100A4小干扰RNA的重组腺病毒载体(Ad-S100A4-RNAi)、带绿色荧光蛋白(GFP)的空白腺病毒载体(Ad-GFP)由上海吉凯基因有限公司提供，病毒滴度均为4.0×109 PFU/ml。采用随机数字表法将小鼠分为正常组、正常-病毒对照组、基因治疗组、单纯模型组、空白载体组，每组30只。正常组、正常-病毒对照组小鼠在常氧环境下饲养。其余3组小鼠与哺乳母鼠同置于氧浓度为(75±2)%的氧箱内，测氧仪每日4次监测氧箱内氧浓度；饲养5 d后即小鼠12日龄时取出小鼠，转移至正常氧浓度环境中继续饲养5 d，建立OIR模型[3]。小鼠12日龄时，基因治疗组及空白载体组小鼠于角巩缘后0.5 mm处用配有32G针头的微量注射器(美国Hamilton公司)分别对双眼行玻璃体腔注射病毒滴度为1.0×109 PFU/ml的Ad-S100A4-RNAi和Ad-GFP各1.0μl；正常-病毒对照组小鼠玻璃体腔注射同样滴度的等量Ad-S100A4-RNAi。注射完毕后针头停留在眼内约10~15 s后迅速拔出，给予妥布霉素眼膏涂眼。正常组及单纯模型组小鼠不做任何处理。
小鼠15日龄时，取基因治疗组和正常组小鼠各2只，颈椎脱臼法处死摘除眼球后行视网膜冻头制作[4]。用冰切机(CM1900，德国莱卡公司)将视杯经视神经矢状切成12μm的切片，用抗GFP抗体孵育(ab190203，美国Abcam公司)加强其绿色荧光后在荧光显微镜下观察病毒转染情况。
小鼠17日龄时，取各组小鼠4~6只，颈椎脱臼法处死后摘除眼球。放入4%多聚甲醛溶液4℃固定24 h。常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，与视神经矢状轴平行连续切片，相邻2张切片间隔30μm。每只眼球取切片10张行苏木精-伊红(HE)染色，双盲计数法在光学显微镜400倍镜下，每张切片取3个视野计数，统计突破内界膜的血管内皮细胞核数目。
小鼠17日龄时，取各组小鼠4只，颈椎脱臼法处死后摘除眼球。去除眼前节后于4%多聚甲醛固定1 h，PBS溶液中漂洗后显微镜下去除巩膜及色素膜，平铺视网膜后去除表面玻璃体。PBS溶液漂洗视网膜后于5%牛血清白蛋白封闭液(BSAT)中室温封闭2 h，加入西非单叶豆凝集素(1：200，美国Invitrogen公司)孵育3 d。孵育完成后再次将视网膜置于PBS溶液中漂洗后封片。荧光显微镜下观察视网膜血管变化。
采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测S100A4、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(bcl-2)、半胱天冬酶(Caspase)-3及环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)蛋白表达。小鼠17日龄时，取各组小鼠10只，断椎处死后摘除眼球，取出视网膜组织，于-80℃冰箱保存。提取蛋白后，二喹啉甲酸法测蛋白浓度。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、封闭、孵育S100A4(1：100)、bcl-2(1：1000)、Caspase-3(1：1000)、CREB(1：1000)、β-肌动蛋白(β-actin，1：10 000)等相应抗体后行显色、定影、显影。采用Image-J分析条带灰度值，以目的蛋白与β-actin的灰度值之比反映目的蛋白的表达水平。
采用实时PCR检测S100A4、bcl-2、Caspase-3及CREB mRNA表达。小鼠17日龄时，取各组小鼠10只，断椎处死后摘除眼球，取出视网膜组织匀浆提取总RNA，逆转录合成cDNA。配制25μl PCR反应体系。S100A4：上游引物5′-GTGTCCACCTTCCA CAAATACTCA-3′，下游引物5′-ACTTCATTGTC CCTGTTGCTGTC-3′，扩增片段长度173碱基对(bp)；bcl-2：上游引物5′-AGCCCACCGTAACAA TCAAG-3′，下游引物5′-CCTGTCCCTTTGTCTT CAGC-3′，扩增片段长度147 bp；Caspase-3：上游引物5′-GGGCCTGTTGAACTGA-3′，下游引物5′-CCGTCCTTTGAATTTCTCCA-3′，扩增片段长度242 bp；CREB：上游引物5′-TCAGCCGGGTACTA CCATTC-3′，下游引物5′-CTCTCTCTTCCGTGCT GCTT-3′，扩增片段长度217 bp；β-actin：上游引物5′-CTGAGAGGGA AATCGTGCGT-3′，下游引物5′-CCACAGGATTCC ATACCCAAGA-3′，扩增片段长度240 bp。
采用SPSS13.0统计学软件行统计学分析，实验数据以均数±标准差(
2 结果
荧光显微镜观察发现，正常组小鼠视网膜未见病毒绿色荧光，仅可见少量自身荧光(图 1A)；基因治疗组小鼠视网膜神经节细胞层(GCL)、内丛状层(IPL)、内核层(INL)、外丛状层(OPL)可见病毒绿色强荧光，外核层(ONL)可见少量弱荧光(图 1B)。
图1
小鼠视网膜荧光显微镜像。1A.正常组，各层视网膜自身弱荧光；1B.基因治疗组，小鼠视网膜GCL、IPL、INL、OPL均见强荧光，ONL可见少量弱荧光标尺：50μm
光学显微镜观察发现，正常组、正常-病毒对照组小鼠视网膜均未见突破内界膜的血管内皮细胞核(图 2A，2B)；基因治疗组小鼠视网膜仅见少许突破内界膜的血管内皮细胞核(图 2C)；单纯模型组、空白载体组小鼠视网膜均可见大量突破内界膜伸向玻璃体腔的血管内皮细胞核(图 2D，2E)。5组间突破内界膜的血管内皮细胞核计数比较，差异有统计学意义(F=144.20，P＜0.05)。单纯模型组突破内界膜的血管内皮细胞核计数较正常组明显增加比较，差异有统计学意义(t=15.68，P＜0.05)；基因治疗组突破内界膜的血管内皮细胞核计数较单纯模型组、空白载体组明显下降，差异均有统计学意义(t=13.61、14.64，P＜0.05)(图 3)。
图2
小鼠视网膜光学显微镜像。2A.正常组；2B.正常-病毒对照组；2C.基因治疗组；2D.单纯模型组；2E.空白载体组。正常组、正常-病毒对照组小鼠视网膜均未见突破内界膜的血管内皮细胞核；基因治疗组小鼠视网膜仅见少许突出内界膜的血管内皮细胞核(黑箭)；单纯模型组、空白载体组小鼠视网膜均可见大量突破内界膜伸向玻璃体腔的血管内皮细胞核(黑箭) HE标尺：100μm
图3
各组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核计数比较。*P＜0.05
荧光显微镜观察发现，正常组、正常-病毒对照组小鼠视网膜表层与深层血管分布均匀，未见血管闭塞以及新生血管(图 4A，4B)；基因治疗组小鼠视网膜血管走行基本均匀，可见少量无灌注区及新生血管(图 4C)；单纯模型组小鼠视网膜中周部大量新生血管形成，后极部大片无灌注区(图 4D)；空白载体组小鼠视网膜中周部大片无灌注区及大量新生血管形成(图 4E)。5组小鼠RNV面积、无灌注区面积比较，差异均有统计学意义(F=149.50、122.50，P＜0.05)。与单纯模型组、空白载体组比较，基因治疗组小鼠RNV面积(t=12.75、11.37)、无灌注区面积(t=12.09、10.89)明显减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图 5)。
图4
小鼠视网膜荧光显微镜像。4A.正常组；4B.正常-病毒对照组；4C.基因治疗组；4D.单纯模型组；4E.空白载体组。正常组、正常-病毒对照组小鼠视网膜表层与深层血管分布均匀，未见血管闭塞以及新生血管；基因治疗组小鼠视网膜血管走行基本均匀，可见少量新生血管(白箭)及无灌注区(黄箭)；单纯模型组小鼠视网膜中周部大量新生血管形成(白箭)，后极部大片无灌注区(黄箭)；空白载体组小鼠视网膜中周部大量新生血管形成(白箭)及大片无灌注区(黄箭)标尺：2500μm
图5
各组小鼠视网膜无灌注区及RNV面积比较。*基因治疗组与单纯模型组间、空白载体组间比较，P＜0.05
Western blot检测结果显示，5组小鼠视网膜S100A4、bcl-2、Caspase-3和CREB蛋白表达比较，差异均有统计学意义(F=32.41，P＜0.05)。与正常组比较，正常-病毒对照组、基因治疗组小鼠视网膜S100A4蛋白表达明显下调，差异有统计学意义(t=4.12、3.42，P＜0.05)。与单纯模型组、空白载体组比较，基因治疗组小鼠视网膜S100A4(t=5.85、6.13)、bcl-2(t=3.63、3.36)、CREB(t=2.96、3.40)蛋白表达明显下调，差异均有统计学意义(P＜0.05)；Caspase-3蛋白表达明显上调，差异有统计学意义(t=3.55、3.14，P＜0.05)(图 6)。
图6
各组小鼠视网膜S100A4、bcl-2、Caspase-3、CREB蛋白表达比较。*P＜0.05
实时PCR检测结果显示，5组小鼠视网膜S100A4、bcl-2、Caspase-3、CREB mRNA表达比较，差异均有统计学意义(F=184.60，P＜0.05)。与正常组比较，正常-病毒对照组、基因治疗组小鼠视网膜S100A4 mRNA表达明显下调，差异有统计学意义(t=6.03、4.09，P＜0.05)。与单纯模型组、空白载体组比较，基因治疗组小鼠视网膜S100A4(t=11.29、10.44)、bcl-2(t=4.09、2.81)、CREB(t=6.37、5.38)mRNA表达明显下调，差异均有统计学意义(P＜0.05)；Caspase-3 mRNA表达明显上调，差异有统计学意义(t=4.37、3.67，P＜0.05)(图 7)。
图7
各组小鼠视网膜S100A4、bcl-2、Caspase-3、CREB mRNA表达比较。*P＜0.05
3 讨论
S100蛋白最初是从牛脑中分离出的一种可溶性酸性蛋白，隶属于钙离子结合蛋白家族，作为S100蛋白家族成员之一在体内具有多种生物学功能[5]。既往研究表明，S100A4可通过增加肿瘤细胞的运动性，减少肿瘤细胞间的黏附，抑制细胞凋亡来促进肿瘤的侵袭与转移[6-8]。近年来研究发现，S100A4在肿瘤新生血管的形成过程中也扮演着重要的角色[2]。但有关S100A4在眼部新生血管形成过程中是否发挥作用及其机制尚不明确。因此，我们通过建立OIR模型，观察探讨了S100A4基因静默对氧诱导RNV形成的抑制作用及其可能机制。
本研究结果显示，单纯模型组突破内界膜的血管内皮细胞核计数、新生血管面积均大于正常组。说明OIR模型建立成功。在预实验中，我们通过设定重组腺病毒滴度梯度最终确定玻璃体腔注射病毒滴度为1.0×109 PFU/ml，转染时间为3 d时其转染效率最佳。通过对不同组别S100A4蛋白表达量的检测发现，基因治疗组和正常-病毒对照组S100A4蛋白表达量较其他组明显下降。证实S100A4-RNAi重组腺病毒可有效抑制S100A4蛋白的表达。
我们还发现，基因治疗组突破内界膜的血管内皮细胞核数目较单纯模型组和空白载体组明显减少。说明抑制S100A4蛋白的表达可减少RNV的形成。此外，我们通过对视网膜铺片的血管染色观察，发现基因治疗组小鼠新生血管面积较单纯模型组和空白载体组明显减少。进一步证明抑制S100A4蛋白的表达对新生血管的抑制作用。视网膜无灌注区的形成是诱发后期RNV形成的重要因素，其面积的大小与病理性新生血管形成的严重程度密切相关。本研究结果也证实了抑制S100A4蛋白的表达可明显减小视网膜无灌注区的面积。因此，我们认为，抑制S100A4蛋白的表达对RNV的形成具有显著的抑制作用。
CREB是一种真核生物细胞核内蛋白质，作为转录因子在不同的组织和器官中都能起到调节新生血管发生发展的作用[9-11]。作为CREB的目标基因，bcl-2的-1640与-1529位点之间有一个环磷酸腺苷反应元件蛋白，在被CREB激活后可调控bcl-2的表达水平[12, 13]。而bcl-2具有抑制凋亡的作用，并且在新生血管的发生发展中具有促进作用。我们通过检测各组小鼠视网膜中上述因子的蛋白和mRNA表达，以期探讨S100A4基因静默对RNV抑制作用的可能机制。结果显示，单纯模型组bcl-2、CREB的蛋白和mRNA表达量较正常组均有上调。这可能是因为缺氧导致CREB的激活增加从而促进了bcl-2的抗凋亡效应。相反的是，基因治疗组bcl-2、CREB的蛋白和mRNA表达量较单纯模型组和空白载体组明显降低。这可能是由于S100A4基因静默能减少CREB的表达，进而降低了bcl-2的抗凋亡作用。
Caspase-3可通过内源性和外源性凋亡通路被激活，引起bcl-2蛋白的激活[14]。且已有研究证实Caspase-3在抗肿瘤新生血管中的作用[15, 16]。为了进一步证实S100A4基因静默可抑制RNV形成这一结论，我们对Caspase-3蛋白和mRNA表达进行了检测。结果显示，基因治疗组小鼠视网膜Caspase-3的蛋白和mRNA表达量较单纯模型组和空白载体组明显上调。说明在OIR小鼠模型中，S100A4基因静默可促进Caspase-3的促凋亡作用。
本研究结果表明，在OIR小鼠模型中，S100A4基因静默可减少视网膜病理性新生血管，减小视网膜无灌注区面积。这一作用可能是由S100A4基因静默可降低CREB的表达量从而减弱bcl-2的抗凋亡效应，而同时促进Caspase-3的促凋亡效应引起的。提示S100A4可能成为治疗RNV疾病的新靶点。
