引用本文： 薛康, 吴继红, 任慧, 张锐, 钱江. 视网膜母细胞瘤低外显率一家系基因研究. 中华眼底病杂志, 2015, 31(6): 553-555. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.06.010 复制
视网膜母细胞瘤(RB)患者中30%～40%属于遗传性RB。根据Knudson[1]两阶段突变假说，RB的形成是由于抑癌基因Rb的双等位突变或失活。Rb1是首个被克隆的肿瘤抑制基因，定位于13q14，有27个外显子，DNA全长183 kb，缺乏突变热点。RB突变数据库(RBl Gene Mutation Database)目前已收录超过1200多种突变。RB是单基因遗传病，多为常染色体显性遗传，外显率高达90%[2]；低外显率RB临床较为少见，文献报道尚少。近年出现的外显子结合目标区域捕获测序能够获得指定区域的遗传信息[3, 4]，极大地提高了Rb基因中外显子区域的研究效率。我们利用该方法对一个RB低外显率家系进行了致病基因突变检测。现将结果报道如下。
1 对象和方法
本研究通过复旦大学附属眼耳鼻喉科医院伦理审查委员会审查；所有受试者或未成年人监护人均签署知情同意书。临床检查确诊的1个RB汉族家系(图 1)纳入研究。先证者(Ⅲ2)为一20个月的男性双眼RB患儿。询问家系史时发现患儿家系中尚有另外2例RB患儿。即对该家系进行了临床及基因检查。收集患儿既往临床资料并详细询问受试者病史；行双眼最佳矫正视力、裂隙灯显微镜、间接检眼镜、眼底彩色照相、眼部B型超声检查。RB患儿行第三代广角数码视网膜成像系统(RetCamⅢ)眼底照相。家系3代9人中，8人接受眼部临床检查；1例RB患儿已死亡。8人中，接受基因检查6人，其中RB患儿2例。
图1
低外显率RB家系图
采集受试者外周抗凝血5 ml，利用Qiamp Blood试剂盒(德国Qiagen公司)提取外周血全基因组DNA。DNA浓度≥50 mg/L。检测采用二代高通量测序结合目标区域捕获技术，对受试者Rb1基因外显子及其邻近±10碱基对(bp)内含子区变异进行分析，包括点突变，20 bp以内的缺失插入突变及外显子水平的拷贝数变异。将基因组DNA随机打断为长250～300 bp的片段，在DNA末端标记A，并与Illumina PE接头一寡核苷酸混合物相连接，连接产物经ligation-mediated聚合酶链反应(PCR)扩增、纯化，获得DNA文库，并对文库进行质量检测。将ligation-mediated PCR产物与Rb1靶基因捕获芯片进行探针杂交、捕获、富集和洗脱。捕获的DNA文库在Illumina HiSeqTM2000平台(美国Illumina公司)上对目标序列进行高通量测序，得到Illumina原始测序数据。通过IIlumina Basecalling Software 1.7等分析软件对原始测序数据进行处理得到Raw文件。针对筛选出的突变位点经Sanger验证排除假阳性，并在所有受试者中验证是否呈现共分离[5]。
2 结果
3代9人中，RB患者3例。先证者(Ⅲ2)为双眼RB；Ⅲ1为先证者姐姐，2岁时右眼因RB行眼球摘除。右眼为义眼；左眼眼底、B型超声检查，RetCamⅢ眼底照相结果均正常。Ⅲ3为家长自述发现双眼白瞳，当地医院确诊为双眼RB，已死亡。其他受试者眼底检查结果正常。
先证者男，20个月。因家长发现患儿右眼发红、有白色反光就诊。RetCamⅢ眼底照相，可见右眼后极部巨大瘤体，伴玻璃体种植、视网膜下积液；左眼视盘旁约1个视盘直径(DD)大小白色隆起(图 2)。B型超声检查，右眼后极部探及11.5 mm×15.6 mm中高回声，内有散在钙化；左眼视盘旁轻度隆起。临床诊断：双眼RB；右眼D期，左眼B期。予以8次全身VEC方案化学治疗(化疗)；局部经瞳孔温热疗法和冷冻治疗。治疗后右眼瘤体显著缩小，完全钙化，呈奶酪-芝士状消退；左眼瘤体局部萎缩瘢痕化(图 3)。化疗结束后8个月随访发现右眼鼻下瘤体增大复发，伴玻璃体种植(图 4)。予以补充2次化疗及全身麻醉下2次冷冻治疗。但对再次化疗及冷冻治疗反应差，遂行右眼眼球摘除手术。病理检查结果：右眼RB(未分化型)。免疫组织化学检查结果：波形蛋白(-)，低分子量钙结合蛋白(-)，突触素(+)，嗜铬粒蛋白(-)，CD56(+)，神经元特异性烯醇化酶(+)，结蛋白(+)，肌细胞生成素(-)，白细胞共同抗原(-)，髓过氧化物酶(-)，细胞角蛋白(-)，Ki-67(50%+)。
图2
先证者双眼彩色眼底像。2A.右眼，后极部巨大瘤体，伴玻璃体种植、视网膜下积液；2B.左眼，视盘旁1 DD大小白色隆起 图 3先证者双眼彩色眼底像。3A.右眼，治疗后瘤体显著缩小，完全钙化；3B.左眼，肿瘤完全消退，表现为脉络膜瘢痕 图 4先证者右眼彩色眼底像。鼻下瘤体增大复发
基因检查结果显示，先证者(Ⅲ2)的Rb1 NM_000321基因检出一个错义突变c.1981C＞T (p.Arg661Trp)，导致Rb1基因编码蛋白第661位的精氨酸突变为色氨酸(图 5)。此突变位点经Sanger验证排除假阳性。先证者姐姐(Ⅲ1)、先证者父亲(Ⅱ2)及其弟弟(Ⅱ3)均存在相同基因位点的突变。Ⅱ2、Ⅱ3配偶(Ⅱ1、Ⅱ4)均未发现该突变。家系中第三代均为RB患儿，第二代均为Rb基因携带者，第一代未行基因检查。推测本家系RB外显率为50%。
图5
基因突变序列图。Rb1 NM_000321基因编码蛋白第661位的精氨酸突变为色氨酸:c1981 C＞T(p.Arg661 Trp)
3 讨论
既往研究结果显示，遗传性RB后代RB罹患风险为45%，非遗传性RB后代RB罹患风险低于1%。遗传性RB在诊断后40年内二次肿瘤的发生风险为28.00%，接受放疗者增加为33.20%，而非遗传性RB二次肿瘤发生风险仅为1.44%[6]。在化疗期间或之后，仍有24%的患者会发生新的RB, 其中绝大部分为早期发病(平均2个月)和遗传性RB患儿[7]。因此，区别RB患儿是否为遗传性，有助于估计患儿另一眼发生RB的风险，评估在生命中后期发生第二恶性肿瘤的危险性，预测后代发生RB的风险。在RB患儿及其家庭成员中开展基因诊断和遗传咨询具有重要临床意义。本家系中，先证者(Ⅲ2)在化疗结束后产生新的瘤体且治疗后仍增大复发，提示遗传性RB可能需要更为密切和长时间的随访。Ⅲ1虽然为单眼RB，但基于基因检查结果，亦为遗传性RB，应进行长期密切随访。
RB为常染色体显性遗传，外显率高达90%[2]。本家系外显率为50%。Onadim等[8]对1个低外显率RB家系的研究结果显示，该家系所有患者均检测到错义突变c.1981C＞T，4名无症状的家系成员为该突变携带者，其余正常成员和38名无血缘关系的健康人中未发现该突变。Abouzeid等[9]在对1个RB家系的研究中发现，家系中有3例双眼、4例单眼RB患者。对6例在世患者进行基因检测，发现均携带该突变；另外有7名无症状家系成员也携带该突变，而家系中6名健康人未发现该突变。由此作者认为该突变在该家系中为低外显突变。Otterson等[10]体外功能试验结果显示，p.Arg661Trp突变蛋白仍然具有周期蛋白依赖性激酶介导磷酸化活性，但是该突变蛋白的体外结合功能存在缺陷，这可能是RB低外显率的原因。提示我们尽管RB的外显率高达90%, 但仍存在部分低外显的突变。这种RB中的低外显现象一方面与错义突变或框内移码突变的位置和突变性质有关[11]，可表现为pRB蛋白功能的部分缺失；另一方面RB的低外显现象也与其他遗传因素的修饰有关[12]。本家系中发现的Rb1 NM_000321基因低外显的错义突变c.1981C＞T (p.Arg661Trp)为国内首次报道，且RB低外显率在国内较少报道。本家系中第三代全部外显发病，而第一代和第二代均未发病，值得临床工作中注意。而对于家族史阴性的患儿，仍有必要对患儿及其父母进行基因检测，有助于遗传咨询和优生优育。
近年来出现的外显子结合目标区域测序利用特制的探针针对特定的蛋白编码区域DNA或某段特定的序列进行捕获，富集后进行高通量测序，具有效率高、成本低、耗时短的优点，能快速系统地检测大规模遗传信息。相比于经典的连锁分析克隆定位技术，能够精确筛选出致病基因且不受家系大小的限制，适用于小家系和散发患者。Rushlow等[13]应用定量多重PCR及高灵敏的等位基因特异性PCR技术，对双眼RB患者的突变检出率为94.8%。何明燕等[14]采用多个外显子Sanger法测序，双眼RB患者突变检出率为78.57%。本研究存在一定不足，首先为家系报道，病例数有限；其次第一代拒绝行基因检测，无法明确携带者。外显子结合目标区域测序在RB中的应用报道少见，我们将在今后的工作中在临床中全面探究外显子结合目标区域测序在双眼RB患者中的突变检出率，并进一步探讨，从而比较得出最优RB基因检测模式，并得以在临床中推广应用。
视网膜母细胞瘤(RB)患者中30%～40%属于遗传性RB。根据Knudson[1]两阶段突变假说，RB的形成是由于抑癌基因Rb的双等位突变或失活。Rb1是首个被克隆的肿瘤抑制基因，定位于13q14，有27个外显子，DNA全长183 kb，缺乏突变热点。RB突变数据库(RBl Gene Mutation Database)目前已收录超过1200多种突变。RB是单基因遗传病，多为常染色体显性遗传，外显率高达90%[2]；低外显率RB临床较为少见，文献报道尚少。近年出现的外显子结合目标区域捕获测序能够获得指定区域的遗传信息[3, 4]，极大地提高了Rb基因中外显子区域的研究效率。我们利用该方法对一个RB低外显率家系进行了致病基因突变检测。现将结果报道如下。
1 对象和方法
本研究通过复旦大学附属眼耳鼻喉科医院伦理审查委员会审查；所有受试者或未成年人监护人均签署知情同意书。临床检查确诊的1个RB汉族家系(图 1)纳入研究。先证者(Ⅲ2)为一20个月的男性双眼RB患儿。询问家系史时发现患儿家系中尚有另外2例RB患儿。即对该家系进行了临床及基因检查。收集患儿既往临床资料并详细询问受试者病史；行双眼最佳矫正视力、裂隙灯显微镜、间接检眼镜、眼底彩色照相、眼部B型超声检查。RB患儿行第三代广角数码视网膜成像系统(RetCamⅢ)眼底照相。家系3代9人中，8人接受眼部临床检查；1例RB患儿已死亡。8人中，接受基因检查6人，其中RB患儿2例。
图1
低外显率RB家系图
采集受试者外周抗凝血5 ml，利用Qiamp Blood试剂盒(德国Qiagen公司)提取外周血全基因组DNA。DNA浓度≥50 mg/L。检测采用二代高通量测序结合目标区域捕获技术，对受试者Rb1基因外显子及其邻近±10碱基对(bp)内含子区变异进行分析，包括点突变，20 bp以内的缺失插入突变及外显子水平的拷贝数变异。将基因组DNA随机打断为长250～300 bp的片段，在DNA末端标记A，并与Illumina PE接头一寡核苷酸混合物相连接，连接产物经ligation-mediated聚合酶链反应(PCR)扩增、纯化，获得DNA文库，并对文库进行质量检测。将ligation-mediated PCR产物与Rb1靶基因捕获芯片进行探针杂交、捕获、富集和洗脱。捕获的DNA文库在Illumina HiSeqTM2000平台(美国Illumina公司)上对目标序列进行高通量测序，得到Illumina原始测序数据。通过IIlumina Basecalling Software 1.7等分析软件对原始测序数据进行处理得到Raw文件。针对筛选出的突变位点经Sanger验证排除假阳性，并在所有受试者中验证是否呈现共分离[5]。
2 结果
3代9人中，RB患者3例。先证者(Ⅲ2)为双眼RB；Ⅲ1为先证者姐姐，2岁时右眼因RB行眼球摘除。右眼为义眼；左眼眼底、B型超声检查，RetCamⅢ眼底照相结果均正常。Ⅲ3为家长自述发现双眼白瞳，当地医院确诊为双眼RB，已死亡。其他受试者眼底检查结果正常。
先证者男，20个月。因家长发现患儿右眼发红、有白色反光就诊。RetCamⅢ眼底照相，可见右眼后极部巨大瘤体，伴玻璃体种植、视网膜下积液；左眼视盘旁约1个视盘直径(DD)大小白色隆起(图 2)。B型超声检查，右眼后极部探及11.5 mm×15.6 mm中高回声，内有散在钙化；左眼视盘旁轻度隆起。临床诊断：双眼RB；右眼D期，左眼B期。予以8次全身VEC方案化学治疗(化疗)；局部经瞳孔温热疗法和冷冻治疗。治疗后右眼瘤体显著缩小，完全钙化，呈奶酪-芝士状消退；左眼瘤体局部萎缩瘢痕化(图 3)。化疗结束后8个月随访发现右眼鼻下瘤体增大复发，伴玻璃体种植(图 4)。予以补充2次化疗及全身麻醉下2次冷冻治疗。但对再次化疗及冷冻治疗反应差，遂行右眼眼球摘除手术。病理检查结果：右眼RB(未分化型)。免疫组织化学检查结果：波形蛋白(-)，低分子量钙结合蛋白(-)，突触素(+)，嗜铬粒蛋白(-)，CD56(+)，神经元特异性烯醇化酶(+)，结蛋白(+)，肌细胞生成素(-)，白细胞共同抗原(-)，髓过氧化物酶(-)，细胞角蛋白(-)，Ki-67(50%+)。
图2
先证者双眼彩色眼底像。2A.右眼，后极部巨大瘤体，伴玻璃体种植、视网膜下积液；2B.左眼，视盘旁1 DD大小白色隆起 图 3先证者双眼彩色眼底像。3A.右眼，治疗后瘤体显著缩小，完全钙化；3B.左眼，肿瘤完全消退，表现为脉络膜瘢痕 图 4先证者右眼彩色眼底像。鼻下瘤体增大复发
基因检查结果显示，先证者(Ⅲ2)的Rb1 NM_000321基因检出一个错义突变c.1981C＞T (p.Arg661Trp)，导致Rb1基因编码蛋白第661位的精氨酸突变为色氨酸(图 5)。此突变位点经Sanger验证排除假阳性。先证者姐姐(Ⅲ1)、先证者父亲(Ⅱ2)及其弟弟(Ⅱ3)均存在相同基因位点的突变。Ⅱ2、Ⅱ3配偶(Ⅱ1、Ⅱ4)均未发现该突变。家系中第三代均为RB患儿，第二代均为Rb基因携带者，第一代未行基因检查。推测本家系RB外显率为50%。
图5
基因突变序列图。Rb1 NM_000321基因编码蛋白第661位的精氨酸突变为色氨酸:c1981 C＞T(p.Arg661 Trp)
3 讨论
既往研究结果显示，遗传性RB后代RB罹患风险为45%，非遗传性RB后代RB罹患风险低于1%。遗传性RB在诊断后40年内二次肿瘤的发生风险为28.00%，接受放疗者增加为33.20%，而非遗传性RB二次肿瘤发生风险仅为1.44%[6]。在化疗期间或之后，仍有24%的患者会发生新的RB, 其中绝大部分为早期发病(平均2个月)和遗传性RB患儿[7]。因此，区别RB患儿是否为遗传性，有助于估计患儿另一眼发生RB的风险，评估在生命中后期发生第二恶性肿瘤的危险性，预测后代发生RB的风险。在RB患儿及其家庭成员中开展基因诊断和遗传咨询具有重要临床意义。本家系中，先证者(Ⅲ2)在化疗结束后产生新的瘤体且治疗后仍增大复发，提示遗传性RB可能需要更为密切和长时间的随访。Ⅲ1虽然为单眼RB，但基于基因检查结果，亦为遗传性RB，应进行长期密切随访。
RB为常染色体显性遗传，外显率高达90%[2]。本家系外显率为50%。Onadim等[8]对1个低外显率RB家系的研究结果显示，该家系所有患者均检测到错义突变c.1981C＞T，4名无症状的家系成员为该突变携带者，其余正常成员和38名无血缘关系的健康人中未发现该突变。Abouzeid等[9]在对1个RB家系的研究中发现，家系中有3例双眼、4例单眼RB患者。对6例在世患者进行基因检测，发现均携带该突变；另外有7名无症状家系成员也携带该突变，而家系中6名健康人未发现该突变。由此作者认为该突变在该家系中为低外显突变。Otterson等[10]体外功能试验结果显示，p.Arg661Trp突变蛋白仍然具有周期蛋白依赖性激酶介导磷酸化活性，但是该突变蛋白的体外结合功能存在缺陷，这可能是RB低外显率的原因。提示我们尽管RB的外显率高达90%, 但仍存在部分低外显的突变。这种RB中的低外显现象一方面与错义突变或框内移码突变的位置和突变性质有关[11]，可表现为pRB蛋白功能的部分缺失；另一方面RB的低外显现象也与其他遗传因素的修饰有关[12]。本家系中发现的Rb1 NM_000321基因低外显的错义突变c.1981C＞T (p.Arg661Trp)为国内首次报道，且RB低外显率在国内较少报道。本家系中第三代全部外显发病，而第一代和第二代均未发病，值得临床工作中注意。而对于家族史阴性的患儿，仍有必要对患儿及其父母进行基因检测，有助于遗传咨询和优生优育。
近年来出现的外显子结合目标区域测序利用特制的探针针对特定的蛋白编码区域DNA或某段特定的序列进行捕获，富集后进行高通量测序，具有效率高、成本低、耗时短的优点，能快速系统地检测大规模遗传信息。相比于经典的连锁分析克隆定位技术，能够精确筛选出致病基因且不受家系大小的限制，适用于小家系和散发患者。Rushlow等[13]应用定量多重PCR及高灵敏的等位基因特异性PCR技术，对双眼RB患者的突变检出率为94.8%。何明燕等[14]采用多个外显子Sanger法测序，双眼RB患者突变检出率为78.57%。本研究存在一定不足，首先为家系报道，病例数有限；其次第一代拒绝行基因检测，无法明确携带者。外显子结合目标区域测序在RB中的应用报道少见，我们将在今后的工作中在临床中全面探究外显子结合目标区域测序在双眼RB患者中的突变检出率，并进一步探讨，从而比较得出最优RB基因检测模式，并得以在临床中推广应用。
