引用本文： 胡健艳, 李婷婷, 吴强. G蛋白偶联受体91对早期糖尿病大鼠血视网膜屏障的影响及机制. 中华眼底病杂志, 2015, 31(2): 157-161. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.02.012 复制
糖尿病视网膜病变(DR)是由于长期慢性高血糖引起视网膜血管内皮细胞损伤、神经细胞凋亡及视网膜色素上皮(RPE)细胞功能障碍，导致血视网膜屏障(BRB)破环而出现的渗出、水肿及出血等一系列病理改变。血管内皮生长因子(VEGF)是DR发生发展过程中的重要调节因子，其表达增加与视网膜BRB损伤密切相关[1-3]。G蛋白偶联受体91(GPR91)主要表达在肝脏、脾脏、胎盘、肾脏及视网膜等血供丰富的组织，具有调节血管生长以适应组织代谢需要的作用[4]。我们的前期研究结果显示，高糖环境下激活的GPR91参与调控VEGF的表达和分泌[5-7]。为进一步探讨GPR91在DR中的可能作用，我们通过玻璃体腔注射携带GPR91小发夹RNA(shRNA)慢病毒载体, 观察了早期糖尿病大鼠视网膜中GPR91对VEGF表达的调控及视网膜BRB损伤的影响及可能的机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)；GPR91抗体(美国Novus Biologicals公司)，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抗体及磷酸化抗体：t-细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、t-c-jun氨基末端激酶(JNK)、t-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK(美国Cell Signalling公司)，β-肌动蛋白抗体(北京康为公司)，二抗(美国ProteinTech Group公司)；VEGF酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国R & D公司)；血糖仪、血糖试纸(美国雅培公司)，微量注射器(德国Hamilton公司)，凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)，多功能酶标仪(美国MD公司)，光学显微镜(德国Leica公司)。慢病毒pGCSIL-GFP-shGPR91及相应的空载体构建方法同文献[7]。
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠60只，鼠龄8～9周，体重200～250 g，清洁级，上海市第六人民医院动物实验中心提供。喂养环境控制室温在23～25℃，相对湿度50%～60%；自由摄食、饮水。采用随机数字表法将大鼠分为对照组(A组)、糖尿病STZ组(B组)、空病毒LV.shScrambled组(C组)、病毒LV.shGPR91组(D组)，每组均为15只大鼠。除A组大鼠，其他各组大鼠参照文献[6]的方法，按体重60 mg/kg腹腔注射STZ制作糖尿病模型。成模2周，C组大鼠玻璃体腔注射浓度为1×108 TU/ml的空载体病毒1 μl；D组大鼠玻璃体腔注射浓度为1×108 TU/ml的pGCSIL-GFP-shGPR91慢病毒1 μl。TU/ml=观察到带有荧光的细胞个数/病毒原液量[7]。各组从玻璃体腔注射载体病毒后开始计算，观察12周。
大鼠过量麻醉处死，迅速摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水，石蜡包埋，作5μm厚度的连续切片。采用苏木精-伊红(HE)染色观察视网膜微血管的病理改变。采用免疫组织化学染色法检测GPR91的表达。脱蜡和水化后，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭，兔抗大鼠GPR91单克隆抗体1∶500稀释，4℃过夜，生物素标记的羊抗兔抗体室温条件下孵育60 min，3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，封片，光学显微镜下观察。
视网膜通透性检测，评价BRB损伤。参照文献[8]的方法，伊凡思蓝(EB)按体重45 mg/kg由股静脉注入。循环2 h后，37℃预热的0.05 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH3.5)心脏灌注。立即摘除眼球，抽干视网膜，加甲酰胺70℃孵育18 h，分别测定620、740 nm的吸光度[A，旧称光密度(OD)]。计算EB经视网膜血管的渗漏量：[视网膜EB量(mg)/视网膜干重(g)]/[单位时间内血浆EB量(mg)/血浆体积(μl)×循环时间(h)]。
蛋白免疫印迹法(Western blot)检测视网膜GPR91、MAPK通路各分子的表达及激活。各组大鼠视网膜组织加入蛋白质裂解液提取蛋白，二喹啉甲酸法测定总蛋白浓度。取30 μg总蛋白，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜。5％脱脂牛奶粉封闭1 h，分别加入GPR91单克隆抗体(1∶1000)，p-ERK1/2多克隆抗体(1∶3000)，t-ERK1/2多克隆抗体(1∶3000)，p-JNK多克隆抗体(1∶1000)，t-JNK多克隆抗体(1∶1000)，p-p38 MAPK多克隆抗体(1∶1000)和t-p38 MAPK多克隆抗体(1∶1000)4℃过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000)，室温孵育l h。增强化学发光法显影，凝胶成像系统摄取图像并进行分析。
采用ELISA测定VEGF蛋白含量。抽取各组大鼠的玻璃体液，4℃, 离心半径5 cm，7600 r/min离心20 min, 取上清，按照VEGF试剂盒说明书进行测定。
SPSS 16.0统计学软件进行统计分析。所有数据以均数±标准差(
2 结果
免疫组织化学染色可见，GPR91主要表达于大鼠视网膜神经节细胞层(GCL)，小部分表达于内核层(INL)和RPE层(图 1)，外核层(ONL)未见其表达。Western blot检测结果显示，A、B、C组间GPR91表达比较，差异无统计学意义(F=1.69，P＞0.05)；D组GPR91表达较C组显著降低，差异有统计学意义(F=39.31，P＜0.01)(图 2)。
图1
大鼠视网膜免疫组织化学染色像。1A.A组；1B.B组。GPR91主要表达于大鼠视网膜GCL，小部分表达于INL和RPE层(黑箭) DAB×200
图2
各组大鼠视网膜GPR91表达结果定量分析。*与C组比较，P＜0.01
光学显微镜观察发现，B、C组大鼠视网膜内层毛细血管较A组大鼠视网膜内层毛细血管明显扩张，D组大鼠视网膜内层扩张的毛细血管显著改善(图 3)。
图3
各组大鼠视网膜光学显微镜像。3A～3D.分别为A～D组。B、C组大鼠视网膜内层毛细血管较A组大鼠视网膜内层毛细血管明显扩张(黑箭)，而D组大鼠视网膜内层毛细血管扩张改善HE×200
视网膜通透性检测结果显示, B、C组大鼠视网膜EB渗漏量分别是A组的(1.58±0.11)、(1.48±0.10)倍，D组大鼠视网膜EB渗漏量较C组下降(33.8±4.11)%，差异有统计学意义(F=30.35，P＜0.05)。
ELISA结果显示，A～D组大鼠视网膜VEGF蛋白表达量分别为(58.44±16.17)、(453.87±24.36)、(409.94±22.16)、(77.32±18.1) pg/ml。B、C组大鼠视网膜VEGF蛋白表达较A组明显增加；D组大鼠视网膜VEGF蛋白表达较C组显著下降，差异有统计学意义(F=253.15，P＜0.05)。
Western blot检测结果显示，B组ERK1/2、JNK、p38 MAPK通路均激活, B组p-ERK1/2/t-ERK1/2、p-JNK/t-JNK、p-p38 MAPK/t-p38 MAPK比值与A组比较，差异均有统计学意义(q=6.38、2.94、3.45，P＜0.05)。C组各比值与B组比较，差异无统计学意义(q=-0.60、-0.35、-0.68，P＞0.05)；D组中p-ERK1/2与t-ERK1/2的比值较C组显著降低，差异有统计学意义(F=22.50，P＜0.05)；p-JNK/t-JNK和p-p38 MAPK/t-p38 MAPK比值未见明显下调，差异无统计学意义(F=4.76、4.57，P＞0.05)(表 1)。
表1
各组大鼠视网膜中ERK1/2、JNK和p38 MAPK通路蛋白的活化情况(3 讨论
本研究通过单次腹腔注射STZ的方式建立糖尿病大鼠模型，12周后观察发现早期糖尿病大鼠视网膜内层血管明显扩张，BRB被破坏，血管通透性增加，EB渗漏显著增加，与Zhang和Yan[9]的研究结果相一致。当玻璃体腔内转入携带有GPR91 shRNA的慢病毒载体时，糖尿病大鼠视网膜血管扩张程度改善，BRB破坏程度减轻，血管渗漏量显著减少。GPR91受体又称琥珀酸受体1，属于G蛋白偶联受体家族，具有7次跨膜螺旋的结构特点，通过特异性结合相应配体琥珀酸参与多种生理及病理反应[10]。Matsumoto等[11]研究发现，增生型DR患者的玻璃体腔内琥珀酸含量显著增加。我们的前期研究通过气相色谱质谱仪分析观察到糖尿病大鼠视网膜中也存在着琥珀酸蓄积现象[6]。因此，我们推测糖尿病环境下，随着视网膜中琥珀酸的异常增多，激活GPR91受体参与DR引起的BRB破坏。
目前已有大量研究证实，VEGF的异常增多可破坏视网膜血管内皮细胞间的紧密连接，促进内皮细胞的增生与迁移，最终导致新生血管形成[12, 13]。本研究也观察到糖尿病大鼠视网膜分泌的VEGF蛋白较血糖正常大鼠明显增加，玻璃体腔内注射携带有GPR91 shRNA的慢病毒载体后可明显减弱VEGF的分泌。Sapieha等[4]研究发现，缺氧条件下视网膜神经节细胞中GPR91蛋白的激活可引起VEGF的表达增加并诱导视网膜新生血管的形成，但去除GCL后VEGF水平显著下调。因此，我们认为GPR91对BRB功能的调控可能是通过调节VEGF的分泌实现的。
为了进一步研究GPR91调控VEGF的信号通路，我们探讨MAPK通路在其发挥中的作用。MAPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可被生长因子、细胞因子、激素、神经递质等广泛刺激激活，是生物体内重要的信号转导系统之一[14, 15]。大量研究结果表明，MAPK信号通路在眼底新生血管发生发展中也起着重要调控作用[16, 17]。本研究发现，早期糖尿病大鼠视网膜中MARK信号通路3个成员(ERK、JNK、p38 MAPK)均激活，同时ERK1/2信号通路参与GPR91调控作用，结果与Vargas等[18]在糖尿病肾病中的研究结果相似。ERK1/2信号通路在促进蛋白质合成、细胞增生、肿瘤形成等方面发挥重要作用[19]。近几年，随着对DR发病机制研究的增加，ERK1/2信号通路在DR中调节VEGF表达方面的相关报道也越来越多[20, 21]。结合本研究结果，我们推测GPR91对VEGF的调控作用可能通过ERK1/2信号通路实现，其具体调控机制将是下一步研究重点。
本研究结果表明，GPR91受体在DR视网膜BRB功能受损和VEGF的分泌表达中发挥着重要调控作用，提示GPR91基因将有可能成为有效控制DR的重要位点之一。由于DR是多种分子和信号通路相互作用的复杂过程，因此我们不能完全排除其他机制参与的可能。
糖尿病视网膜病变(DR)是由于长期慢性高血糖引起视网膜血管内皮细胞损伤、神经细胞凋亡及视网膜色素上皮(RPE)细胞功能障碍，导致血视网膜屏障(BRB)破环而出现的渗出、水肿及出血等一系列病理改变。血管内皮生长因子(VEGF)是DR发生发展过程中的重要调节因子，其表达增加与视网膜BRB损伤密切相关[1-3]。G蛋白偶联受体91(GPR91)主要表达在肝脏、脾脏、胎盘、肾脏及视网膜等血供丰富的组织，具有调节血管生长以适应组织代谢需要的作用[4]。我们的前期研究结果显示，高糖环境下激活的GPR91参与调控VEGF的表达和分泌[5-7]。为进一步探讨GPR91在DR中的可能作用，我们通过玻璃体腔注射携带GPR91小发夹RNA(shRNA)慢病毒载体, 观察了早期糖尿病大鼠视网膜中GPR91对VEGF表达的调控及视网膜BRB损伤的影响及可能的机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)；GPR91抗体(美国Novus Biologicals公司)，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抗体及磷酸化抗体：t-细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、t-c-jun氨基末端激酶(JNK)、t-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK(美国Cell Signalling公司)，β-肌动蛋白抗体(北京康为公司)，二抗(美国ProteinTech Group公司)；VEGF酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国R & D公司)；血糖仪、血糖试纸(美国雅培公司)，微量注射器(德国Hamilton公司)，凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)，多功能酶标仪(美国MD公司)，光学显微镜(德国Leica公司)。慢病毒pGCSIL-GFP-shGPR91及相应的空载体构建方法同文献[7]。
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠60只，鼠龄8～9周，体重200～250 g，清洁级，上海市第六人民医院动物实验中心提供。喂养环境控制室温在23～25℃，相对湿度50%～60%；自由摄食、饮水。采用随机数字表法将大鼠分为对照组(A组)、糖尿病STZ组(B组)、空病毒LV.shScrambled组(C组)、病毒LV.shGPR91组(D组)，每组均为15只大鼠。除A组大鼠，其他各组大鼠参照文献[6]的方法，按体重60 mg/kg腹腔注射STZ制作糖尿病模型。成模2周，C组大鼠玻璃体腔注射浓度为1×108 TU/ml的空载体病毒1 μl；D组大鼠玻璃体腔注射浓度为1×108 TU/ml的pGCSIL-GFP-shGPR91慢病毒1 μl。TU/ml=观察到带有荧光的细胞个数/病毒原液量[7]。各组从玻璃体腔注射载体病毒后开始计算，观察12周。
大鼠过量麻醉处死，迅速摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水，石蜡包埋，作5μm厚度的连续切片。采用苏木精-伊红(HE)染色观察视网膜微血管的病理改变。采用免疫组织化学染色法检测GPR91的表达。脱蜡和水化后，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭，兔抗大鼠GPR91单克隆抗体1∶500稀释，4℃过夜，生物素标记的羊抗兔抗体室温条件下孵育60 min，3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，封片，光学显微镜下观察。
视网膜通透性检测，评价BRB损伤。参照文献[8]的方法，伊凡思蓝(EB)按体重45 mg/kg由股静脉注入。循环2 h后，37℃预热的0.05 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH3.5)心脏灌注。立即摘除眼球，抽干视网膜，加甲酰胺70℃孵育18 h，分别测定620、740 nm的吸光度[A，旧称光密度(OD)]。计算EB经视网膜血管的渗漏量：[视网膜EB量(mg)/视网膜干重(g)]/[单位时间内血浆EB量(mg)/血浆体积(μl)×循环时间(h)]。
蛋白免疫印迹法(Western blot)检测视网膜GPR91、MAPK通路各分子的表达及激活。各组大鼠视网膜组织加入蛋白质裂解液提取蛋白，二喹啉甲酸法测定总蛋白浓度。取30 μg总蛋白，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜。5％脱脂牛奶粉封闭1 h，分别加入GPR91单克隆抗体(1∶1000)，p-ERK1/2多克隆抗体(1∶3000)，t-ERK1/2多克隆抗体(1∶3000)，p-JNK多克隆抗体(1∶1000)，t-JNK多克隆抗体(1∶1000)，p-p38 MAPK多克隆抗体(1∶1000)和t-p38 MAPK多克隆抗体(1∶1000)4℃过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000)，室温孵育l h。增强化学发光法显影，凝胶成像系统摄取图像并进行分析。
采用ELISA测定VEGF蛋白含量。抽取各组大鼠的玻璃体液，4℃, 离心半径5 cm，7600 r/min离心20 min, 取上清，按照VEGF试剂盒说明书进行测定。
SPSS 16.0统计学软件进行统计分析。所有数据以均数±标准差(
2 结果
免疫组织化学染色可见，GPR91主要表达于大鼠视网膜神经节细胞层(GCL)，小部分表达于内核层(INL)和RPE层(图 1)，外核层(ONL)未见其表达。Western blot检测结果显示，A、B、C组间GPR91表达比较，差异无统计学意义(F=1.69，P＞0.05)；D组GPR91表达较C组显著降低，差异有统计学意义(F=39.31，P＜0.01)(图 2)。
图1
大鼠视网膜免疫组织化学染色像。1A.A组；1B.B组。GPR91主要表达于大鼠视网膜GCL，小部分表达于INL和RPE层(黑箭) DAB×200
图2
各组大鼠视网膜GPR91表达结果定量分析。*与C组比较，P＜0.01
光学显微镜观察发现，B、C组大鼠视网膜内层毛细血管较A组大鼠视网膜内层毛细血管明显扩张，D组大鼠视网膜内层扩张的毛细血管显著改善(图 3)。
图3
各组大鼠视网膜光学显微镜像。3A～3D.分别为A～D组。B、C组大鼠视网膜内层毛细血管较A组大鼠视网膜内层毛细血管明显扩张(黑箭)，而D组大鼠视网膜内层毛细血管扩张改善HE×200
视网膜通透性检测结果显示, B、C组大鼠视网膜EB渗漏量分别是A组的(1.58±0.11)、(1.48±0.10)倍，D组大鼠视网膜EB渗漏量较C组下降(33.8±4.11)%，差异有统计学意义(F=30.35，P＜0.05)。
ELISA结果显示，A～D组大鼠视网膜VEGF蛋白表达量分别为(58.44±16.17)、(453.87±24.36)、(409.94±22.16)、(77.32±18.1) pg/ml。B、C组大鼠视网膜VEGF蛋白表达较A组明显增加；D组大鼠视网膜VEGF蛋白表达较C组显著下降，差异有统计学意义(F=253.15，P＜0.05)。
Western blot检测结果显示，B组ERK1/2、JNK、p38 MAPK通路均激活, B组p-ERK1/2/t-ERK1/2、p-JNK/t-JNK、p-p38 MAPK/t-p38 MAPK比值与A组比较，差异均有统计学意义(q=6.38、2.94、3.45，P＜0.05)。C组各比值与B组比较，差异无统计学意义(q=-0.60、-0.35、-0.68，P＞0.05)；D组中p-ERK1/2与t-ERK1/2的比值较C组显著降低，差异有统计学意义(F=22.50，P＜0.05)；p-JNK/t-JNK和p-p38 MAPK/t-p38 MAPK比值未见明显下调，差异无统计学意义(F=4.76、4.57，P＞0.05)(表 1)。
表1
各组大鼠视网膜中ERK1/2、JNK和p38 MAPK通路蛋白的活化情况(3 讨论
本研究通过单次腹腔注射STZ的方式建立糖尿病大鼠模型，12周后观察发现早期糖尿病大鼠视网膜内层血管明显扩张，BRB被破坏，血管通透性增加，EB渗漏显著增加，与Zhang和Yan[9]的研究结果相一致。当玻璃体腔内转入携带有GPR91 shRNA的慢病毒载体时，糖尿病大鼠视网膜血管扩张程度改善，BRB破坏程度减轻，血管渗漏量显著减少。GPR91受体又称琥珀酸受体1，属于G蛋白偶联受体家族，具有7次跨膜螺旋的结构特点，通过特异性结合相应配体琥珀酸参与多种生理及病理反应[10]。Matsumoto等[11]研究发现，增生型DR患者的玻璃体腔内琥珀酸含量显著增加。我们的前期研究通过气相色谱质谱仪分析观察到糖尿病大鼠视网膜中也存在着琥珀酸蓄积现象[6]。因此，我们推测糖尿病环境下，随着视网膜中琥珀酸的异常增多，激活GPR91受体参与DR引起的BRB破坏。
目前已有大量研究证实，VEGF的异常增多可破坏视网膜血管内皮细胞间的紧密连接，促进内皮细胞的增生与迁移，最终导致新生血管形成[12, 13]。本研究也观察到糖尿病大鼠视网膜分泌的VEGF蛋白较血糖正常大鼠明显增加，玻璃体腔内注射携带有GPR91 shRNA的慢病毒载体后可明显减弱VEGF的分泌。Sapieha等[4]研究发现，缺氧条件下视网膜神经节细胞中GPR91蛋白的激活可引起VEGF的表达增加并诱导视网膜新生血管的形成，但去除GCL后VEGF水平显著下调。因此，我们认为GPR91对BRB功能的调控可能是通过调节VEGF的分泌实现的。
为了进一步研究GPR91调控VEGF的信号通路，我们探讨MAPK通路在其发挥中的作用。MAPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可被生长因子、细胞因子、激素、神经递质等广泛刺激激活，是生物体内重要的信号转导系统之一[14, 15]。大量研究结果表明，MAPK信号通路在眼底新生血管发生发展中也起着重要调控作用[16, 17]。本研究发现，早期糖尿病大鼠视网膜中MARK信号通路3个成员(ERK、JNK、p38 MAPK)均激活，同时ERK1/2信号通路参与GPR91调控作用，结果与Vargas等[18]在糖尿病肾病中的研究结果相似。ERK1/2信号通路在促进蛋白质合成、细胞增生、肿瘤形成等方面发挥重要作用[19]。近几年，随着对DR发病机制研究的增加，ERK1/2信号通路在DR中调节VEGF表达方面的相关报道也越来越多[20, 21]。结合本研究结果，我们推测GPR91对VEGF的调控作用可能通过ERK1/2信号通路实现，其具体调控机制将是下一步研究重点。
本研究结果表明，GPR91受体在DR视网膜BRB功能受损和VEGF的分泌表达中发挥着重要调控作用，提示GPR91基因将有可能成为有效控制DR的重要位点之一。由于DR是多种分子和信号通路相互作用的复杂过程，因此我们不能完全排除其他机制参与的可能。
