引用本文： 毛菲菲, 孙挥宇, 李丹, 王胜男, 柳月红, 许雪静, 刘彬彬, 董瑜. 获得性免疫缺陷综合征患者前房水巨细胞病毒聚合酶链反应检测. 中华眼底病杂志, 2015, 31(6): 564-566. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.06.013 复制
巨细胞病毒性视网膜炎(CMVR)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者最常见的眼部并发症，目前常由临床医生根据患者眼底特征做出临床诊断。但CMVR患者眼部表现复杂多样，且与急性视网膜坏死、弓形体病视网膜炎、结核性视网膜脉络膜病变及视网膜血管炎表现相似，仅靠眼底检查难以鉴别，容易误诊；依赖于对治疗后反应判断的诊断方式，又极有可能延误患者早期正确治疗，造成不可逆的视力损伤及不必要的药物不良反应。探寻一种简单可靠的检测方式以尽早明确诊断CMVR有着重要的临床意义。国外已有研究表明，眼内液巨细胞病毒(CMV)聚合酶链反应(PCR)检测具有较高的敏感性和特异性[1]。为进一步验证该检测方法的可行性，我们采用PCR检测了AIDS患者前房水中CMV DNA的含量，现将结果报道如下。
1 对象和方法
2014年4月至2015年4月在首都医科大学附属北京地坛医院确诊为AIDS并行前房穿刺的25例患者纳入本研究。其中，男性21例，女性4例。年龄24~59岁，平均年龄(39.2±9.3)岁。CD4+T淋巴细胞1~523个/μl，中位数40个/μl。其中，＜50个/μl 16例，占64.0%；50~200个/μl 7例，占28.0%；＞200个/μl 2例，占8.0%。发现人类免疫缺陷病毒(HIV)时间15 d~9年，中位数10个月。所有患者均符合AIDS的诊断标准[2]。
所有患者均行散瞳间接检眼镜及眼底彩色照相检查。眼底后极部大量黄白色视网膜病灶，伴有视网膜出血，呈奶油番茄酱样；中周部视网膜白色或黄白色片状或簇状渗出病灶，活动边缘呈颗粒状，伴或不伴视网膜出血；或出现霜枝样视网膜血管炎等特殊类型病变，伴或不伴CMV抗原血症和(或)CMV特异性IgM抗体阳性为CMVR的诊断标准[3]。根据眼底病变及治疗情况将患者分为3组。CMVR未治疗组：眼底存在CMVR病变，未经任何全身抗CMV治疗；共10例。CMVR治疗组：眼底存在CMVR病变(图 1)，已经膦甲酸钠或更昔洛韦抗CMV全身治疗(图 2)；共7例。对照组：眼底未见视网膜病变或仅表现为视网膜微血管病变，并由经验丰富的眼科医师排除CMVR；共8例，其中4例合并全身其他部位CMV感染。
图1
CMVR治疗组患者左眼彩色眼底像。视盘下方及黄斑颞侧可见大量黄白色视网膜病灶，伴有视网膜出血，呈奶油番茄酱样 图 2图 1同眼治疗后彩色眼底像。原病灶瘢痕局限，血管部分闭塞
所有患者均予氧氟沙星滴眼液点眼2~3 d后，在手术室内手术显微镜下完成前房穿刺，抽取房水100 μl，-20℃保存待测。选取人CMV株-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针。扩增片段长度为86碱基对(bp)。采用实时荧光定量PCR技术，定量检测房水样本中CMV DNA的含量。以CMVR未治疗组、CMVR治疗组患者中检测出的阳性比例为PCR敏感性；对照组患者中检测出的阴性比例为PCR特异性。
2 结果
CMVR未治疗组10例患者中，无症状1例，在体检时发现；眼前黑影2例；视物模糊7例。出现症状时间10 d~2个月。眼底检查发现，无症状的1例患者右眼见小于1/2个视盘直径(DD)的白色病灶，边界模糊，伴少量卫星灶；右眼玻璃体明显混浊，双眼视盘边界不清、视网膜血管呈霜枝样改变，右眼各象限及左眼上方可见大片状黄白色病灶及出血1例；双眼大量黄色病灶伴出血2例；单眼黄色病灶伴出血6例。PCR检测结果显示，CMV DNA阳性9例，阴性1例；敏感性为90.0%。9例CMV DNA阳性患者CMV DNA含量为3.72×103~4.81×105 copies/ml，平均CMV DNA含量为(1.55±1.63)×105 copies/ml。其中，4例患者于治疗1个月后再次复测CMV DNA，1例患者CMV DNA含量由1.93×105 copies/ml减少至1.33×104 copies/ml，其余3例均转为阴性。CMV DNA阴性的1例患者，右眼颞下方可见小于1/2 DD的白色病灶，发现病灶后给予膦甲酸钠治疗20 d后自行停药；停药1个月后再次复发，病灶在原位较前明显扩大，CMV DNA转为阳性。
CMVR治疗组7例患者中，无症状2例，在体检时发现；眼前黑影1例；视物模糊4例。出现症状时间2个月~3年。眼底检查发现，表现为瘢痕样陈旧性CMVR 3例；病灶局限但存在出血及黄色渗出1例；大量黄色病灶伴出血3例。PCR检测结果显示，CMV DNA阳性3例，阴性4例；敏感性为42.9%。3例CMV DNA阳性患者平均CMV DNA含量为(4.92±4.78)×103 copies/ml。眼底表现为瘢痕样陈旧性CMVR的3例患者CMV DNA均为阴性。其中，2例患者治疗已超过1年余，并已停药；1例患者治疗10个月，仍在治疗中。眼底表现为病灶局限但存在出血及黄色渗出的1例患者，CMV DNA为阴性，已治疗52 d。眼底表现为大量黄色病灶伴出血的3例患者，CMV DNA为阳性；CMV DNA含量分别为1.17×103、1.03×104、3.28×103 copies/ml。CMV DNA含量为3.28×103 copies/ml的患者治疗20 d后复诊，CMV DNA含量减至7.67×102 copies/ml，未完全转阴。
对照组8例患者中，眼底无异常表现5例，表现为以棉绒斑或浅层视网膜出血的HIV视网膜病变3例。眼底无异常表现的5例患者中，合并肺部或食管的CMV感染4例。PCR检测结果显示，所有患者CMV DNA均为阴性，特异性超过99.9%。
25例患者中，除1例患者结膜下出血外，其余患者均未发生与前房穿刺相关的并发症。
3 讨论
PCR是一项较为常规且有效的检测手段，具有快速和标本需要量小等优点。我们利用PCR检测了3组患者房水中CMV DNA的含量。结果显示，CMVR未治疗组10例患者中，9例患者CMV DNA阳性，敏感性高达90.0%。说明对于未经治疗的AIDS患者，CMV PCR敏感性较高。另1例患者CMV DNA阴性，其眼底病灶小于1 DD。我们分析认为，这或许是因为病例数太少，有存在假阴性结果的可能。除此之外，也可能是因为CMVR病灶较小，不足以释放出可以被PCR检测到的DNA至眼内。对于这类患者，临床应密切随访观察其变化。CMVR治疗组7例患者中，3例患者CMV DNA阳性，敏感性为42.9%；眼底表现为瘢痕样陈旧性病灶的3例患者，CMV DNA均为阴性。提示瘢痕病灶中可能无法检测到CMV。我们还发现，治疗20 d的患者仍可检测到CMV，而治疗52 d的患者无法检测到CMV。说明治疗一定时间后眼内的CMV DNA会逐渐转阴。2例自行停药后复发的患者均可以检测到CMV DNA。提示CMV的治疗需要延续一定时间，且停药前需要经过眼内PCR检测以判断CMV DNA是否为阴性。对照组8例患者CMV DNA均为阴性。说明PCR检查的特异性超过99.9%。提示即便CMV DNA为阴性，也不能完全排除CMV的感染。但由于PCR有较高的特异性，如检测出CMV DNA为阳性便有着非常重要的意义。有学者指出因PCR具有高度的敏感性，所以其局限性是可能出现假阳性[4]。但本组患者中，无1例假阳性结果出现。我们分析这可能与标本正确保存及操作，避免污染有关；但也可能是因为本研究样本量较小，尚不足以全面反映PCR检测的特异性。
经治疗后患者CMV DNA含量明显减少或消失，提示适当治疗可控制CMV复制，减少眼内CMV含量。Fenner等[5]提出，PCR可用于监测指导长期抗病毒治疗。需要比较治疗前后前房水CMV病毒载量的变化情况来评估治疗效果以进一步指导临床治疗。对于未经治疗的CMVR患者，因PCR具有较高的特异性和敏感性，所以可以作为诊断的可靠方法。对于治疗后的患者，PCR可以指导临床用药。
Pathanapitoon等[6]用结膜刮片方法来诊断CMVR，结果发现其敏感性仅为12%。表明结膜刮片不适合用于诊断CMVR。玻璃体腔的病毒浓度高于前房水[1]，但玻璃体腔取标本创伤及感染风险较大。而前房穿刺和玻璃体腔穿刺有相同的敏感性[7, 8]。尽管其也有一定的创伤性，但本组患者除1例结膜下出血外没有出现任何其他并发症，说明其安全性较高。
本研究结果表明，前房水PCR检测CMV DNA具有较高的敏感性、特异性且安全可靠，可以作为CMVR病原学诊断依据。对于眼底表现不典型、特别是未经治疗的AIDS患者能够起到明确诊断，指导治疗的作用。同时还可以用于CMVR治疗效果的评估。但受样本量限制，关于前房水CMV PCR检测的确切敏感性、特异性以及穿刺后感染率等安全性还需更大样本量的研究来探讨。
巨细胞病毒性视网膜炎(CMVR)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者最常见的眼部并发症，目前常由临床医生根据患者眼底特征做出临床诊断。但CMVR患者眼部表现复杂多样，且与急性视网膜坏死、弓形体病视网膜炎、结核性视网膜脉络膜病变及视网膜血管炎表现相似，仅靠眼底检查难以鉴别，容易误诊；依赖于对治疗后反应判断的诊断方式，又极有可能延误患者早期正确治疗，造成不可逆的视力损伤及不必要的药物不良反应。探寻一种简单可靠的检测方式以尽早明确诊断CMVR有着重要的临床意义。国外已有研究表明，眼内液巨细胞病毒(CMV)聚合酶链反应(PCR)检测具有较高的敏感性和特异性[1]。为进一步验证该检测方法的可行性，我们采用PCR检测了AIDS患者前房水中CMV DNA的含量，现将结果报道如下。
1 对象和方法
2014年4月至2015年4月在首都医科大学附属北京地坛医院确诊为AIDS并行前房穿刺的25例患者纳入本研究。其中，男性21例，女性4例。年龄24~59岁，平均年龄(39.2±9.3)岁。CD4+T淋巴细胞1~523个/μl，中位数40个/μl。其中，＜50个/μl 16例，占64.0%；50~200个/μl 7例，占28.0%；＞200个/μl 2例，占8.0%。发现人类免疫缺陷病毒(HIV)时间15 d~9年，中位数10个月。所有患者均符合AIDS的诊断标准[2]。
所有患者均行散瞳间接检眼镜及眼底彩色照相检查。眼底后极部大量黄白色视网膜病灶，伴有视网膜出血，呈奶油番茄酱样；中周部视网膜白色或黄白色片状或簇状渗出病灶，活动边缘呈颗粒状，伴或不伴视网膜出血；或出现霜枝样视网膜血管炎等特殊类型病变，伴或不伴CMV抗原血症和(或)CMV特异性IgM抗体阳性为CMVR的诊断标准[3]。根据眼底病变及治疗情况将患者分为3组。CMVR未治疗组：眼底存在CMVR病变，未经任何全身抗CMV治疗；共10例。CMVR治疗组：眼底存在CMVR病变(图 1)，已经膦甲酸钠或更昔洛韦抗CMV全身治疗(图 2)；共7例。对照组：眼底未见视网膜病变或仅表现为视网膜微血管病变，并由经验丰富的眼科医师排除CMVR；共8例，其中4例合并全身其他部位CMV感染。
图1
CMVR治疗组患者左眼彩色眼底像。视盘下方及黄斑颞侧可见大量黄白色视网膜病灶，伴有视网膜出血，呈奶油番茄酱样 图 2图 1同眼治疗后彩色眼底像。原病灶瘢痕局限，血管部分闭塞
所有患者均予氧氟沙星滴眼液点眼2~3 d后，在手术室内手术显微镜下完成前房穿刺，抽取房水100 μl，-20℃保存待测。选取人CMV株-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针。扩增片段长度为86碱基对(bp)。采用实时荧光定量PCR技术，定量检测房水样本中CMV DNA的含量。以CMVR未治疗组、CMVR治疗组患者中检测出的阳性比例为PCR敏感性；对照组患者中检测出的阴性比例为PCR特异性。
2 结果
CMVR未治疗组10例患者中，无症状1例，在体检时发现；眼前黑影2例；视物模糊7例。出现症状时间10 d~2个月。眼底检查发现，无症状的1例患者右眼见小于1/2个视盘直径(DD)的白色病灶，边界模糊，伴少量卫星灶；右眼玻璃体明显混浊，双眼视盘边界不清、视网膜血管呈霜枝样改变，右眼各象限及左眼上方可见大片状黄白色病灶及出血1例；双眼大量黄色病灶伴出血2例；单眼黄色病灶伴出血6例。PCR检测结果显示，CMV DNA阳性9例，阴性1例；敏感性为90.0%。9例CMV DNA阳性患者CMV DNA含量为3.72×103~4.81×105 copies/ml，平均CMV DNA含量为(1.55±1.63)×105 copies/ml。其中，4例患者于治疗1个月后再次复测CMV DNA，1例患者CMV DNA含量由1.93×105 copies/ml减少至1.33×104 copies/ml，其余3例均转为阴性。CMV DNA阴性的1例患者，右眼颞下方可见小于1/2 DD的白色病灶，发现病灶后给予膦甲酸钠治疗20 d后自行停药；停药1个月后再次复发，病灶在原位较前明显扩大，CMV DNA转为阳性。
CMVR治疗组7例患者中，无症状2例，在体检时发现；眼前黑影1例；视物模糊4例。出现症状时间2个月~3年。眼底检查发现，表现为瘢痕样陈旧性CMVR 3例；病灶局限但存在出血及黄色渗出1例；大量黄色病灶伴出血3例。PCR检测结果显示，CMV DNA阳性3例，阴性4例；敏感性为42.9%。3例CMV DNA阳性患者平均CMV DNA含量为(4.92±4.78)×103 copies/ml。眼底表现为瘢痕样陈旧性CMVR的3例患者CMV DNA均为阴性。其中，2例患者治疗已超过1年余，并已停药；1例患者治疗10个月，仍在治疗中。眼底表现为病灶局限但存在出血及黄色渗出的1例患者，CMV DNA为阴性，已治疗52 d。眼底表现为大量黄色病灶伴出血的3例患者，CMV DNA为阳性；CMV DNA含量分别为1.17×103、1.03×104、3.28×103 copies/ml。CMV DNA含量为3.28×103 copies/ml的患者治疗20 d后复诊，CMV DNA含量减至7.67×102 copies/ml，未完全转阴。
对照组8例患者中，眼底无异常表现5例，表现为以棉绒斑或浅层视网膜出血的HIV视网膜病变3例。眼底无异常表现的5例患者中，合并肺部或食管的CMV感染4例。PCR检测结果显示，所有患者CMV DNA均为阴性，特异性超过99.9%。
25例患者中，除1例患者结膜下出血外，其余患者均未发生与前房穿刺相关的并发症。
3 讨论
PCR是一项较为常规且有效的检测手段，具有快速和标本需要量小等优点。我们利用PCR检测了3组患者房水中CMV DNA的含量。结果显示，CMVR未治疗组10例患者中，9例患者CMV DNA阳性，敏感性高达90.0%。说明对于未经治疗的AIDS患者，CMV PCR敏感性较高。另1例患者CMV DNA阴性，其眼底病灶小于1 DD。我们分析认为，这或许是因为病例数太少，有存在假阴性结果的可能。除此之外，也可能是因为CMVR病灶较小，不足以释放出可以被PCR检测到的DNA至眼内。对于这类患者，临床应密切随访观察其变化。CMVR治疗组7例患者中，3例患者CMV DNA阳性，敏感性为42.9%；眼底表现为瘢痕样陈旧性病灶的3例患者，CMV DNA均为阴性。提示瘢痕病灶中可能无法检测到CMV。我们还发现，治疗20 d的患者仍可检测到CMV，而治疗52 d的患者无法检测到CMV。说明治疗一定时间后眼内的CMV DNA会逐渐转阴。2例自行停药后复发的患者均可以检测到CMV DNA。提示CMV的治疗需要延续一定时间，且停药前需要经过眼内PCR检测以判断CMV DNA是否为阴性。对照组8例患者CMV DNA均为阴性。说明PCR检查的特异性超过99.9%。提示即便CMV DNA为阴性，也不能完全排除CMV的感染。但由于PCR有较高的特异性，如检测出CMV DNA为阳性便有着非常重要的意义。有学者指出因PCR具有高度的敏感性，所以其局限性是可能出现假阳性[4]。但本组患者中，无1例假阳性结果出现。我们分析这可能与标本正确保存及操作，避免污染有关；但也可能是因为本研究样本量较小，尚不足以全面反映PCR检测的特异性。
经治疗后患者CMV DNA含量明显减少或消失，提示适当治疗可控制CMV复制，减少眼内CMV含量。Fenner等[5]提出，PCR可用于监测指导长期抗病毒治疗。需要比较治疗前后前房水CMV病毒载量的变化情况来评估治疗效果以进一步指导临床治疗。对于未经治疗的CMVR患者，因PCR具有较高的特异性和敏感性，所以可以作为诊断的可靠方法。对于治疗后的患者，PCR可以指导临床用药。
Pathanapitoon等[6]用结膜刮片方法来诊断CMVR，结果发现其敏感性仅为12%。表明结膜刮片不适合用于诊断CMVR。玻璃体腔的病毒浓度高于前房水[1]，但玻璃体腔取标本创伤及感染风险较大。而前房穿刺和玻璃体腔穿刺有相同的敏感性[7, 8]。尽管其也有一定的创伤性，但本组患者除1例结膜下出血外没有出现任何其他并发症，说明其安全性较高。
本研究结果表明，前房水PCR检测CMV DNA具有较高的敏感性、特异性且安全可靠，可以作为CMVR病原学诊断依据。对于眼底表现不典型、特别是未经治疗的AIDS患者能够起到明确诊断，指导治疗的作用。同时还可以用于CMVR治疗效果的评估。但受样本量限制，关于前房水CMV PCR检测的确切敏感性、特异性以及穿刺后感染率等安全性还需更大样本量的研究来探讨。
