引用本文： 董凯, 周恩亮, 朱子诚, 文磊, 冯敬仰, 闫泉, 柯根杰, 孙晓东. 实验性视网膜脱离后光感受器细胞的坏死性凋亡. 中华眼底病杂志, 2014, 30(4): 378-380. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.04.011 复制
视网膜脱离时视网膜色素上皮层和神经纤维层分离，组织缺血、缺氧及激活死亡受体通路，可以导致光感受器细胞的凋亡[1, 2]。近年来研究发现，坏死性凋亡也是一种基本细胞死亡形式，亦受死亡受体通路激活，其发生与组织缺血、缺氧有着密切关系[3]。视网膜脱离后存在死亡受体通路的激活，光感受器细胞不仅有凋亡，同时还可能发生坏死性凋亡[4]。我们的前期研究发现，采用泛半胱氨酸蛋白酶(Caspase)抑制剂进行诱导后，会导致视网膜脱离中光感受器细胞的坏死性凋亡[5]。但在单纯视网膜脱离中，没有外源性干预的情况下，光感受器细胞坏死性凋亡的发生情况目前尚不清楚。为此，我们通过建立视网膜脱离大鼠模型，观察了单纯视网膜脱离中光感受器细胞坏死性凋亡的形态学特点，并初步探讨了其发生机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
本研究实验操作均严格遵守美国视觉眼科研究学会对动物实验的要求和上海交通大学、安徽医科大学对动物实验的规定。雄性健康的Sprague-Dawley大鼠60只，体重约260~280 g，由上海交通大学附属第一人民医院提供。参照文献[5-8]的方法，右眼视网膜下注入1%透明质酸纳(美国博士伦公司)50 μl建立视网膜脱离模型作为实验组，左眼不作处理为对照组。显微镜下可见局部视网膜脱离约占1/2范围，脱离范围于结膜面用10-0缝线做标记。
参照文献[5, 6, 9]的方法，采用电子显微镜观察光感受器细胞的死亡方式。建模后3 d，视网膜组织经2.5％戊二醛固定液固定12 h后，依次浸透、包埋、烤片。切片机切片、染色后，JEM-1200EX透射电子显微镜(日本电子公司)观察并拍照。每张切片首先根据内界膜的位置确定视网膜组织的位置，然后在双极细胞和光感受器细胞内节之间确定光感受器细胞的位置，随机选择200个光感受器细胞，通过形态学的改变判定视网膜脱离后光感受器细胞的死亡方式。以光感受器细胞皱缩，染色质边聚为凋亡细胞；细胞肿胀，质膜不完整、破裂为坏死细胞[10, 11]；细胞肿胀，质膜不完整、破裂，且染色质浓集和边聚，并伴有明显的自噬泡和空泡为坏死性凋亡[3, 12-14]。
参照文献[5, 11, 15]的方法和蛋白质免疫印迹(Western blot)法说明书对大鼠视网膜组织进行Western blot检测。建模后3 d，取视网膜组织，测定蛋白浓度。取等量蛋白质，依次行电泳分离、转膜、封闭。洗膜缓冲液(TBST)洗膜，加入一抗4℃过夜。复温后TBST洗膜3次，加入二抗，显影定影。采用Bandscan 43软件(加拿大Glyko公司)测定条带灰度值。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照。将裂解的Caspase 8与β-actin的灰度比值作为裂解的Caspase 8蛋白相对表达水平。
参照文献[5, 15, 16]的方法和免疫沉淀法说明书行对大鼠视网膜组织进行免疫沉淀检测。建模后3 d，收集视网膜标本，1 mg视网膜组织中加入1 mg/ml的抗受体相互作用蛋白1(RIP1)抗体(美国Cell Signaling Technology公司)1 μl和蛋白质A/G琼脂糖胶粒40 μl(碧云天生物技术研究所)，Tris缓冲液洗涤沉淀5次。取部分或全部样品行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。将磷酸化RIP1(p-RIP1)与RIP1蛋白的灰度比值作为p-RIP1蛋白相对表达水平。
采用SPSS 17.0统计软件行统计分析，实验数据以均数±标准差(
2 结果
电子显微镜观察发现，视网膜脱离后光感受器细胞的死亡方式主要为凋亡和坏死(图 1，2)。同时还可观察到光感受器细胞的坏死性凋亡，其形态学与坏死细胞类似，但染色质浓集和边聚，且伴有明显的自噬泡和空泡(图 3)。
图1
光感受器细胞凋亡电子显微镜像。细胞皱缩，染色质边聚(白箭)标尺：1 μm 图 2 光感受器细胞坏死电子显微镜像。细胞肿胀，质膜不完整、破裂(白箭)标尺：1 μm 图 3 光感受器细胞坏死性凋亡电子显微镜像。细胞肿胀，质膜不完整、破裂，染色质浓集和边聚(白箭)，且伴有明显的自噬泡和空泡(白箭头)标尺：1 μm 图 4 实验组与对照组裂解的Caspase 8和p-RIP1蛋白相对表达比较。*：与对照组比较，P<0.05
Western blot检测结果显示，实验组、对照组裂解的Caspase 8蛋白相对表达分别为0.78±0.03、0.06±0.01，实验组裂解的Caspase 8蛋白相对表达较对照组明显增加。两组裂解的Caspase 8蛋白相对表达比较，差异有统计学意义(F=4 023.21，P<0.05)(图 4)。
免疫沉淀法检测结果显示，实验组、对照组p-RIP1蛋白相对表达分别为0.23±0.03、0.14±0.02，实验组p-RIP1蛋白相对表达较对照组明显增加。两组p-RIP1蛋白相对表达比较，差异有统计学意义(F=56.44，P<0.05)(图 4)。
3 讨论
死亡受体通路的激活，除引起细胞凋亡以外，还可以导致细胞发生坏死性凋亡[3]。本研究结果显示，单纯视网膜脱离后，光感受器细胞不仅出现了凋亡和坏死的病理学形态改变，同时部分细胞也表现为染色质浓集和边聚，并且可以观察到明显的自噬泡和空泡，符合坏死性凋亡的表现[5]。说明在单纯视网膜脱离中，没有Caspase抑制剂的诱导下，光感受器细胞也会出现坏死性凋亡。
研究发现，实验性视网膜脱离后3 d，光感受器细胞的原位末端标记阳性细胞数达到最高峰[6, 17]。因此，本研究也选用建模后3 d为实验时间点，采用Western blot和免疫沉淀的方法进一步研究死亡受体通路的标记蛋白Caspase 8的表达情况。结果发现，视网膜脱离后3 d，实验组裂解的Caspase 8蛋白相对表达较对照组明显增加。进一步证明了视网膜脱离中有死亡受体通路的激活。
坏死性凋亡同样也受死亡受体通路的激活，其主要通过死亡受体信号通路中RIP1蛋白来执行，当RIP1被磷酸化后，会传递坏死性凋亡信号，所以RIP1磷酸化水平增加是坏死性凋亡特异的生物学标记[3, 13, 14]。Degterev等[3]研究发现，程序性坏死特异性抑制剂Necrostatin-1可以特异性抑制坏死性凋亡，其靶点证实为RIP1的激酶活性，证实了在坏死性凋亡的发生中，RIP1的磷酸化是坏死性凋亡所必须的。本研究结果显示，视网膜脱离后3 d，实验组p-RIP1的蛋白相对表达较对照组明显增加。进一步验证了在单纯视网膜脱离中存在光感受器细胞的坏死性凋亡。
本研究通过视网膜下注入透明质酸钠成功建立视网膜脱离模型，证明单纯视网膜脱离中，没有外源性干预剂诱导的情况下光感受器细胞也会有坏死性凋亡的发生，其发生机制与RIP1磷酸化水平有关。但在单纯视网膜脱离中坏死性凋亡在坏死性细胞中所占比重，以及坏死性凋亡特异性抑制剂干预是否也会有神经保护作用还有待深入研究，这或许可以为视网膜脱离患者临床恢复和重建视功能提供新的治疗思路。
视网膜脱离时视网膜色素上皮层和神经纤维层分离，组织缺血、缺氧及激活死亡受体通路，可以导致光感受器细胞的凋亡[1, 2]。近年来研究发现，坏死性凋亡也是一种基本细胞死亡形式，亦受死亡受体通路激活，其发生与组织缺血、缺氧有着密切关系[3]。视网膜脱离后存在死亡受体通路的激活，光感受器细胞不仅有凋亡，同时还可能发生坏死性凋亡[4]。我们的前期研究发现，采用泛半胱氨酸蛋白酶(Caspase)抑制剂进行诱导后，会导致视网膜脱离中光感受器细胞的坏死性凋亡[5]。但在单纯视网膜脱离中，没有外源性干预的情况下，光感受器细胞坏死性凋亡的发生情况目前尚不清楚。为此，我们通过建立视网膜脱离大鼠模型，观察了单纯视网膜脱离中光感受器细胞坏死性凋亡的形态学特点，并初步探讨了其发生机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
本研究实验操作均严格遵守美国视觉眼科研究学会对动物实验的要求和上海交通大学、安徽医科大学对动物实验的规定。雄性健康的Sprague-Dawley大鼠60只，体重约260~280 g，由上海交通大学附属第一人民医院提供。参照文献[5-8]的方法，右眼视网膜下注入1%透明质酸纳(美国博士伦公司)50 μl建立视网膜脱离模型作为实验组，左眼不作处理为对照组。显微镜下可见局部视网膜脱离约占1/2范围，脱离范围于结膜面用10-0缝线做标记。
参照文献[5, 6, 9]的方法，采用电子显微镜观察光感受器细胞的死亡方式。建模后3 d，视网膜组织经2.5％戊二醛固定液固定12 h后，依次浸透、包埋、烤片。切片机切片、染色后，JEM-1200EX透射电子显微镜(日本电子公司)观察并拍照。每张切片首先根据内界膜的位置确定视网膜组织的位置，然后在双极细胞和光感受器细胞内节之间确定光感受器细胞的位置，随机选择200个光感受器细胞，通过形态学的改变判定视网膜脱离后光感受器细胞的死亡方式。以光感受器细胞皱缩，染色质边聚为凋亡细胞；细胞肿胀，质膜不完整、破裂为坏死细胞[10, 11]；细胞肿胀，质膜不完整、破裂，且染色质浓集和边聚，并伴有明显的自噬泡和空泡为坏死性凋亡[3, 12-14]。
参照文献[5, 11, 15]的方法和蛋白质免疫印迹(Western blot)法说明书对大鼠视网膜组织进行Western blot检测。建模后3 d，取视网膜组织，测定蛋白浓度。取等量蛋白质，依次行电泳分离、转膜、封闭。洗膜缓冲液(TBST)洗膜，加入一抗4℃过夜。复温后TBST洗膜3次，加入二抗，显影定影。采用Bandscan 43软件(加拿大Glyko公司)测定条带灰度值。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照。将裂解的Caspase 8与β-actin的灰度比值作为裂解的Caspase 8蛋白相对表达水平。
参照文献[5, 15, 16]的方法和免疫沉淀法说明书行对大鼠视网膜组织进行免疫沉淀检测。建模后3 d，收集视网膜标本，1 mg视网膜组织中加入1 mg/ml的抗受体相互作用蛋白1(RIP1)抗体(美国Cell Signaling Technology公司)1 μl和蛋白质A/G琼脂糖胶粒40 μl(碧云天生物技术研究所)，Tris缓冲液洗涤沉淀5次。取部分或全部样品行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。将磷酸化RIP1(p-RIP1)与RIP1蛋白的灰度比值作为p-RIP1蛋白相对表达水平。
采用SPSS 17.0统计软件行统计分析，实验数据以均数±标准差(
2 结果
电子显微镜观察发现，视网膜脱离后光感受器细胞的死亡方式主要为凋亡和坏死(图 1，2)。同时还可观察到光感受器细胞的坏死性凋亡，其形态学与坏死细胞类似，但染色质浓集和边聚，且伴有明显的自噬泡和空泡(图 3)。
图1
光感受器细胞凋亡电子显微镜像。细胞皱缩，染色质边聚(白箭)标尺：1 μm 图 2 光感受器细胞坏死电子显微镜像。细胞肿胀，质膜不完整、破裂(白箭)标尺：1 μm 图 3 光感受器细胞坏死性凋亡电子显微镜像。细胞肿胀，质膜不完整、破裂，染色质浓集和边聚(白箭)，且伴有明显的自噬泡和空泡(白箭头)标尺：1 μm 图 4 实验组与对照组裂解的Caspase 8和p-RIP1蛋白相对表达比较。*：与对照组比较，P<0.05
Western blot检测结果显示，实验组、对照组裂解的Caspase 8蛋白相对表达分别为0.78±0.03、0.06±0.01，实验组裂解的Caspase 8蛋白相对表达较对照组明显增加。两组裂解的Caspase 8蛋白相对表达比较，差异有统计学意义(F=4 023.21，P<0.05)(图 4)。
免疫沉淀法检测结果显示，实验组、对照组p-RIP1蛋白相对表达分别为0.23±0.03、0.14±0.02，实验组p-RIP1蛋白相对表达较对照组明显增加。两组p-RIP1蛋白相对表达比较，差异有统计学意义(F=56.44，P<0.05)(图 4)。
3 讨论
死亡受体通路的激活，除引起细胞凋亡以外，还可以导致细胞发生坏死性凋亡[3]。本研究结果显示，单纯视网膜脱离后，光感受器细胞不仅出现了凋亡和坏死的病理学形态改变，同时部分细胞也表现为染色质浓集和边聚，并且可以观察到明显的自噬泡和空泡，符合坏死性凋亡的表现[5]。说明在单纯视网膜脱离中，没有Caspase抑制剂的诱导下，光感受器细胞也会出现坏死性凋亡。
研究发现，实验性视网膜脱离后3 d，光感受器细胞的原位末端标记阳性细胞数达到最高峰[6, 17]。因此，本研究也选用建模后3 d为实验时间点，采用Western blot和免疫沉淀的方法进一步研究死亡受体通路的标记蛋白Caspase 8的表达情况。结果发现，视网膜脱离后3 d，实验组裂解的Caspase 8蛋白相对表达较对照组明显增加。进一步证明了视网膜脱离中有死亡受体通路的激活。
坏死性凋亡同样也受死亡受体通路的激活，其主要通过死亡受体信号通路中RIP1蛋白来执行，当RIP1被磷酸化后，会传递坏死性凋亡信号，所以RIP1磷酸化水平增加是坏死性凋亡特异的生物学标记[3, 13, 14]。Degterev等[3]研究发现，程序性坏死特异性抑制剂Necrostatin-1可以特异性抑制坏死性凋亡，其靶点证实为RIP1的激酶活性，证实了在坏死性凋亡的发生中，RIP1的磷酸化是坏死性凋亡所必须的。本研究结果显示，视网膜脱离后3 d，实验组p-RIP1的蛋白相对表达较对照组明显增加。进一步验证了在单纯视网膜脱离中存在光感受器细胞的坏死性凋亡。
本研究通过视网膜下注入透明质酸钠成功建立视网膜脱离模型，证明单纯视网膜脱离中，没有外源性干预剂诱导的情况下光感受器细胞也会有坏死性凋亡的发生，其发生机制与RIP1磷酸化水平有关。但在单纯视网膜脱离中坏死性凋亡在坏死性细胞中所占比重，以及坏死性凋亡特异性抑制剂干预是否也会有神经保护作用还有待深入研究，这或许可以为视网膜脱离患者临床恢复和重建视功能提供新的治疗思路。
