引用本文： 李艳, 程子萱, 罗婷, 吕红彬. 地拉罗司抑制人视网膜血管内皮细胞脂质过氧化和铁死亡. 中华眼底病杂志, 2024, 40(12): 947-953. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20240701-00243 复制
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糖尿病视网膜病变（DR）是一种慢性进行性致盲性眼病[1]。视网膜血管内皮细胞（HREC）参与构成血视网膜屏障，其完整性丧失导致的血管通透性增加是DR发病的根本原因[2]。尽管DR的发病机制复杂且尚未完全阐明，但近年来的研究揭示了蛋白质组学变化在DR中的重要角色，尤其是差异蛋白富集于铁死亡通路，提示铁死亡可能是DR的潜在治疗靶点[3-4]。铁死亡是一种以铁依赖为特征的细胞程序性死亡方式，它与铁代谢、脂质代谢等多种代谢途径密切相关，铁死亡可以被脂质活性氧（ROS）清除剂和铁螯合剂抑制[5-7]。在糖尿病状态下，体内铁负荷增加可加速DR发展，特别是在小鼠模型中观察到视网膜中铁含量的上升损害了血视网膜屏障的结构与功能；此外，铁浓度与增生性视网膜病变的严重程度呈正比关系，采用低铁饮食或铁螯合剂干预能有效减缓糖尿病引起的肾脏损伤进程[8]。地拉罗司（DFX）是一种铁螯合剂，可以抑制Cys2剥夺、系统XC-抑制以及谷胱甘肽（GSH）过氧化物酶4（GPX4）抑制所致的铁死亡[9-10]。然而，关于DFX是否能在高糖条件下抑制HREC的铁死亡及其具体作用机制，仍需进一步探究。为此，本研究通过体外细胞实验分析DFX对HREC的脂质过氧化和铁死亡的作用，并初步探讨DFX在高糖环境下抑制HREC铁死亡的潜在机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
HREC（河南北纳生物技术有限公司）；Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，L540KJ，美国Gibco公司）；DFX（HY-17359）、柠檬酸铁胺（FAC，HY-B1645）、磷酸盐缓冲液（PBS）、Tris-HCl缓冲盐溶液（TBST）（美国MedChemexpress公司）；细胞计数试剂盒-8（CCK-8，上海碧云天生物技术有限公司）；钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein-AM）细胞增殖活性检测试剂盒（美国Yeasen公司）；2',7'-二氯荧光素二乙酸酯）荧光探针（DCFH-DA）测定试剂盒、脂质过氧化物丙二醛（MDA）试剂盒、GSH和氧化型GSH（GSSG）测定试剂盒（南京建成科技有限公司）；GPX4（ab125066）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11，26864-1-AP）、β-肌动蛋白（β-actin，AF7018）一抗和二抗（美国Affinity公司）；IX51倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；SMR16.1酶链免疫检测仪（美国TUSCNK公司）；DYY-6C电泳仪、DYCZ-24DN垂直电泳槽仪（北京市六一仪器厂）。
1.2 方法
细胞培养与分组。HREC置于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中常规培养。取对数生长期细胞用于实验。HREC分为正常糖组（NG组，5.5 mmol/L葡萄糖培养细胞）、高糖组（HG组，25 mmol/L葡萄糖培养细胞）、正常糖+DFX组（NG+DFX组，5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞）、高糖+DFX组（HG+DFX组，25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞）、正常糖+DFX+FAC组（NG+DFX+FAC组，5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞）、高糖+DFX+FAC组（HG+DFX+FAC组，25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞）。所有细胞均孵育24 h进行后续实验。
光学显微镜观察各组细胞形态变化。将细胞以1×105个/ml的细胞密度接种于T25细胞培养瓶中，培养至细胞贴壁后，光学显微镜下观察细胞形态并采集图像。
CCK-8检测各组细胞增殖活性。将细胞以5×104个/ml的密度接种于96孔板中，每100 μl细胞悬液滴加10 μl CCK-8试剂孵育4 h，采用酶链免疫检测仪测量波长450 nm处的吸光度［A，旧称光密度（OD）］值。每组设6个复孔，实验重复3次。增殖率（%）＝（实验组－空白组）/（对照组－空白组）×100%。
Calcein-AM检测各组细胞内不稳定铁池（LIP）含量。Calcein-AM试剂在室温下恢复30 min后用PBS配置成终浓度为4 µmol/L的溶液。将细胞以2×105个/ml的密度接种于6孔板中孵育24 h。PBS洗涤3次，胰酶消化并以12 000×g离心5 min，PBS洗涤细胞，向200 μl细胞悬液中加入100 μl Calcein-AM荧光探针染液，充分混匀后在37°C水浴锅中避光孵育30 min。荧光显微镜下观察并拍照。使用Image J Program软件计算各组荧光强度。
酶链免疫检测仪检测各组细胞ROS、MDA、GSH/GSSG含量。ROS含量检测：将细胞以1×106个/ml的密度接种于6孔板中，每孔滴加1 ml DCFH-DA荧光探针溶液，37℃避光孵育30 min，以12 000×g离心5 min，PBS洗涤2次，采用荧光酶链免疫检测仪检测波长488 nm处的A值。MDA含量检测：将细胞以5×104个/ml的密度接种于6孔板中，95℃水浴锅孵育40 min，以12 000×g离心10 min，每孔滴加250 μl提前配制的标准品和MDA工作液。采用酶链免疫检测仪测量波长532 nm处的A值。GSH/GSSG含量检测：将细胞以1×105个/ml密度接种于6孔板中，每100 μl待测细胞中滴加20 μl的标准品和GSH试剂，95℃水浴锅孵育40 min，以4 000×g离心10 min。采用酶链免疫检测仪测量波长405 nm处的A值。根据标准品的A值作出标准曲线后，样品对照标准曲线计算出GSH和GSSG的含量。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测各组细胞GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量。收集各组细胞总蛋白，调整蛋白浓度，每个样品中加入40 μg待测样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳；80 V恒压0.5 h，样品进入分离胶后120 V恒压2 h，300 mA转膜2 h，5%脱脂牛奶常温封闭1 h，一抗GPX4、SLC7A11、β-actin（1∶1 000）4℃过夜孵育（β-actin作为阳性对照），TBST洗膜5 min，重复3次；加入辣根过氧化物偶联的二抗（1∶5 000），37℃孵育2 h，TBST洗膜5 min，重复4次；加入化学发光剂，暗室显影成像。采用Image J Program软件分析蛋白条带灰度值，以目的条带与β-actin条带的比值代表蛋白的相对表达水平。
1.3 统计学方法
采用Graphpad prism 10.3软件进行统计分析和图表整理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用双尾Student t检验；多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DFX改善高糖诱导的HREC细胞增殖活力
细胞培养24 h后，NG组细胞呈梭形，分布均匀，贴壁良好；HG组细胞贴壁不佳，部分细胞呈圆形漂浮于培养基中；NG+DFX组细胞生长情况良好，细胞状态接近NG组；HG+DFX组大部分细胞贴壁生长，少量细胞呈圆形漂浮于培养基中；NG+DFX+FAC组细胞贴壁不佳，较多细胞呈圆形漂浮于培养基中；HG+DFX+FAC组少许细胞贴壁，大量细胞呈圆形漂浮于培养基中。6组间细胞增殖率比较，差异有统计学意义（F=150.70，P＜0.000 1）。组间细胞增殖率两两比较，HG组较NG组显著降低，HG+DFX组较HG组显著升高，NG+DFX+FAC组较NG+DFX组显著降低，HG+DFX+FAC组较HG+DFX组显著降低，差异均有统计学意义（t=19.01、8.49、13.23、10.74，P＜0.000 1）（图1）。
图1
DFX改善高糖诱导的HREC细胞增殖（n=3） 1A～1F分别示NG组、HG组、NG+DFX组、HG+DFX组、NG+DFX+FAC组和HG+DFX+FAC组HREC光学显微镜像（标尺：50 μm）。与NG组比较，HG组细胞贴壁不佳，部分细胞呈圆形漂浮于培养基中；加入DFX后细胞贴壁情况改善，浮游细胞减少，加入FAC则可逆转DFX对HREC的保护作用。1G示6组细胞增殖率比较，****P＜0.000 1 HREC：人视网膜血管内皮细胞；NG：正常糖；HG：高糖；DFX：地拉罗司；FAC：柠檬酸铁胺；NG组：加入5.5 mmol/L葡萄糖培养细胞；HG组：加入25 mmol/L葡萄糖培养细胞；NG+DFX组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；HG+DFX组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；NG+DFX+FAC组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞；HG+DFX+ FAC组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞
2.2 DFX抑制HREC铁过载
平均荧光强度与细胞内LIP含量成反比。荧光显微镜观察发现，HG组、NG+DFX+FAC组、HG+DFX+FAC组荧光强度显著下降，LIP含量上升；HG+DFX组荧光强度显著增强，LIP含量下降。各组细胞间荧光强度比较，差异有统计学意义（F=807.20，P＜0.001）。组间荧光强度两两比较，HG组较NG组显著降低，HG+DFX组较HG组显著升高，NG+DFX+FAC组较NG+DFX组显著降低，HG+DFX+FAC组较HG+DFX组显著降低，差异均有统计学意义（t=34.96、18.95、37.52、28.10，P＜0.001）（图2）。
图2
DFX抑制HREC中LIP含量（n=3） 2A～2F分别示NG组、HG组、NG+DFX组、HG+DFX组、NG+DFX+FAC组和HG+DFX+FAC组HREC荧光显微镜像（标尺：20 μm）。与NG组比较，HG组荧光强度显著下降，LIP含量上升；加入DFX后荧光强度显著增强，LIP含量下降，加入FAC则可逆转DFX的铁螯合作用。2G示6组细胞荧光强度比较，***P＜0.001 HREC：人视网膜血管内皮细胞；NG：正常糖；HG：高糖；DFX：地拉罗司；FAC：柠檬酸铁胺；LIP：不稳定铁池；NG组：加入5.5 mmol/L葡萄糖培养细胞；HG组：加入25 mmol/L葡萄糖培养细胞；NG+DFX组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；HG+DFX组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；NG+DFX+FAC组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞；HG+DFX+ FAC组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞
2.3 DFX抑制HREC中ROS生成
DCFH-DA检测结果显示，各组细胞间ROS水平差异有统计学意义（F=16.94，P＜0.001）。组间ROS含量两两比较，HG组较NG组显著升高，HG+DFX组较HG组显著降低，NG+DFX+FAC组较NG+DFX组显著升高，HG+DFX+FAC组较HG+DFX组显著升高，差异均有统计学意义（t=5.38、3.66、4.24、5.07，P＜0.01、0.05、0.05、0.01）（图3）。
图3
各组HREC中活性氧含量比较（n=3） *P＜0.05，**P＜0.01 HREC：人视网膜血管内皮细胞；NG：正常糖；HG：高糖；DFX：地拉罗司；FAC：柠檬酸铁胺；NG组：加入5.5 mmol/L葡萄糖培养细胞；HG组：加入25 mmol/L葡萄糖培养细胞；NG+DFX组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；HG+DFX组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；NG+DFX+FAC组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞；HG+DFX+ FAC组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞
2.4 DFX抑制HREC脂质过氧化
各组细胞间MDA、GSH、GSSG含量比较，差异均有统计学意义（F=31.62、21.02、19.21，P＜0.001、0.001、0.000 1）（图4）。组间MDA、GSSG含量两两比较，HG组较NG组显著升高，HG+DFX组较HG组显著降低，NG+DFX+FAC组较NG+DFX组显著升高，HG+DFX+FAC组较HG+DFX组显著升高，差异均有统计学意义（MDA：t=7.38、3.67、6.45、5.93，P＜0.001、0.05、0.001、0.01；GSSG：t=6.00、3.68、4.37、4.90，P＜0.001、0.05、0.05、0.01）。组间GSH两两比较，HG组较NG组显著降低，HG+DFX组较HG组显著升高，NG+DFX+FAC组较NG+DFX组显著降低，HG+DFX+FAC组较HG+DFX组显著降低，差异均有统计学意义（t=6.84、4.65、4.08、5.50，P＜0.001、0.01、0.05、0.01）。
图4
各组HREC中MDA、GSH、GSSG含量比较（n=3） 4A～ 4C分别示MDA、GSH、GSSG含量，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 HREC：人视网膜血管内皮细胞；MDA：脂质过氧化物丙二醛；GSH：谷胱甘肽；GSSG：氧化型GSH；NG：正常糖；HG：高糖；DFX：地拉罗司；FAC：柠檬酸铁胺；NG组：加入5.5 mmol/L葡萄糖培养细胞；HG组：加入25 mmol/L葡萄糖培养细胞；NG+DFX组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；HG+DFX组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；NG+DFX+FAC组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞；HG+DFX+ FAC组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞
2.5 DFX减轻HREC XC-抑制
Western blot检测结果显示，各组细胞中GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（F=26.09、52.62，P＜0.001）。组间GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量两两比较，HG组较NG组显著降低，HG+DFX组较HG组显著升高，NG+DFX+FAC组较NG+DFX组显著降低，HG+DFX+FAC组较HG+DFX组显著降低，差异均有统计学意义（t=6.08、3.75、6.00、6.07、9.45、4.08、9.16、6.34，P＜0.001、0.05、0.001、0.001）（图5）。
图5
各组HREC中GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量比较（n=3） 5A示GPX4、SLC7A11蛋白表达电泳图。5B示GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量比较，*P＜0.05，***P＜0.001 HREC：人视网膜血管内皮细胞；NG：正常糖；HG：高糖；DFX：地拉罗司；FAC：柠檬酸铁胺；GPX4：谷胱甘肽过氧化物酶4；SLC7A11：溶质载体家族7成员11；NG组：加入5.5 mmol/L葡萄糖培养细胞；HG组：加入25 mmol/L葡萄糖培养细胞；NG+DFX组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；HG+DFX组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；NG+DFX+FAC组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞；HG+DFX+ FAC组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞
3 讨论
长期高血糖是视网膜损伤的危险因素，视网膜血管屏障损伤是高糖致视网膜变性的关键事件[11]。各种细胞死亡模式，包括凋亡、坏死、铁死亡和自噬，都会导致视网膜血管内皮细胞的损伤[12]。铁死亡在DR中的作用尚不明确。研究表明，高糖在体外诱导视网膜血管内皮细胞发生铁死亡，提示铁死亡发生在视网膜细胞中[13]。本研究旨在探讨铁螯合剂DFX对高糖诱导的HREC铁死亡的保护作用及其机制，为DR的治疗提供新的思路。
本研究发现，高糖干预导致HREC中铁过载，ROS水平及MDA、GSSG含量上升，GSH含量、GSH/GSSG比值降低，且铁死亡关键蛋白GPX4和SLC7A11表达降低，表明视网膜血管内皮细胞发生了铁死亡。在生物化学过程中，Fe2+通过芬顿反应生成大量ROS，导致细胞内GSH大量消耗，引起半胱氨酸缺乏，GPX4失活，无法有效还原异常脂质过氧化物，从而产生MDA，进一步破坏细胞结构[14]。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，是机体最重要的抗氧化物质之一。其中，约90%～95%以GSH的形式存在，而5%～10%以GSSG的形式存在[15]。GPX4是细胞抵御脂质过氧化的重要物质，GPX家族成员使用GSH作为辅助因子，将脂质过氧化物解毒为脂质醇，从而抑制铁死亡[16]。XC-系统在细胞内半胱氨酸平衡和GSH生物合成中起着重要作用，SLC7A11是XC-系统的一个重要亚基，其在细胞中过表达可以促进GSH合成从而阻断铁死亡[17]。目前，在高糖环境下检测药物对铁死亡影响的研究较少。本研究首次探索铁螯合剂在高糖诱导的HREC铁死亡中的作用。DFX是一种对Fe3+具有高亲和力的三齿螯合剂，以2∶1的比例与铁结合形成复合物。2005年，美国食品药品监督管理局批准DFX用于治疗由输血引起的铁负荷增加[18]。本研究发现，高糖环境下细胞发生了铁过载，而DFX通过螯合细胞内不稳定Fe2+，减轻细胞中的氧化应激，显著降低了脂质过氧化产物MDA含量，提高了GSH含量，并增加了GPX4和SLC7A11蛋白的表达水平。GPX4在将脂质过氧化氢还原为相应的醇形式中发挥独特的作用，从而中断铁催化的脂质过氧化[19]。GSH是GPX4激活的重要辅助因子。因此，GPX4的上调可能与SLC7A11基因上调和细胞内GSH的增加有关。然而，DFX影响SLC7A11基因表达的具体机制仍有待进一步研究。
本研究发现，铁螯合剂DFX在高糖环境下能够有效抑制HREC的铁死亡，通过螯合细胞内不稳定的Fe2+，减轻氧化应激，提高GSH含量，增加GPX4和SLC7A11蛋白的表达水平，从而保护细胞免受损伤。这些结果表明，铁螯合剂可能成为DR治疗的新方法。然而，本研究也存在一些局限性。首先，实验仅在体外细胞模型中进行，未能充分反映体内复杂的病理生理环境；其次，本研究虽揭示了DFX具有铁螯合作用，但未深入研究其分子机制以及对铁代谢的干扰。未来的研究应进一步探索DFX在动物模型中的作用及其安全性，以验证其在体内环境中的疗效和潜在副作用。此外，还需要深入研究DFX影响SLC7A11基因表达的具体机制，为开发针对铁死亡的新型治疗策略提供理论依据。通过这些研究，有望为DR的临床治疗提供新的药物选择和科学支持。
糖尿病视网膜病变（DR）是一种慢性进行性致盲性眼病[1]。视网膜血管内皮细胞（HREC）参与构成血视网膜屏障，其完整性丧失导致的血管通透性增加是DR发病的根本原因[2]。尽管DR的发病机制复杂且尚未完全阐明，但近年来的研究揭示了蛋白质组学变化在DR中的重要角色，尤其是差异蛋白富集于铁死亡通路，提示铁死亡可能是DR的潜在治疗靶点[3-4]。铁死亡是一种以铁依赖为特征的细胞程序性死亡方式，它与铁代谢、脂质代谢等多种代谢途径密切相关，铁死亡可以被脂质活性氧（ROS）清除剂和铁螯合剂抑制[5-7]。在糖尿病状态下，体内铁负荷增加可加速DR发展，特别是在小鼠模型中观察到视网膜中铁含量的上升损害了血视网膜屏障的结构与功能；此外，铁浓度与增生性视网膜病变的严重程度呈正比关系，采用低铁饮食或铁螯合剂干预能有效减缓糖尿病引起的肾脏损伤进程[8]。地拉罗司（DFX）是一种铁螯合剂，可以抑制Cys2剥夺、系统XC-抑制以及谷胱甘肽（GSH）过氧化物酶4（GPX4）抑制所致的铁死亡[9-10]。然而，关于DFX是否能在高糖条件下抑制HREC的铁死亡及其具体作用机制，仍需进一步探究。为此，本研究通过体外细胞实验分析DFX对HREC的脂质过氧化和铁死亡的作用，并初步探讨DFX在高糖环境下抑制HREC铁死亡的潜在机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
HREC（河南北纳生物技术有限公司）；Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，L540KJ，美国Gibco公司）；DFX（HY-17359）、柠檬酸铁胺（FAC，HY-B1645）、磷酸盐缓冲液（PBS）、Tris-HCl缓冲盐溶液（TBST）（美国MedChemexpress公司）；细胞计数试剂盒-8（CCK-8，上海碧云天生物技术有限公司）；钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein-AM）细胞增殖活性检测试剂盒（美国Yeasen公司）；2',7'-二氯荧光素二乙酸酯）荧光探针（DCFH-DA）测定试剂盒、脂质过氧化物丙二醛（MDA）试剂盒、GSH和氧化型GSH（GSSG）测定试剂盒（南京建成科技有限公司）；GPX4（ab125066）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11，26864-1-AP）、β-肌动蛋白（β-actin，AF7018）一抗和二抗（美国Affinity公司）；IX51倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；SMR16.1酶链免疫检测仪（美国TUSCNK公司）；DYY-6C电泳仪、DYCZ-24DN垂直电泳槽仪（北京市六一仪器厂）。
1.2 方法
细胞培养与分组。HREC置于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中常规培养。取对数生长期细胞用于实验。HREC分为正常糖组（NG组，5.5 mmol/L葡萄糖培养细胞）、高糖组（HG组，25 mmol/L葡萄糖培养细胞）、正常糖+DFX组（NG+DFX组，5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞）、高糖+DFX组（HG+DFX组，25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞）、正常糖+DFX+FAC组（NG+DFX+FAC组，5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞）、高糖+DFX+FAC组（HG+DFX+FAC组，25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞）。所有细胞均孵育24 h进行后续实验。
光学显微镜观察各组细胞形态变化。将细胞以1×105个/ml的细胞密度接种于T25细胞培养瓶中，培养至细胞贴壁后，光学显微镜下观察细胞形态并采集图像。
CCK-8检测各组细胞增殖活性。将细胞以5×104个/ml的密度接种于96孔板中，每100 μl细胞悬液滴加10 μl CCK-8试剂孵育4 h，采用酶链免疫检测仪测量波长450 nm处的吸光度［A，旧称光密度（OD）］值。每组设6个复孔，实验重复3次。增殖率（%）＝（实验组－空白组）/（对照组－空白组）×100%。
Calcein-AM检测各组细胞内不稳定铁池（LIP）含量。Calcein-AM试剂在室温下恢复30 min后用PBS配置成终浓度为4 µmol/L的溶液。将细胞以2×105个/ml的密度接种于6孔板中孵育24 h。PBS洗涤3次，胰酶消化并以12 000×g离心5 min，PBS洗涤细胞，向200 μl细胞悬液中加入100 μl Calcein-AM荧光探针染液，充分混匀后在37°C水浴锅中避光孵育30 min。荧光显微镜下观察并拍照。使用Image J Program软件计算各组荧光强度。
酶链免疫检测仪检测各组细胞ROS、MDA、GSH/GSSG含量。ROS含量检测：将细胞以1×106个/ml的密度接种于6孔板中，每孔滴加1 ml DCFH-DA荧光探针溶液，37℃避光孵育30 min，以12 000×g离心5 min，PBS洗涤2次，采用荧光酶链免疫检测仪检测波长488 nm处的A值。MDA含量检测：将细胞以5×104个/ml的密度接种于6孔板中，95℃水浴锅孵育40 min，以12 000×g离心10 min，每孔滴加250 μl提前配制的标准品和MDA工作液。采用酶链免疫检测仪测量波长532 nm处的A值。GSH/GSSG含量检测：将细胞以1×105个/ml密度接种于6孔板中，每100 μl待测细胞中滴加20 μl的标准品和GSH试剂，95℃水浴锅孵育40 min，以4 000×g离心10 min。采用酶链免疫检测仪测量波长405 nm处的A值。根据标准品的A值作出标准曲线后，样品对照标准曲线计算出GSH和GSSG的含量。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测各组细胞GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量。收集各组细胞总蛋白，调整蛋白浓度，每个样品中加入40 μg待测样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳；80 V恒压0.5 h，样品进入分离胶后120 V恒压2 h，300 mA转膜2 h，5%脱脂牛奶常温封闭1 h，一抗GPX4、SLC7A11、β-actin（1∶1 000）4℃过夜孵育（β-actin作为阳性对照），TBST洗膜5 min，重复3次；加入辣根过氧化物偶联的二抗（1∶5 000），37℃孵育2 h，TBST洗膜5 min，重复4次；加入化学发光剂，暗室显影成像。采用Image J Program软件分析蛋白条带灰度值，以目的条带与β-actin条带的比值代表蛋白的相对表达水平。
1.3 统计学方法
采用Graphpad prism 10.3软件进行统计分析和图表整理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用双尾Student t检验；多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DFX改善高糖诱导的HREC细胞增殖活力
细胞培养24 h后，NG组细胞呈梭形，分布均匀，贴壁良好；HG组细胞贴壁不佳，部分细胞呈圆形漂浮于培养基中；NG+DFX组细胞生长情况良好，细胞状态接近NG组；HG+DFX组大部分细胞贴壁生长，少量细胞呈圆形漂浮于培养基中；NG+DFX+FAC组细胞贴壁不佳，较多细胞呈圆形漂浮于培养基中；HG+DFX+FAC组少许细胞贴壁，大量细胞呈圆形漂浮于培养基中。6组间细胞增殖率比较，差异有统计学意义（F=150.70，P＜0.000 1）。组间细胞增殖率两两比较，HG组较NG组显著降低，HG+DFX组较HG组显著升高，NG+DFX+FAC组较NG+DFX组显著降低，HG+DFX+FAC组较HG+DFX组显著降低，差异均有统计学意义（t=19.01、8.49、13.23、10.74，P＜0.000 1）（图1）。
图1
DFX改善高糖诱导的HREC细胞增殖（n=3） 1A～1F分别示NG组、HG组、NG+DFX组、HG+DFX组、NG+DFX+FAC组和HG+DFX+FAC组HREC光学显微镜像（标尺：50 μm）。与NG组比较，HG组细胞贴壁不佳，部分细胞呈圆形漂浮于培养基中；加入DFX后细胞贴壁情况改善，浮游细胞减少，加入FAC则可逆转DFX对HREC的保护作用。1G示6组细胞增殖率比较，****P＜0.000 1 HREC：人视网膜血管内皮细胞；NG：正常糖；HG：高糖；DFX：地拉罗司；FAC：柠檬酸铁胺；NG组：加入5.5 mmol/L葡萄糖培养细胞；HG组：加入25 mmol/L葡萄糖培养细胞；NG+DFX组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；HG+DFX组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；NG+DFX+FAC组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞；HG+DFX+ FAC组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞
2.2 DFX抑制HREC铁过载
平均荧光强度与细胞内LIP含量成反比。荧光显微镜观察发现，HG组、NG+DFX+FAC组、HG+DFX+FAC组荧光强度显著下降，LIP含量上升；HG+DFX组荧光强度显著增强，LIP含量下降。各组细胞间荧光强度比较，差异有统计学意义（F=807.20，P＜0.001）。组间荧光强度两两比较，HG组较NG组显著降低，HG+DFX组较HG组显著升高，NG+DFX+FAC组较NG+DFX组显著降低，HG+DFX+FAC组较HG+DFX组显著降低，差异均有统计学意义（t=34.96、18.95、37.52、28.10，P＜0.001）（图2）。
图2
DFX抑制HREC中LIP含量（n=3） 2A～2F分别示NG组、HG组、NG+DFX组、HG+DFX组、NG+DFX+FAC组和HG+DFX+FAC组HREC荧光显微镜像（标尺：20 μm）。与NG组比较，HG组荧光强度显著下降，LIP含量上升；加入DFX后荧光强度显著增强，LIP含量下降，加入FAC则可逆转DFX的铁螯合作用。2G示6组细胞荧光强度比较，***P＜0.001 HREC：人视网膜血管内皮细胞；NG：正常糖；HG：高糖；DFX：地拉罗司；FAC：柠檬酸铁胺；LIP：不稳定铁池；NG组：加入5.5 mmol/L葡萄糖培养细胞；HG组：加入25 mmol/L葡萄糖培养细胞；NG+DFX组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；HG+DFX组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；NG+DFX+FAC组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞；HG+DFX+ FAC组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞
2.3 DFX抑制HREC中ROS生成
DCFH-DA检测结果显示，各组细胞间ROS水平差异有统计学意义（F=16.94，P＜0.001）。组间ROS含量两两比较，HG组较NG组显著升高，HG+DFX组较HG组显著降低，NG+DFX+FAC组较NG+DFX组显著升高，HG+DFX+FAC组较HG+DFX组显著升高，差异均有统计学意义（t=5.38、3.66、4.24、5.07，P＜0.01、0.05、0.05、0.01）（图3）。
图3
各组HREC中活性氧含量比较（n=3） *P＜0.05，**P＜0.01 HREC：人视网膜血管内皮细胞；NG：正常糖；HG：高糖；DFX：地拉罗司；FAC：柠檬酸铁胺；NG组：加入5.5 mmol/L葡萄糖培养细胞；HG组：加入25 mmol/L葡萄糖培养细胞；NG+DFX组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；HG+DFX组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；NG+DFX+FAC组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞；HG+DFX+ FAC组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞
2.4 DFX抑制HREC脂质过氧化
各组细胞间MDA、GSH、GSSG含量比较，差异均有统计学意义（F=31.62、21.02、19.21，P＜0.001、0.001、0.000 1）（图4）。组间MDA、GSSG含量两两比较，HG组较NG组显著升高，HG+DFX组较HG组显著降低，NG+DFX+FAC组较NG+DFX组显著升高，HG+DFX+FAC组较HG+DFX组显著升高，差异均有统计学意义（MDA：t=7.38、3.67、6.45、5.93，P＜0.001、0.05、0.001、0.01；GSSG：t=6.00、3.68、4.37、4.90，P＜0.001、0.05、0.05、0.01）。组间GSH两两比较，HG组较NG组显著降低，HG+DFX组较HG组显著升高，NG+DFX+FAC组较NG+DFX组显著降低，HG+DFX+FAC组较HG+DFX组显著降低，差异均有统计学意义（t=6.84、4.65、4.08、5.50，P＜0.001、0.01、0.05、0.01）。
图4
各组HREC中MDA、GSH、GSSG含量比较（n=3） 4A～ 4C分别示MDA、GSH、GSSG含量，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 HREC：人视网膜血管内皮细胞；MDA：脂质过氧化物丙二醛；GSH：谷胱甘肽；GSSG：氧化型GSH；NG：正常糖；HG：高糖；DFX：地拉罗司；FAC：柠檬酸铁胺；NG组：加入5.5 mmol/L葡萄糖培养细胞；HG组：加入25 mmol/L葡萄糖培养细胞；NG+DFX组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；HG+DFX组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；NG+DFX+FAC组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞；HG+DFX+ FAC组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞
2.5 DFX减轻HREC XC-抑制
Western blot检测结果显示，各组细胞中GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（F=26.09、52.62，P＜0.001）。组间GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量两两比较，HG组较NG组显著降低，HG+DFX组较HG组显著升高，NG+DFX+FAC组较NG+DFX组显著降低，HG+DFX+FAC组较HG+DFX组显著降低，差异均有统计学意义（t=6.08、3.75、6.00、6.07、9.45、4.08、9.16、6.34，P＜0.001、0.05、0.001、0.001）（图5）。
图5
各组HREC中GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量比较（n=3） 5A示GPX4、SLC7A11蛋白表达电泳图。5B示GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量比较，*P＜0.05，***P＜0.001 HREC：人视网膜血管内皮细胞；NG：正常糖；HG：高糖；DFX：地拉罗司；FAC：柠檬酸铁胺；GPX4：谷胱甘肽过氧化物酶4；SLC7A11：溶质载体家族7成员11；NG组：加入5.5 mmol/L葡萄糖培养细胞；HG组：加入25 mmol/L葡萄糖培养细胞；NG+DFX组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；HG+DFX组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX培养细胞；NG+DFX+FAC组：加入5.5 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞；HG+DFX+ FAC组：加入25 mmol/L葡萄糖、50 μmol/L DFX、100 μmol/L FAC培养细胞
3 讨论
长期高血糖是视网膜损伤的危险因素，视网膜血管屏障损伤是高糖致视网膜变性的关键事件[11]。各种细胞死亡模式，包括凋亡、坏死、铁死亡和自噬，都会导致视网膜血管内皮细胞的损伤[12]。铁死亡在DR中的作用尚不明确。研究表明，高糖在体外诱导视网膜血管内皮细胞发生铁死亡，提示铁死亡发生在视网膜细胞中[13]。本研究旨在探讨铁螯合剂DFX对高糖诱导的HREC铁死亡的保护作用及其机制，为DR的治疗提供新的思路。
本研究发现，高糖干预导致HREC中铁过载，ROS水平及MDA、GSSG含量上升，GSH含量、GSH/GSSG比值降低，且铁死亡关键蛋白GPX4和SLC7A11表达降低，表明视网膜血管内皮细胞发生了铁死亡。在生物化学过程中，Fe2+通过芬顿反应生成大量ROS，导致细胞内GSH大量消耗，引起半胱氨酸缺乏，GPX4失活，无法有效还原异常脂质过氧化物，从而产生MDA，进一步破坏细胞结构[14]。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，是机体最重要的抗氧化物质之一。其中，约90%～95%以GSH的形式存在，而5%～10%以GSSG的形式存在[15]。GPX4是细胞抵御脂质过氧化的重要物质，GPX家族成员使用GSH作为辅助因子，将脂质过氧化物解毒为脂质醇，从而抑制铁死亡[16]。XC-系统在细胞内半胱氨酸平衡和GSH生物合成中起着重要作用，SLC7A11是XC-系统的一个重要亚基，其在细胞中过表达可以促进GSH合成从而阻断铁死亡[17]。目前，在高糖环境下检测药物对铁死亡影响的研究较少。本研究首次探索铁螯合剂在高糖诱导的HREC铁死亡中的作用。DFX是一种对Fe3+具有高亲和力的三齿螯合剂，以2∶1的比例与铁结合形成复合物。2005年，美国食品药品监督管理局批准DFX用于治疗由输血引起的铁负荷增加[18]。本研究发现，高糖环境下细胞发生了铁过载，而DFX通过螯合细胞内不稳定Fe2+，减轻细胞中的氧化应激，显著降低了脂质过氧化产物MDA含量，提高了GSH含量，并增加了GPX4和SLC7A11蛋白的表达水平。GPX4在将脂质过氧化氢还原为相应的醇形式中发挥独特的作用，从而中断铁催化的脂质过氧化[19]。GSH是GPX4激活的重要辅助因子。因此，GPX4的上调可能与SLC7A11基因上调和细胞内GSH的增加有关。然而，DFX影响SLC7A11基因表达的具体机制仍有待进一步研究。
本研究发现，铁螯合剂DFX在高糖环境下能够有效抑制HREC的铁死亡，通过螯合细胞内不稳定的Fe2+，减轻氧化应激，提高GSH含量，增加GPX4和SLC7A11蛋白的表达水平，从而保护细胞免受损伤。这些结果表明，铁螯合剂可能成为DR治疗的新方法。然而，本研究也存在一些局限性。首先，实验仅在体外细胞模型中进行，未能充分反映体内复杂的病理生理环境；其次，本研究虽揭示了DFX具有铁螯合作用，但未深入研究其分子机制以及对铁代谢的干扰。未来的研究应进一步探索DFX在动物模型中的作用及其安全性，以验证其在体内环境中的疗效和潜在副作用。此外，还需要深入研究DFX影响SLC7A11基因表达的具体机制，为开发针对铁死亡的新型治疗策略提供理论依据。通过这些研究，有望为DR的临床治疗提供新的药物选择和科学支持。
