引用本文： 潘颖喆, 邢怡桥, 陈长征, 黎智, 王慧, 李璐, 苏钰. 抑制光损伤人视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子A的表达对趋化因子受体3配体表达的影响. 中华眼底病杂志, 2015, 31(1): 62-66. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.01.016 复制
血管内皮生长因子(VEGF)在脉络膜新生血管(CNV)形成过程中发挥着重要的作用。趋化因子受体3(CCR3)也可在CNV中特异性表达，且其表达与CNV的发生发展可能存在相关性[1, 2]。新近研究发现，在体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞光损伤模型中，VEGF-A的表达明显升高；CCR3的3种配体嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)-1、eotaxin-2、eotaxin-3在该模型中的表达亦持续增加[3, 4]。但两种因子之间是否存在关联尚不明确。为此，本研究拟通过抑制光损伤后人RPE细胞VEGF-A的表达，观察CCR3的3种配体eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3及核因子(NF)-κB的表达变化，以探讨VEGF-A与CCR3配体eotaxins的表达是否存在关联及可能的作用机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
人RPE细胞株ARPE-19(美国ATCC公司)，胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶(美国Thermo公司)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(大连TaKaRa公司)，定量PCR试剂(上海TOYOBO公司)，兔抗人eotaxin-1抗体bs-1601R、兔抗人eotaxin-2抗体bs-2483R、鼠抗兔二抗bs-0295Ms、鼠抗羊二抗bs-0294Ms(北京博奥森生物技术有限公司)，羊抗人eotaxin-3抗体sc-21620(美国Santa Cruz公司)，兔抗人VEGF-A抗体BS2853、兔抗人核因子(NF)-κB-p65抗体BS1257(美国Bioworld公司)，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒(武汉博士德生物公司)，牛血清白蛋白(武汉天源生物技术有限公司)，3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺显色液和终止液(武汉科前动物生物制品有限公司)，人VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(美国R&D Systems公司)。15W蓝色节能灯(荷兰Philips公司)，MS6610数字式照度仪(深圳华谊仪表有限公司)，酶标仪(芬兰Thermo公司)。
采用含20%胎牛血清的DMEM/F12(1 :1)培养基，以100 U/ml剂量加入青霉素、链霉素，再加入0.1 mmol/L非必需氨基酸和2 mmol/L谷氨酰胺，在37℃、5%CO2、湿度90%的CO2培养箱中培养ARPE-19细胞。待细胞生长融合铺满后，加入0.25%胰蛋白酶消化液进行消化，按1 :2~1 :4细胞传代，取第8~12代生长状态良好的传代细胞用于实验。将同代细胞随机分为正常对照组、光照损伤组和光照干预组，待其铺满培养皿后更换为无血清的DMEM/F12培养基。将波长为400 nm的15W蓝色节能灯自制成光照器，置于培养箱顶部，采用直落式照射，用MS6610型照度计测量被照细胞平面的光强度，将细胞平面光照强度控制在(600±100)Lux，温度变化控制在36.5~37.5℃之间。光照损伤组在持续光照12 h后停止光照，并继续培养24 h后结束培养；光照干预组在持续光照12 h后停止光照，在培养液中加入终浓度为0.125 mg/ml的雷珠单抗继续培养24 h后结束培养[5]；正常对照组以锡箔纸包裹培养皿避光后，置于恒温培养箱内培养36 h后结束培养。倒置相差显微镜下观察3组细胞的形态。
应用RT-PCR技术检测结束光照24 h时3组细胞中VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3及NF-κB的mRNA表达情况。利用Trizol一步法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。运用Primer Premier 5.0软件设计引物，并委托上海生工生物技术服务有限公司合成。VEGF-A上游引物：5′-AAGGAGGAGGG CAGAATCAT-3′，下游引物：5′-ATCTGCATGGTG ATGTTGGA-3′，扩增片段长度为226碱基对(bp)；eotaxin-1上游引物：5′-CCAGCTTCTGTCCCAACC AC-3′，下游引物：5′-GGAATCCTGCACCCACTTC TT-3′，扩增片段长度为180 bp；eotaxin-2上游引物：5′-CCCACCACATCATCCCTACG-3′，下游引物：5′-TTGGCGTCCAGGTTCTTCAT-3′，扩增片段长度为223 bp；eotaxin-3上游引物：5′-TCCCTCCTGAGTCT CCACCT-3′，下游引物：5′-TTCCTTGGATGGGTA CAGACTT-3′，扩增片段长度为194 bp；β-肌动蛋白上游引物：5′-GTCCACCGCAAATGCTTC TA-3′，下游引物：5′-TGCTGTCACCTTCACCGTT C-3′，扩增片段长度为190 bp；NF-κB上游引物：5′-AAGCACAGA TACCACTAAGACGCA-3′，下游引物：5′-GGGAAC TTGAAAGGGGTTATTGT-3′，扩增片段长度为160 bp。反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，重复40个循环，72℃末段延伸5 min。采用2ΔΔCt法进行相对定量分析。各标本重复检测3次后取其平均值。
采用ELISA检测结束光照24 h时3组细胞中VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表达水平。取终止培养时的培养液于4℃条件下，以离心半径6 cm、12 000 r/min高速离心10 min，取上清液按照试剂盒说明书步骤进行测定。在96孔板每反应孔中分别加入标准品、样品稀释液和待检上清液100μl，置室温孵育1 h，洗涤。加酶标抗体100μl，室温孵育1 h，洗涤。加底物液100μl室温避光孵育，加入50μl终止液终止反应。用酶标仪在波长450 nm处测量吸光度[A，旧称光密度(OD)]值，绘制标准曲线，计算各标本浓度。
应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测结束光照24 h时3组细胞中NF-κB的蛋白表达水平。吸尽细胞培养液后，用预冷的磷酸盐缓冲液漂洗。加入预冷的细胞裂解液，静置2 h，超声波碎核后，4℃冰冻离心机30 000×g离心1 h后取上清液，分装置于-80℃保存。制胶，十二烷基硫酸纳-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移，5%脱脂奶粉封闭，加入按说明书要求稀释后的一抗，4℃孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷缓冲液漂洗，加入1 :5000比例稀释的相应二抗孵育，漂洗。应用超敏化学发光液试剂盒显色，在暗房内进行曝光显影，直至条带出现并达到合适的黑度为止。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为对照。对显影条带进行A值分析。
胰酶消化培养瓶中的细胞制成细胞悬液，滴于载玻片上，置培养箱中过夜，制成细胞爬片，冷乙醇室温固定30 min；按SABC试剂盒说明书步骤进行依次抗原修复、封闭、加相应一抗、生物素标记的二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色法进行免疫组织化学染色。
采用SPSS 13.00统计软件行统计学分析，数据以均数±标准差(
2 结果
倒置相差显微镜观察发现，光照干预组与正常对照组相比，其细胞形态结构未见明显变化，色素颗粒无明显减少，未见明显细胞核固缩、核碎裂、核溶解以及细胞凝固、凋亡、坏死等改变(图 1, 2)。
图1
正常对照组细胞倒置相差显微镜像。细胞形态与结构正常×100 图 2 光照干预组细胞倒置相差显微镜像。细胞形态与结构较正常对照组无明显变化×100
RT-PCR检测结果显示，光照损伤组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB的mRNA表达较正常对照组明显增加，差异均有统计学意义(t=5.13、2.78、6.61、3.47、3.06，P＜0.05)。光照干预组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB的mRNA表达较光照损伤组明显降低，差异也有统计学意义(t=3.82、4.26、4.73、2.68、5.24，P＜0.05)。光照干预组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB的mRNA表达较正常对照组无明显变化，差异无统计学意义(t=11.57、9.42、11.36、7.33、8.42，P＞0.05)(图 3)。
图3
3组细胞中各因子mRNA表达比较
ELISA检测结果显示，在结束光照24 h时，光照损伤组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表达较正常对照组明显增加，差异均有统计学意义(t=6.73、12.51、9.42、10.66，P＜0.05)。光照干预组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表达较光照损伤组明显降低，差异也有统计学意义(t=5.76、14.26、6.11、7.72，P＜0.05)。光照干预组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表达较正常对照组无明显变化，差异无统计学意义(t=3.88、7.46、5.58、5.36，P＞0.05)(图 4)。
图4
3组细胞中各因子蛋白表达比较
Western blot检测结果显示，光照损伤组NF-κB的蛋白表达较正常对照组明显增加，差异有统计学意义(t=14.37，P＜0.05)。光照干预组NF-κB的蛋白表达较光照损伤组明显降低，差异也有统计学意义(t=10.02，P＜0.05)。光照干预组NF-κB的蛋白表达较正常对照组无明显变化，差异无统计学意义(t=2.72，P＞0.05)(图 5)。
图5
3组细胞中NF-κB蛋白表达比较
免疫组织化学染色结果显示，光照损伤组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB蛋白表达较正常对照组明显增加。光照干预组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB蛋白表达均较光照损伤组降低。
3 讨论
RPE结构和功能的改变是老年性黄斑变性(AMD)和CNV发生发展的重要因素，可见光是自然状态下造成RPE细胞损伤的重要原因[6, 7]。因此，为了更好地模拟老年人长期慢性光损伤所引起的RPE细胞结构和功能的变化，排除动物模型及激光诱导模型等可能造成的种属差异、炎症、其他细胞、组织、因子等的干扰，我们延用了前期实验曾使用的蓝光照射培养的ARPE-19细胞制作的RPE细胞慢性光损伤细胞模型。
本研究结果显示，RPE细胞分泌的VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的mRNA和蛋白表达在光损伤后较正常对照组均有明显升高。Kernt等[8]研究发现，光损伤后RPE分泌VEGF上升。Takeda等[1]研究发现，渗出型AMD患者的CNV及激光诱发小鼠CNV模型RPE细胞中eotaxin表达增高。Wang等[2]对培养的人RPE细胞应用H2O2处理后，亦观察到VEGF和CCR3的3种配体表达明显升高。本研究结果与上述研究结果吻合。说明光损伤后VEGF与CCR3配体的表达呈同向增强趋势。提示VEGF和CCR3通路可能被共同激活，并且有可能存在某种关联。
Mizutani等[9]给予激光诱导C57BL/6J小鼠CNV模型玻璃体腔注射小分子CCR3拮抗剂，观察发现CCR3、eotaxin-1的表达被抑制；VEGF总量虽没有明显变化，但却诱导了其异构体组成的变化，具有更强促炎症和促血管生成作用的VEGF164表达下调，而具有神经保护作用的VEGF120表达上调。Wang等[2]研究发现，CCR3抑制剂可以对VEGF诱导的循环内皮细胞迁移产生明显的剂量依赖的抑制作用。说明VEGF通路与CCR3通路之间或许存在某种联系。我们应用雷珠单抗抑制光照干预组细胞中的VEGF表达。结果显示，使用雷珠单抗后，VEGF-A蛋白的分泌量较光照损伤组明显减少；随之CCR3的3种配体表达亦明显下降。表明在VEGF受到抑制后，CCR3配体的表达也受到了抑制。提示在RPE细胞中VEGF与CCR3配体的表达是存在关联的，VEGF表达升高可能上调CCR3配体的表达，而VEGF表达降低则可以下调CCR3的表达。
NF-κB是一种参与一系列基因表达调控的关键性核转录因子，能够上调VEGF表达、促进新生血管形成，并且能反过来被VEGF促进表达[10-12]。NF-κB还能促进嗜酸性粒细胞趋化因子靶基因的转录，其表达和活性被抑制后，嗜酸性粒细胞趋化因子下调[13]。Huber等[14]在对纤维母细胞的研究中发现，IκB激酶-2/IκBα/NF-κB通路在CCR3及eotaxin-1的表达中起到关键性的作用。本研究结果显示，光照损伤组VEGF、NF-κB、CCR3配体的mRNA和蛋白表达均较对照组明显升高，而在使用雷珠单抗抑制了VEGF表达后，NF-κB、CCR3配体的mRNA和蛋白表达均下降。表明在RPE细胞中，VEGF与CCR3配体的表达可能存在关联，两者间可能是通过NF-κB作为中介的某种通路相联系的，其过程有可能是VEGF表达的升高上调了NF-κB的表达，进而上调CCR3配体的表达；因此，在阻断了VEGF之后，NF-κB及CCR3配体的表达相继下降。在后续的研究中，可以通过在同样的光损伤RPE细胞模型中使用NF-κB的抑制剂来阻断NF-κB的表达，观察CCR3配体的变化，以此来进一步验证NF-κB在通路中的作用。
本研究结果表明，光损伤后RPE细胞分泌的VEGF与CCR3配体的表达不仅存在关联，而且可能是通过以NF-κB作为中介的某种通路相联系的。至于其中具体的分子机制，以及与其他可能的信号通路之间的关联，仍需要进一步的研究。
血管内皮生长因子(VEGF)在脉络膜新生血管(CNV)形成过程中发挥着重要的作用。趋化因子受体3(CCR3)也可在CNV中特异性表达，且其表达与CNV的发生发展可能存在相关性[1, 2]。新近研究发现，在体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞光损伤模型中，VEGF-A的表达明显升高；CCR3的3种配体嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)-1、eotaxin-2、eotaxin-3在该模型中的表达亦持续增加[3, 4]。但两种因子之间是否存在关联尚不明确。为此，本研究拟通过抑制光损伤后人RPE细胞VEGF-A的表达，观察CCR3的3种配体eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3及核因子(NF)-κB的表达变化，以探讨VEGF-A与CCR3配体eotaxins的表达是否存在关联及可能的作用机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
人RPE细胞株ARPE-19(美国ATCC公司)，胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶(美国Thermo公司)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(大连TaKaRa公司)，定量PCR试剂(上海TOYOBO公司)，兔抗人eotaxin-1抗体bs-1601R、兔抗人eotaxin-2抗体bs-2483R、鼠抗兔二抗bs-0295Ms、鼠抗羊二抗bs-0294Ms(北京博奥森生物技术有限公司)，羊抗人eotaxin-3抗体sc-21620(美国Santa Cruz公司)，兔抗人VEGF-A抗体BS2853、兔抗人核因子(NF)-κB-p65抗体BS1257(美国Bioworld公司)，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒(武汉博士德生物公司)，牛血清白蛋白(武汉天源生物技术有限公司)，3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺显色液和终止液(武汉科前动物生物制品有限公司)，人VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(美国R&D Systems公司)。15W蓝色节能灯(荷兰Philips公司)，MS6610数字式照度仪(深圳华谊仪表有限公司)，酶标仪(芬兰Thermo公司)。
采用含20%胎牛血清的DMEM/F12(1 :1)培养基，以100 U/ml剂量加入青霉素、链霉素，再加入0.1 mmol/L非必需氨基酸和2 mmol/L谷氨酰胺，在37℃、5%CO2、湿度90%的CO2培养箱中培养ARPE-19细胞。待细胞生长融合铺满后，加入0.25%胰蛋白酶消化液进行消化，按1 :2~1 :4细胞传代，取第8~12代生长状态良好的传代细胞用于实验。将同代细胞随机分为正常对照组、光照损伤组和光照干预组，待其铺满培养皿后更换为无血清的DMEM/F12培养基。将波长为400 nm的15W蓝色节能灯自制成光照器，置于培养箱顶部，采用直落式照射，用MS6610型照度计测量被照细胞平面的光强度，将细胞平面光照强度控制在(600±100)Lux，温度变化控制在36.5~37.5℃之间。光照损伤组在持续光照12 h后停止光照，并继续培养24 h后结束培养；光照干预组在持续光照12 h后停止光照，在培养液中加入终浓度为0.125 mg/ml的雷珠单抗继续培养24 h后结束培养[5]；正常对照组以锡箔纸包裹培养皿避光后，置于恒温培养箱内培养36 h后结束培养。倒置相差显微镜下观察3组细胞的形态。
应用RT-PCR技术检测结束光照24 h时3组细胞中VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3及NF-κB的mRNA表达情况。利用Trizol一步法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。运用Primer Premier 5.0软件设计引物，并委托上海生工生物技术服务有限公司合成。VEGF-A上游引物：5′-AAGGAGGAGGG CAGAATCAT-3′，下游引物：5′-ATCTGCATGGTG ATGTTGGA-3′，扩增片段长度为226碱基对(bp)；eotaxin-1上游引物：5′-CCAGCTTCTGTCCCAACC AC-3′，下游引物：5′-GGAATCCTGCACCCACTTC TT-3′，扩增片段长度为180 bp；eotaxin-2上游引物：5′-CCCACCACATCATCCCTACG-3′，下游引物：5′-TTGGCGTCCAGGTTCTTCAT-3′，扩增片段长度为223 bp；eotaxin-3上游引物：5′-TCCCTCCTGAGTCT CCACCT-3′，下游引物：5′-TTCCTTGGATGGGTA CAGACTT-3′，扩增片段长度为194 bp；β-肌动蛋白上游引物：5′-GTCCACCGCAAATGCTTC TA-3′，下游引物：5′-TGCTGTCACCTTCACCGTT C-3′，扩增片段长度为190 bp；NF-κB上游引物：5′-AAGCACAGA TACCACTAAGACGCA-3′，下游引物：5′-GGGAAC TTGAAAGGGGTTATTGT-3′，扩增片段长度为160 bp。反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，重复40个循环，72℃末段延伸5 min。采用2ΔΔCt法进行相对定量分析。各标本重复检测3次后取其平均值。
采用ELISA检测结束光照24 h时3组细胞中VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表达水平。取终止培养时的培养液于4℃条件下，以离心半径6 cm、12 000 r/min高速离心10 min，取上清液按照试剂盒说明书步骤进行测定。在96孔板每反应孔中分别加入标准品、样品稀释液和待检上清液100μl，置室温孵育1 h，洗涤。加酶标抗体100μl，室温孵育1 h，洗涤。加底物液100μl室温避光孵育，加入50μl终止液终止反应。用酶标仪在波长450 nm处测量吸光度[A，旧称光密度(OD)]值，绘制标准曲线，计算各标本浓度。
应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测结束光照24 h时3组细胞中NF-κB的蛋白表达水平。吸尽细胞培养液后，用预冷的磷酸盐缓冲液漂洗。加入预冷的细胞裂解液，静置2 h，超声波碎核后，4℃冰冻离心机30 000×g离心1 h后取上清液，分装置于-80℃保存。制胶，十二烷基硫酸纳-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移，5%脱脂奶粉封闭，加入按说明书要求稀释后的一抗，4℃孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷缓冲液漂洗，加入1 :5000比例稀释的相应二抗孵育，漂洗。应用超敏化学发光液试剂盒显色，在暗房内进行曝光显影，直至条带出现并达到合适的黑度为止。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为对照。对显影条带进行A值分析。
胰酶消化培养瓶中的细胞制成细胞悬液，滴于载玻片上，置培养箱中过夜，制成细胞爬片，冷乙醇室温固定30 min；按SABC试剂盒说明书步骤进行依次抗原修复、封闭、加相应一抗、生物素标记的二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色法进行免疫组织化学染色。
采用SPSS 13.00统计软件行统计学分析，数据以均数±标准差(
2 结果
倒置相差显微镜观察发现，光照干预组与正常对照组相比，其细胞形态结构未见明显变化，色素颗粒无明显减少，未见明显细胞核固缩、核碎裂、核溶解以及细胞凝固、凋亡、坏死等改变(图 1, 2)。
图1
正常对照组细胞倒置相差显微镜像。细胞形态与结构正常×100 图 2 光照干预组细胞倒置相差显微镜像。细胞形态与结构较正常对照组无明显变化×100
RT-PCR检测结果显示，光照损伤组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB的mRNA表达较正常对照组明显增加，差异均有统计学意义(t=5.13、2.78、6.61、3.47、3.06，P＜0.05)。光照干预组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB的mRNA表达较光照损伤组明显降低，差异也有统计学意义(t=3.82、4.26、4.73、2.68、5.24，P＜0.05)。光照干预组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB的mRNA表达较正常对照组无明显变化，差异无统计学意义(t=11.57、9.42、11.36、7.33、8.42，P＞0.05)(图 3)。
图3
3组细胞中各因子mRNA表达比较
ELISA检测结果显示，在结束光照24 h时，光照损伤组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表达较正常对照组明显增加，差异均有统计学意义(t=6.73、12.51、9.42、10.66，P＜0.05)。光照干预组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表达较光照损伤组明显降低，差异也有统计学意义(t=5.76、14.26、6.11、7.72，P＜0.05)。光照干预组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表达较正常对照组无明显变化，差异无统计学意义(t=3.88、7.46、5.58、5.36，P＞0.05)(图 4)。
图4
3组细胞中各因子蛋白表达比较
Western blot检测结果显示，光照损伤组NF-κB的蛋白表达较正常对照组明显增加，差异有统计学意义(t=14.37，P＜0.05)。光照干预组NF-κB的蛋白表达较光照损伤组明显降低，差异也有统计学意义(t=10.02，P＜0.05)。光照干预组NF-κB的蛋白表达较正常对照组无明显变化，差异无统计学意义(t=2.72，P＞0.05)(图 5)。
图5
3组细胞中NF-κB蛋白表达比较
免疫组织化学染色结果显示，光照损伤组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB蛋白表达较正常对照组明显增加。光照干预组VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB蛋白表达均较光照损伤组降低。
3 讨论
RPE结构和功能的改变是老年性黄斑变性(AMD)和CNV发生发展的重要因素，可见光是自然状态下造成RPE细胞损伤的重要原因[6, 7]。因此，为了更好地模拟老年人长期慢性光损伤所引起的RPE细胞结构和功能的变化，排除动物模型及激光诱导模型等可能造成的种属差异、炎症、其他细胞、组织、因子等的干扰，我们延用了前期实验曾使用的蓝光照射培养的ARPE-19细胞制作的RPE细胞慢性光损伤细胞模型。
本研究结果显示，RPE细胞分泌的VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的mRNA和蛋白表达在光损伤后较正常对照组均有明显升高。Kernt等[8]研究发现，光损伤后RPE分泌VEGF上升。Takeda等[1]研究发现，渗出型AMD患者的CNV及激光诱发小鼠CNV模型RPE细胞中eotaxin表达增高。Wang等[2]对培养的人RPE细胞应用H2O2处理后，亦观察到VEGF和CCR3的3种配体表达明显升高。本研究结果与上述研究结果吻合。说明光损伤后VEGF与CCR3配体的表达呈同向增强趋势。提示VEGF和CCR3通路可能被共同激活，并且有可能存在某种关联。
Mizutani等[9]给予激光诱导C57BL/6J小鼠CNV模型玻璃体腔注射小分子CCR3拮抗剂，观察发现CCR3、eotaxin-1的表达被抑制；VEGF总量虽没有明显变化，但却诱导了其异构体组成的变化，具有更强促炎症和促血管生成作用的VEGF164表达下调，而具有神经保护作用的VEGF120表达上调。Wang等[2]研究发现，CCR3抑制剂可以对VEGF诱导的循环内皮细胞迁移产生明显的剂量依赖的抑制作用。说明VEGF通路与CCR3通路之间或许存在某种联系。我们应用雷珠单抗抑制光照干预组细胞中的VEGF表达。结果显示，使用雷珠单抗后，VEGF-A蛋白的分泌量较光照损伤组明显减少；随之CCR3的3种配体表达亦明显下降。表明在VEGF受到抑制后，CCR3配体的表达也受到了抑制。提示在RPE细胞中VEGF与CCR3配体的表达是存在关联的，VEGF表达升高可能上调CCR3配体的表达，而VEGF表达降低则可以下调CCR3的表达。
NF-κB是一种参与一系列基因表达调控的关键性核转录因子，能够上调VEGF表达、促进新生血管形成，并且能反过来被VEGF促进表达[10-12]。NF-κB还能促进嗜酸性粒细胞趋化因子靶基因的转录，其表达和活性被抑制后，嗜酸性粒细胞趋化因子下调[13]。Huber等[14]在对纤维母细胞的研究中发现，IκB激酶-2/IκBα/NF-κB通路在CCR3及eotaxin-1的表达中起到关键性的作用。本研究结果显示，光照损伤组VEGF、NF-κB、CCR3配体的mRNA和蛋白表达均较对照组明显升高，而在使用雷珠单抗抑制了VEGF表达后，NF-κB、CCR3配体的mRNA和蛋白表达均下降。表明在RPE细胞中，VEGF与CCR3配体的表达可能存在关联，两者间可能是通过NF-κB作为中介的某种通路相联系的，其过程有可能是VEGF表达的升高上调了NF-κB的表达，进而上调CCR3配体的表达；因此，在阻断了VEGF之后，NF-κB及CCR3配体的表达相继下降。在后续的研究中，可以通过在同样的光损伤RPE细胞模型中使用NF-κB的抑制剂来阻断NF-κB的表达，观察CCR3配体的变化，以此来进一步验证NF-κB在通路中的作用。
本研究结果表明，光损伤后RPE细胞分泌的VEGF与CCR3配体的表达不仅存在关联，而且可能是通过以NF-κB作为中介的某种通路相联系的。至于其中具体的分子机制，以及与其他可能的信号通路之间的关联，仍需要进一步的研究。
