引用本文： 杨华伟, 雷宁玉, 王丽君, 薛有余, 张翠芳. CD147、基质金属蛋白酶-2和血管内皮生长因子在氧诱导视网膜病变大鼠中的表达. 中华眼底病杂志, 2014, 30(1): 71-74. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.01.018 复制
视网膜新生血管形成及视网膜增生在早产儿视网膜病变(ROP)的发生机制中起主导作用[1]。大量研究证实，血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-2在ROP发生过程中降解基底膜，刺激内皮细胞增生，促进血管生成，增加微血管通透性，从而为ROP新生血管的形成提供条件[2-4]。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子CD147在多种疾病的血管病变中发挥重要作用[5-9]。有研究表明，CD147与肿瘤的血管生成关系紧密，可通过诱导MMP和VEGF的表达而促进肿瘤的血管生成，为肿瘤生长、侵袭和转移提供条件[5, 6]。但目前有关CD147在ROP发生机制中的具体作用还不完全明确。为此，我们通过高氧诱导视网膜病变模型，观察了CD147、MMP-2、VEGF在大鼠视网膜中的表达，以期进一步探讨其在ROP发病机制中的作用。现将结果报道如下。
1 材料和方法
新生Wistar大鼠84只，山东中医药大学动物中心提供。新生鼠自出生后每天更换垫料，并记录体重变化、睁眼时间和毛发发育情况等。采用随机数字表法将小鼠分为对照组和高氧组，每组42只。参照文献[10-12]的方法建立氧诱导视网膜病变大鼠模型，将高氧组大鼠与哺乳母鼠置入接通100%湿润医用纯氧的密闭透明箱内，流量范围0.50~0.75 L/min，箱内含氧体积分数为(75±2)%，温度维持在(23±2)℃，用氧气分析仪监测并调控箱内氧气含量。每日将笼盒取出，更换饲料、加食水。连续吸高浓度氧气饲养7 d后，再置于正常空气中饲养7 d。建模过程中新生大鼠平均体重变化量相当，平均5~7 d皮肤毛发发育，13~14 d睁眼。对照组大鼠置于正常空气中饲养14 d，不做任何处理。
大鼠7、14日龄时，每组随机选取10只大鼠，取1只眼作视网膜铺片。以0.3 ml/100 g的剂量腹腔注射10％水合氯醛过量麻醉大鼠，立即摘除眼球、固定，去除角膜、晶状体，放射状切开4～5片，完整游离视网膜组织。经过漂洗、孵育、脂联素酶(ADP)染色、甘油明胶封片，光学显微镜下观察大鼠视网膜血管形态。大鼠14日龄时，将行视网膜铺片实验的大鼠对侧眼眼球立即置入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h。常规脱水、石蜡包埋，切片方向平行于角膜至视盘的矢状位，连续4 μm切片，苏木精伊红(HE)染色，光学显微镜下观察。每只眼球取20张切片，相邻2张切片间隔30 μm；用双盲法计数血管内皮细胞核，统计平均每只眼球每张切片突破内界膜的内皮细胞核数。选取切片时避开视盘周围；计数血管内皮细胞核时仅计数与内界膜有联系的血管内皮细胞核。
大鼠12、14、16日龄时，每组随机选取8只大鼠处死，立即摘除眼球置入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h。常规脱水、石蜡包埋，切片方向平行于角膜至视盘的矢状位，连续4 μm切片。随机选取20张切片，经常规脱蜡、水化后行免疫组织化学染色。洗去一抗，滴加二抗，二氨基联苯胺(DAB)染色、脱水透明、中性树胶封片。采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。以细胞棕色染色为阳性反应。采用双盲法，于400倍光学显微镜下，每个样本的CD147、MMP-2、VEGF切片图像随机采集7幅，经Image-pro Plus 6.0软件对图像中阳性反应部位进行吸光度[A，旧称光密度(OD)]值进行分析。
采用 SPSS 13.0 统计软件对数据进行统计分析，实验数据均以均数±标准差(
2 结果
光学显微镜观察发现，大鼠7日龄时，对照组大鼠视网膜血管呈放射状分布，血管径较粗(图 1A)；高氧组大鼠视网膜血管收缩，大面积无血管区，仅见少量小面积的血管网(图 1B)。大鼠14日龄时，对照组大鼠视网膜血管发育较好，网格规整(图 2A)；高氧组大鼠视网膜血管增生、纡曲、扩张，并在灌注区与非灌注区交界处形成新生血管丛、渗出、出血(图 2B)。
光学显微镜观察发现，大鼠14日龄时，对照组仅在极少数切片中见到突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核，高氧组可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核(图 3)。对照组、高氧组突破内界膜的内皮细胞核数分别为(1.30±1.26)、(19.70±3.56)个；两组比较，差异有统计学意义(t=21.813，P<0.01)。
光学显微镜观察发现，对照组大鼠视网膜各层可见CD147、MMP-2、VEGF有少量表达；高氧组大鼠视网膜各层可见CD147、VEGF、MMP-2表达明显增多，CD147在视网膜色素上皮层的表达也较明显(图 4~6)。大鼠12日龄时，CD147即有较强表达，早于VEGF与MMP-2；随后三者过表达持续至大鼠16日龄。大鼠12、14、16日龄时，两组大鼠视网膜各层中CD147(t=5.612、11.390、6.355)、MMP-2(t=4.122、8.047、4.422)、VEGF(t=4.955、12.176、5.110)表达比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。相关性分析发现，CD147的表达与MMP-2、VEGF的表达均呈正相关(r=0.755、0.820，P<0.01)。
图1
大鼠7日龄时光学显微镜像。1A. 对照组，视网膜血管呈放射状分布，血管径较粗；1B. 高氧组，视网膜血管收缩，大面积无血管区，仅见少量小面积的血管网 ADP ×100 图 2 大鼠14日龄时光学显微镜像。2A. 对照组，视网膜血管发育较好，网格规整；2B. 高氧组，视网膜血管增生、纡曲、扩张，并在灌注区与非灌注区交界处形成新生血管丛、渗出、出血 ADP ×100 图 3 大鼠14日龄时光学显微镜像。3A. 对照组，少见突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核；3B. 高氧组，可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核(黑箭) HE ×400 图 4 大鼠14日龄时免疫组织化学染色像。4A. 对照组，视网膜各层可见少量CD147表达；4B. 高氧组，视网膜色素上皮层可见大量CD147表达 DAB ×400 图 5 大鼠14日龄时免疫组织化学染色像。5A. 对照组，视网膜各层可见少量MMP-2表达；5B. 高氧组，视网膜各层可见大量MMP-2表达 DAB ×400 图 6 大鼠14日龄时免疫组织化学染色像。6A. 对照组，视网膜各层可见少量VEGF表达；6B. 高氧组，视网膜各层可见大量VEGF表达 DAB ×400
3 讨论
探索并阻断ROP发生发展过程是临床关注的一个热点问题[13-16]。高氧诱导Wistar新生大鼠制备氧诱导视网膜病变是一个成熟并被广泛使用的疾病模型[10-12]。本研究也采用这种方法建立了氧诱导视网膜病变模型，并通过视网膜铺片和石蜡切片观察发现，高氧组大鼠视网膜可见大面积无灌注区、新生血管及突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核，证实模型制备成功。
本研究结果显示，CD147在大鼠12日龄时即有强表达，且持续至大鼠16日龄。说明CD147在早期表达，持续时间长，可以推测在ROP发生的早期即有CD147的表达，并发挥其促进疾病发生发展的作用。有研究表明，MMP-2、VEGF的明显表达与ROP的发生发展密切相关[17-19]。但到目前为止，有关CD147在ROP发生机制中的作用及其与MMP-2、VEGF的相关性还少见报道。我们发现，在正常大鼠视网膜各层组织中，CD147呈低表达，符合它存在于正常视网膜，但处于较低水平的特点。而在ROP大鼠中，CD147在各层表达明显增加，其间接导致血管内皮基质溶解，内皮细胞迁移，新生血管生成。MMP-2是主要参与降解的酶类,VEGF被认为是最主要袭击视网膜血管生成的因子。本研究结果还显示，CD147的表达与MMP-2、VEGF表达呈正相关。提示过表达的CD147、MMP-2、VEGF增强视网膜血管生成，导致较差的预后。据此我们推测，CD147、MMP-2、VEGF的相关表达在视网膜血管增生的过程中可看做具有价值的预后评估、干预防治手段。但有关CD147在ROP中促进MMP -2和 VEGF的表达的机制尚需进一步研究。
本研究结果表明，过表达的CD147可能在ROP的发生中扮演重要角色。CD147、MMP-2及VEGF的表达与 ROP的血管增生迁移密切相关，可作为 ROP新生血管发生生物学行为的参考指标。检测三者的表达有助于对ROP进行早期干预预防，具有重要临床意义。作为上游分子的CD147，阻断其表达和活性可能成为 ROP治疗的新靶点。今后需进一步从信号通路及基因角度进行深一步的研究。
视网膜新生血管形成及视网膜增生在早产儿视网膜病变(ROP)的发生机制中起主导作用[1]。大量研究证实，血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-2在ROP发生过程中降解基底膜，刺激内皮细胞增生，促进血管生成，增加微血管通透性，从而为ROP新生血管的形成提供条件[2-4]。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子CD147在多种疾病的血管病变中发挥重要作用[5-9]。有研究表明，CD147与肿瘤的血管生成关系紧密，可通过诱导MMP和VEGF的表达而促进肿瘤的血管生成，为肿瘤生长、侵袭和转移提供条件[5, 6]。但目前有关CD147在ROP发生机制中的具体作用还不完全明确。为此，我们通过高氧诱导视网膜病变模型，观察了CD147、MMP-2、VEGF在大鼠视网膜中的表达，以期进一步探讨其在ROP发病机制中的作用。现将结果报道如下。
1 材料和方法
新生Wistar大鼠84只，山东中医药大学动物中心提供。新生鼠自出生后每天更换垫料，并记录体重变化、睁眼时间和毛发发育情况等。采用随机数字表法将小鼠分为对照组和高氧组，每组42只。参照文献[10-12]的方法建立氧诱导视网膜病变大鼠模型，将高氧组大鼠与哺乳母鼠置入接通100%湿润医用纯氧的密闭透明箱内，流量范围0.50~0.75 L/min，箱内含氧体积分数为(75±2)%，温度维持在(23±2)℃，用氧气分析仪监测并调控箱内氧气含量。每日将笼盒取出，更换饲料、加食水。连续吸高浓度氧气饲养7 d后，再置于正常空气中饲养7 d。建模过程中新生大鼠平均体重变化量相当，平均5~7 d皮肤毛发发育，13~14 d睁眼。对照组大鼠置于正常空气中饲养14 d，不做任何处理。
大鼠7、14日龄时，每组随机选取10只大鼠，取1只眼作视网膜铺片。以0.3 ml/100 g的剂量腹腔注射10％水合氯醛过量麻醉大鼠，立即摘除眼球、固定，去除角膜、晶状体，放射状切开4～5片，完整游离视网膜组织。经过漂洗、孵育、脂联素酶(ADP)染色、甘油明胶封片，光学显微镜下观察大鼠视网膜血管形态。大鼠14日龄时，将行视网膜铺片实验的大鼠对侧眼眼球立即置入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h。常规脱水、石蜡包埋，切片方向平行于角膜至视盘的矢状位，连续4 μm切片，苏木精伊红(HE)染色，光学显微镜下观察。每只眼球取20张切片，相邻2张切片间隔30 μm；用双盲法计数血管内皮细胞核，统计平均每只眼球每张切片突破内界膜的内皮细胞核数。选取切片时避开视盘周围；计数血管内皮细胞核时仅计数与内界膜有联系的血管内皮细胞核。
大鼠12、14、16日龄时，每组随机选取8只大鼠处死，立即摘除眼球置入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h。常规脱水、石蜡包埋，切片方向平行于角膜至视盘的矢状位，连续4 μm切片。随机选取20张切片，经常规脱蜡、水化后行免疫组织化学染色。洗去一抗，滴加二抗，二氨基联苯胺(DAB)染色、脱水透明、中性树胶封片。采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。以细胞棕色染色为阳性反应。采用双盲法，于400倍光学显微镜下，每个样本的CD147、MMP-2、VEGF切片图像随机采集7幅，经Image-pro Plus 6.0软件对图像中阳性反应部位进行吸光度[A，旧称光密度(OD)]值进行分析。
采用 SPSS 13.0 统计软件对数据进行统计分析，实验数据均以均数±标准差(
2 结果
光学显微镜观察发现，大鼠7日龄时，对照组大鼠视网膜血管呈放射状分布，血管径较粗(图 1A)；高氧组大鼠视网膜血管收缩，大面积无血管区，仅见少量小面积的血管网(图 1B)。大鼠14日龄时，对照组大鼠视网膜血管发育较好，网格规整(图 2A)；高氧组大鼠视网膜血管增生、纡曲、扩张，并在灌注区与非灌注区交界处形成新生血管丛、渗出、出血(图 2B)。
光学显微镜观察发现，大鼠14日龄时，对照组仅在极少数切片中见到突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核，高氧组可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核(图 3)。对照组、高氧组突破内界膜的内皮细胞核数分别为(1.30±1.26)、(19.70±3.56)个；两组比较，差异有统计学意义(t=21.813，P<0.01)。
光学显微镜观察发现，对照组大鼠视网膜各层可见CD147、MMP-2、VEGF有少量表达；高氧组大鼠视网膜各层可见CD147、VEGF、MMP-2表达明显增多，CD147在视网膜色素上皮层的表达也较明显(图 4~6)。大鼠12日龄时，CD147即有较强表达，早于VEGF与MMP-2；随后三者过表达持续至大鼠16日龄。大鼠12、14、16日龄时，两组大鼠视网膜各层中CD147(t=5.612、11.390、6.355)、MMP-2(t=4.122、8.047、4.422)、VEGF(t=4.955、12.176、5.110)表达比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。相关性分析发现，CD147的表达与MMP-2、VEGF的表达均呈正相关(r=0.755、0.820，P<0.01)。
图1
大鼠7日龄时光学显微镜像。1A. 对照组，视网膜血管呈放射状分布，血管径较粗；1B. 高氧组，视网膜血管收缩，大面积无血管区，仅见少量小面积的血管网 ADP ×100 图 2 大鼠14日龄时光学显微镜像。2A. 对照组，视网膜血管发育较好，网格规整；2B. 高氧组，视网膜血管增生、纡曲、扩张，并在灌注区与非灌注区交界处形成新生血管丛、渗出、出血 ADP ×100 图 3 大鼠14日龄时光学显微镜像。3A. 对照组，少见突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核；3B. 高氧组，可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核(黑箭) HE ×400 图 4 大鼠14日龄时免疫组织化学染色像。4A. 对照组，视网膜各层可见少量CD147表达；4B. 高氧组，视网膜色素上皮层可见大量CD147表达 DAB ×400 图 5 大鼠14日龄时免疫组织化学染色像。5A. 对照组，视网膜各层可见少量MMP-2表达；5B. 高氧组，视网膜各层可见大量MMP-2表达 DAB ×400 图 6 大鼠14日龄时免疫组织化学染色像。6A. 对照组，视网膜各层可见少量VEGF表达；6B. 高氧组，视网膜各层可见大量VEGF表达 DAB ×400
3 讨论
探索并阻断ROP发生发展过程是临床关注的一个热点问题[13-16]。高氧诱导Wistar新生大鼠制备氧诱导视网膜病变是一个成熟并被广泛使用的疾病模型[10-12]。本研究也采用这种方法建立了氧诱导视网膜病变模型，并通过视网膜铺片和石蜡切片观察发现，高氧组大鼠视网膜可见大面积无灌注区、新生血管及突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核，证实模型制备成功。
本研究结果显示，CD147在大鼠12日龄时即有强表达，且持续至大鼠16日龄。说明CD147在早期表达，持续时间长，可以推测在ROP发生的早期即有CD147的表达，并发挥其促进疾病发生发展的作用。有研究表明，MMP-2、VEGF的明显表达与ROP的发生发展密切相关[17-19]。但到目前为止，有关CD147在ROP发生机制中的作用及其与MMP-2、VEGF的相关性还少见报道。我们发现，在正常大鼠视网膜各层组织中，CD147呈低表达，符合它存在于正常视网膜，但处于较低水平的特点。而在ROP大鼠中，CD147在各层表达明显增加，其间接导致血管内皮基质溶解，内皮细胞迁移，新生血管生成。MMP-2是主要参与降解的酶类,VEGF被认为是最主要袭击视网膜血管生成的因子。本研究结果还显示，CD147的表达与MMP-2、VEGF表达呈正相关。提示过表达的CD147、MMP-2、VEGF增强视网膜血管生成，导致较差的预后。据此我们推测，CD147、MMP-2、VEGF的相关表达在视网膜血管增生的过程中可看做具有价值的预后评估、干预防治手段。但有关CD147在ROP中促进MMP -2和 VEGF的表达的机制尚需进一步研究。
本研究结果表明，过表达的CD147可能在ROP的发生中扮演重要角色。CD147、MMP-2及VEGF的表达与 ROP的血管增生迁移密切相关，可作为 ROP新生血管发生生物学行为的参考指标。检测三者的表达有助于对ROP进行早期干预预防，具有重要临床意义。作为上游分子的CD147，阻断其表达和活性可能成为 ROP治疗的新靶点。今后需进一步从信号通路及基因角度进行深一步的研究。
