引用本文： 潘奕吉, 杨家翼, 邢怡桥, 贺涛. S100A4过表达对视网膜缺血再灌注损伤小鼠视网膜毛细血管细胞和神经节细胞的影响. 中华眼底病杂志, 2024, 40(4): 296-302. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20230803-00333 复制
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视网膜作为中枢神经系统（CNS）的一部分，通过神经元、血管细胞（内皮细胞和周细胞）和神经胶质细胞的相互作用形成神经血管单元（NVU），保持内环境的稳态和视网膜细胞的功能[1]。其中，周细胞和内皮细胞在毛细血管生成发育、血脑屏障完整性和血流调节中起关键作用[2]。缺血再灌注（IR）是机体常见病理过程，多见于脑卒中、心肌梗死、视网膜血管阻塞和急性闭角型青光眼等[3]。文献报道，脑卒中血管再通后微循环不能完全灌注，即再灌注无复流[4]。内皮细胞作为组成微血管的主要细胞，既往认为其在IR后出现收缩和肿胀导致微血管管腔狭窄从而介导再灌注无复流[5]。然而近年发现周细胞才是调控微血管管径和再灌注无复流现象的主要参与者[6]。在小鼠脑IR模型上观察到氧化-硝化应激导致周细胞收缩和死亡，即使血流再通后周细胞还是维持收缩状态，导致微血管管腔持续狭窄闭塞，从而阻碍微循环[7-8]。视网膜IR损伤（RIRI）的病理生理过程与脑卒中相似，除氧化应激和炎性反应外，持续的再灌注无复流使得血液供应减少导致的神经元细胞损伤可能是IR引起的视网膜损伤进展的重要原因[5]。然而在RIRI中，对内皮细胞和周细胞的偏重影响仍存在争议，内皮细胞、周细胞和视网膜神经节细胞（RGC）作为整体对RIRI的同步反应尚未明确。S100A4为钙结合蛋白S100家族成员，具有广泛的生物学功能，其在炎症部位释放并参与调节细胞骨架动力学和形态，促进血管生成、细胞存活、运动和肿瘤侵袭[9-10]。近年研究发现，周细胞在青光眼应激期间以钙依赖方式收缩毛细血管，导致血液供应减少并损害RGC功能[11]。既往研究已证实S100A4具有神经保护作用，且在RIRI模型中过表达可以保护RGC，减少细胞凋亡，维持视网膜的生理功能[12]。但S100A4的神经保护作用仍需要进一步探索。基于良好的微循环灌注对NVU的重要作用，本研究采用高眼压法建立大鼠RIRI模型，初步探究S100A4对血管神经的保护作用及潜在分子机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
雄性C57BL/6J小鼠100只，6周龄，体重20～25 g，无特定病原体级，由武汉大学实验动物中心提供。饲养于标准（12 h明/暗循环）清洁级环境中。饲养环境及实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》规定，并获得武汉大学实验动物伦理委员会许可（许可证号：SYXK鄂2015-0027）。过表达S100A4重组腺相关病毒2（AAV2）载体绿色荧光蛋白（GFP）（AAV2-S100A4-GFP）、仅携带GFP的空白AAV2载体（AAV2-GFP）（武汉BrainVTA有限公司），病毒滴度均＞1.0×1012 vg/ml。
抗NG2抗体（美国Sigma公司）；抗IB4抗体（赛默飞世尔科技公司）；抗Brn3a抗体（德国 Synaptic Systems公司）；抗Toll-样受体4（TLR4）、抗p38丝裂原活化蛋白激酶（p38）抗体（美国CST公司）；抗核因子E2相关因子2（NRF2）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）二抗、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、抗荧光淬灭剂（武汉塞维尔生物科技有限公司）； AlexaFluor 594 IgG（美国Jackson公司），AlexaFluor 647（安特捷生物技术有限公司）；激光扫描共聚焦显微镜FV1200、正置荧光显微镜BX51、倒置显微镜IX71（日本Olympus公司）。
1.2 实验动物分组和RIRI模型建立
采用随机数字表法将小鼠分为正常对照组（C组）、RIRI模型组（RIRI组）、玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP组（S组）、RIRI+玻璃体腔注射AAV2-GFP组（GIR组）、RIRI+玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP组（SIR组），每组各20只，以单眼为实验眼。
小鼠6周龄时，S组、SIR组小鼠双眼角巩膜缘下2.0 mm处应用玻璃体腔全自动显微注射仪分别行玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP病毒载体1 μl，病毒滴度为5.0×1012 μg/ml；GIR组小鼠玻璃体腔注射同样滴度的等量AAV2-GFP。
病毒转染后4周，参照文献[12]的方法建立RIRI模型。RIRI组、GIR、SIR组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，复方托吡卡胺充分散瞳。30G针头刺入前房并固定，生理盐水液面与大鼠角膜顶点垂直距离约150 cm，此时可见大鼠角膜水肿，虹膜变白；直接检眼镜检查可见视盘苍白，视网膜血流中断。维持前房加压60 min后，可见眼底视网膜血流恢复，建模成功。C组、S组不作RIRI处理。眼部操作结束后给予氧氟沙星眼膏涂眼以防感染。
1.3 视网膜消化铺片、高碘酸-雪夫（PAS）、苏木精-伊红（HE）染色计数视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞
建模后3 d，随机选取RIRI组、GIR、SIR组小鼠各4～5只，颈椎脱臼法处死并摘除眼球，4 ℃条件下4%多聚甲醛固定12 h。手术显微镜下去除角膜、虹膜、玻璃体，完整分离出视网膜。各组视网膜加入适当消化液，37 ℃恒温震荡摇床消化2 h，将其转移至蒸馏水，1 ml移液枪（胶头滴管）反复吹打，直至视网膜完全清透，仅存网状结构，平铺于载玻片上烘干。PAS、HE染色。视网膜毛细血管基底膜糖蛋白被PAS染成粉红色，细胞核经苏木精染成深蓝色，其中颜色较淡的长椭圆形并延伸于毛细血管腔内的为内皮细胞核，颜色致密并突出于毛细血管壁外部的为周细胞核[13-14]。倒置显微镜下选取视网膜中周部范围，随机选择4个视野，使用Image J软件计数各组小鼠视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞数量，计算其比值。
1.4 激光共聚焦显微镜观察病毒转染情况
玻璃体腔注射后4周，随机选取C组、S组小鼠各3只，颈椎脱臼处死摘除眼球，固定脱水后将视网膜包埋于OCT胶中，冰切机经视神经出口处作矢状切片，厚度14 μm。另将视网膜剪切成“四叶草”形状，含5%牛血清白蛋白和0.3% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）于室温封闭2 h，抗GFP抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，10 min/次。加入二抗AlexaFluor 488免疫球蛋白G（1∶500）室温孵育 2 h，PBS洗涤3次，10 min/次，抗荧光淬灭剂封片。激光共聚焦显微镜观察病毒转染情况。
1.5 免疫荧光染色观察内皮细胞、周细胞、RGC变化
建模后3 d，随机选取C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组小鼠各3只，颈椎脱臼法处死并摘除眼球，4%多聚甲醛室温固定1 h，于含有5%牛血清白蛋白和0.5%TritonX-100的溶液中4 °C封闭过夜，用抗IB4抗体标记血管内皮细胞，抗NG2抗体标记周细胞，抗Brn3a抗体标记RGC，将视网膜剪切成“四叶草”形状并用抗荧光淬灭剂封片，用荧光显微镜观察和拍摄。以视盘为中心，每个瓣膜为一象限，每个象限距视盘半径处平等划分为中央、中间及外周3个区域，在每个视网膜瓣的中间区域随机选取视野，于荧光显微镜下按序拍摄。各组的内皮细胞或周细胞覆盖面积与C组作比较来表示它们的覆盖率，使用Image J软件及AngioTool软件计算内皮细胞、周细胞覆盖率。
1.6 蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测小鼠视网膜中TLR4、p38、NRF2蛋白相对表达量
建模后3 d，随机选取C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组小鼠各4只，颈椎脱臼法处死并摘除眼球，提取视网膜总蛋白，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭后，TLR4抗体（1∶1 000）、抗p38抗体（1∶1 000）、抗NRF2抗体（1∶500）、抗GAPDH抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。室温下加入二抗HRP（1∶8 000）孵育，化学发光底物试剂盒制备免疫反应条带，使用分析软件Image J对灰度值进行分析，以GAPDH作为内参照评估目的蛋白的相对表达量。
1.7 统计学方法
采用Graphpad Prism 9.0软件行统计学分析。定量数据以均数±标准差（x±s）表示。多组间数据比较采用单因素方差分析；组间两两比较采用Bonferroni校正检验水准。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病毒成功转染至视网膜
荧光显微镜观察发现，C组小鼠视网膜各层未见绿色荧光表达；S组小鼠视网膜各层可见强绿色荧光表达（图1）。
图1
S组小鼠视网膜组织荧光显微镜像（标尺：200 μm）
1A、1B分别示视网膜铺片、视网膜切面，视网膜各层可见强绿色荧光表达 S组：玻璃体腔注射腺相关病毒2-S100A4-绿色荧光蛋白
2.2 过表达S100A4减少周细胞丢失
建模后3 d，C组、S组、SIR组、RIRI组、GIR组小鼠视网膜毛细血管内皮细胞与周细胞比值分别为2.07±0.08、2.20±0.01、2.05±0.03、3.47±0.12、3.43±0.06。C组内皮细胞与周细胞比值与S组、SIR组比较，差异均无统计学意义（F=106.30，P＞0.05）（图2）；SIR组与RIRI组、GIR组比较，差异均有统计学意义（F=106.30，P＜0.000 1）。
图2
各组小鼠视网膜脉管系统
2A～2E分别示C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组毛细血管网光学显微镜像（标尺：20 μm），黑箭头示内皮细胞，黑箭示周细胞。2F示各组视网膜毛细血管内皮细胞与周细胞比值比较（
建模后3 d，C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组小鼠视网膜毛细血管内皮细胞覆盖率分别为（99.67±1.09）%、（90.07±1.06）%、（95.27±2.07）%、（90.95±1.19）%、（92.78± 0.70）%；组间比较，差异均无统计学意义（F=3.44，P＞0.05）。周细胞覆盖率分别为（100.00±1.62）%、（57.50±1.48）%、（89.98±2.09）%、（62.82±0.62）%、（87.58±4.19）%。与C组周细胞覆盖率比较，SIR组、S组差异均无统计学意义（F=62.69，P＞0.05），RIRI组、GIR组差异均有统计学意义（F=62.69，P＜0.001）（图3，4）。
图3
各组小鼠视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞荧光显微镜像（标尺：20 μm）
3A～3E、3F～3H分别示C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组内皮细胞、周细胞，IB4标记的内皮细胞呈红色荧光，NG2标记的周细胞呈黄色荧光 RIRI：视网膜缺血再灌注损伤；GFP：绿色荧光蛋白；AAV：腺相关病毒；C组：正常对照组；S组：玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP组；GIR组：RIRI+玻璃体腔注射AAV2-GFP组；SIR组：RIRI+玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP组
图4
各组大鼠视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞覆盖率比较（n=3）
4A、4B分别示内皮细胞、周细胞覆盖率 RIRI：视网膜缺血再灌注损伤；GFP：绿色荧光蛋白；AAV：腺相关病毒；C组：正常对照组；S组：玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP组；GIR组：RIRI+玻璃体腔注射AAV2-GFP组；SIR组：RIRI+玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP组；***
2.3 过表达S100A4降低RIRI对RGC的影响
建模后3 d，C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组小鼠RGC存活率分别为（100.00±3.63）%、（42.80±1.06）%、（96.72±1.40）%、（43.35±1.39）%、（71.09±1.56）%。与C组比较，RIRI组、GIR组RGC存活率明显降低，差异有统计学意义（F=171.60，P＜0.000 1）；与RIRI组、GIR组比较，SIR组RGC存活率明显增高，差异有统计学意义（F=171.60，P＜0.000 1）（图5）。
图5
各组小鼠RGC存活情况
5A～5E分别示C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组RGC荧光显微镜像（标尺：20 μm），Brn3a标记的RGC呈红色荧光。5F示各组RGC存活率比较（
Western blot检测结果显示，C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组小鼠视网膜中TLR4、p38、NRF2蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1，图6）。
表1
各组小鼠视网膜中TLR4、p38、NRF2蛋白相对表达量比较（x±s）
图6
各组小鼠视网膜中TLR4、p38、NRF2蛋白表达情况
6A示电泳图；6B示各组视网膜组织中TLR4、p38、NRF2蛋白相对表达量比较（
3 讨论
在CNS中，为满足神经元的高代谢需求，各个NVU组分之间维持着高效通讯，因此组成NVU的各个细胞对缺血缺氧十分敏感。为了响应于身体或精神活动的强化，神经元活动显著增强的同时伴随着NVU的功能性充血，即神经血管耦联[15]。视网膜内皮细胞与周细胞的比例在健康条件下是恒定的，在CNS中，内皮细胞和周细胞共同形成物理和化学屏障以维持神经稳态[16]。既往研究表明，内皮细胞和周细胞比例以及被周细胞覆盖的血管壁表面积决定了毛细血管的相对渗透性[17]。周细胞功能障碍或缺乏会导致血视网膜屏障通透性增加。RGC作为视网膜NVU的核心，既往在RIRI模型发现RGC损伤先于毛细血管变性[5]。然而神经元细胞和血管细胞（内皮细胞和周细胞）对RIRI的易感性差异可能导致神经元和毛细血管退行性变之间的进展速度不同。因此从整体观念出发，我们打算探究过表达S100A4对IR后的视网膜脉管内皮细胞和周细胞比例的影响。
本研究建立RIRI模型，观察视网膜血管细胞（内皮细胞和周细胞）和RGC变化，并初步探索S100A4蛋白的神经血管保护作用和相关机制。结果显示，建模后3 d，视网膜周细胞和RGC显著丢失，内皮细胞变化不明显。既往研究认为，成熟视网膜脉管系统的退化通常是由周细胞损失和其后内皮细胞退化引起[18]。本研究结果与既往研究结论相似。在RIRI模型中周细胞丢失后造成神经血管耦联并导致血视网膜屏障通透性增加，进而损害RGC[19-20]，而神经元细胞的损伤往往早于毛细血管内皮细胞变性[5]。周细胞位于NVU中心，含有收缩蛋白，能够对神经元的刺激作出快速反应以调节微循环血流和神经血管耦合[11]。因此，除氧化应激和炎症之外，周细胞损失也共同参与了血管功能缺陷，而视网膜内皮的功能障碍在早期不影响RGC的存活[21]。
既往研究发现，周细胞通过响应细胞内Ca2+浓度变化而收缩毛细血管，导致血液供应减少并损害神经元，在大脑IR模型和视网膜高眼压模型特异性阻断周细胞内Ca2+流入可挽救神经血管耦合并促进神经元存活[11, 22]。在心脏IR模型中，使用腺苷和钙离子受体阻滞剂可使周细胞松弛，增加周细胞收缩部位毛细血管缺血后直径并减少缺血后上游动脉再灌注时阻塞的毛细血管百分比[23]。总之，这些研究结果表明，Ca2+稳态丧失引起的周细胞病理变化在导致RGC功能障碍和微循环血流不足中发挥关键作用。
S100A4是一种钙结合蛋白，是体外海马神经元神经突生长的有效促进剂和原代神经元的神经保护剂，能够影响细胞内Ca2+浓度，从而调节神经元分化[24]。有研究表明，该蛋白的过表达可通过诱导丝体拆卸抑制非肌肉肌球蛋白ⅡA活性，有效降低细胞收缩力[25]。S100A4的信号传导尚未得到很好表征。已有研究表明，S100A4通过TLR4-细胞外信号调节激酶1/2信号传导保护髓源性抑制细胞免于内源性凋亡，TLR4激活还导致缺血性脑卒中p38的表达升高[26]。NRF2是一种负责细胞防御氧化应激的转录因子，也有助于TLR4介导的先天免疫应答[27]。在胶质母细胞瘤中高迁移率族蛋白B1通过激活TLR4/p38/NRF2炎症通路促进肿瘤细胞上皮间质转化和侵袭[28]。滨蒿酮通过抑制活性氧/p38/NRF2通路来改善小鼠中非酒精性脂肪性肝炎相关炎症[29]。本研究结果表明，过表达S100A4通过抑制TLR4/p38/ NRF2通路减轻RIRI引起的视网膜损伤。此外，此前在相同模型中还证实了过表达S100A4通过上调磷酸化蛋白激酶B和下调B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白的表达发挥神经保护作用，表明S100A4可能作用于多种通路发挥作用[12]。S100A4在细胞内外都可发挥不同的作用，因此其具体的机制未来还需要进一步探索。同样的，NVU概念作为近年来神经系统的热点，通过强调内皮细胞、神经胶质细胞、周细胞和神经元之间细胞间相互作用的共生性质以及细胞外基质成分的贡献，增加了对神经系统疾病的理解。本次研究对象主要为血管细胞和RGC，而小胶质细胞作为与炎症相关的主要细胞，在视网膜缺血相关疾病所发挥的作用仍未知晓，未来我们将进一步探索。
视网膜作为中枢神经系统（CNS）的一部分，通过神经元、血管细胞（内皮细胞和周细胞）和神经胶质细胞的相互作用形成神经血管单元（NVU），保持内环境的稳态和视网膜细胞的功能[1]。其中，周细胞和内皮细胞在毛细血管生成发育、血脑屏障完整性和血流调节中起关键作用[2]。缺血再灌注（IR）是机体常见病理过程，多见于脑卒中、心肌梗死、视网膜血管阻塞和急性闭角型青光眼等[3]。文献报道，脑卒中血管再通后微循环不能完全灌注，即再灌注无复流[4]。内皮细胞作为组成微血管的主要细胞，既往认为其在IR后出现收缩和肿胀导致微血管管腔狭窄从而介导再灌注无复流[5]。然而近年发现周细胞才是调控微血管管径和再灌注无复流现象的主要参与者[6]。在小鼠脑IR模型上观察到氧化-硝化应激导致周细胞收缩和死亡，即使血流再通后周细胞还是维持收缩状态，导致微血管管腔持续狭窄闭塞，从而阻碍微循环[7-8]。视网膜IR损伤（RIRI）的病理生理过程与脑卒中相似，除氧化应激和炎性反应外，持续的再灌注无复流使得血液供应减少导致的神经元细胞损伤可能是IR引起的视网膜损伤进展的重要原因[5]。然而在RIRI中，对内皮细胞和周细胞的偏重影响仍存在争议，内皮细胞、周细胞和视网膜神经节细胞（RGC）作为整体对RIRI的同步反应尚未明确。S100A4为钙结合蛋白S100家族成员，具有广泛的生物学功能，其在炎症部位释放并参与调节细胞骨架动力学和形态，促进血管生成、细胞存活、运动和肿瘤侵袭[9-10]。近年研究发现，周细胞在青光眼应激期间以钙依赖方式收缩毛细血管，导致血液供应减少并损害RGC功能[11]。既往研究已证实S100A4具有神经保护作用，且在RIRI模型中过表达可以保护RGC，减少细胞凋亡，维持视网膜的生理功能[12]。但S100A4的神经保护作用仍需要进一步探索。基于良好的微循环灌注对NVU的重要作用，本研究采用高眼压法建立大鼠RIRI模型，初步探究S100A4对血管神经的保护作用及潜在分子机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
雄性C57BL/6J小鼠100只，6周龄，体重20～25 g，无特定病原体级，由武汉大学实验动物中心提供。饲养于标准（12 h明/暗循环）清洁级环境中。饲养环境及实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》规定，并获得武汉大学实验动物伦理委员会许可（许可证号：SYXK鄂2015-0027）。过表达S100A4重组腺相关病毒2（AAV2）载体绿色荧光蛋白（GFP）（AAV2-S100A4-GFP）、仅携带GFP的空白AAV2载体（AAV2-GFP）（武汉BrainVTA有限公司），病毒滴度均＞1.0×1012 vg/ml。
抗NG2抗体（美国Sigma公司）；抗IB4抗体（赛默飞世尔科技公司）；抗Brn3a抗体（德国 Synaptic Systems公司）；抗Toll-样受体4（TLR4）、抗p38丝裂原活化蛋白激酶（p38）抗体（美国CST公司）；抗核因子E2相关因子2（NRF2）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）二抗、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、抗荧光淬灭剂（武汉塞维尔生物科技有限公司）； AlexaFluor 594 IgG（美国Jackson公司），AlexaFluor 647（安特捷生物技术有限公司）；激光扫描共聚焦显微镜FV1200、正置荧光显微镜BX51、倒置显微镜IX71（日本Olympus公司）。
1.2 实验动物分组和RIRI模型建立
采用随机数字表法将小鼠分为正常对照组（C组）、RIRI模型组（RIRI组）、玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP组（S组）、RIRI+玻璃体腔注射AAV2-GFP组（GIR组）、RIRI+玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP组（SIR组），每组各20只，以单眼为实验眼。
小鼠6周龄时，S组、SIR组小鼠双眼角巩膜缘下2.0 mm处应用玻璃体腔全自动显微注射仪分别行玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP病毒载体1 μl，病毒滴度为5.0×1012 μg/ml；GIR组小鼠玻璃体腔注射同样滴度的等量AAV2-GFP。
病毒转染后4周，参照文献[12]的方法建立RIRI模型。RIRI组、GIR、SIR组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，复方托吡卡胺充分散瞳。30G针头刺入前房并固定，生理盐水液面与大鼠角膜顶点垂直距离约150 cm，此时可见大鼠角膜水肿，虹膜变白；直接检眼镜检查可见视盘苍白，视网膜血流中断。维持前房加压60 min后，可见眼底视网膜血流恢复，建模成功。C组、S组不作RIRI处理。眼部操作结束后给予氧氟沙星眼膏涂眼以防感染。
1.3 视网膜消化铺片、高碘酸-雪夫（PAS）、苏木精-伊红（HE）染色计数视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞
建模后3 d，随机选取RIRI组、GIR、SIR组小鼠各4～5只，颈椎脱臼法处死并摘除眼球，4 ℃条件下4%多聚甲醛固定12 h。手术显微镜下去除角膜、虹膜、玻璃体，完整分离出视网膜。各组视网膜加入适当消化液，37 ℃恒温震荡摇床消化2 h，将其转移至蒸馏水，1 ml移液枪（胶头滴管）反复吹打，直至视网膜完全清透，仅存网状结构，平铺于载玻片上烘干。PAS、HE染色。视网膜毛细血管基底膜糖蛋白被PAS染成粉红色，细胞核经苏木精染成深蓝色，其中颜色较淡的长椭圆形并延伸于毛细血管腔内的为内皮细胞核，颜色致密并突出于毛细血管壁外部的为周细胞核[13-14]。倒置显微镜下选取视网膜中周部范围，随机选择4个视野，使用Image J软件计数各组小鼠视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞数量，计算其比值。
1.4 激光共聚焦显微镜观察病毒转染情况
玻璃体腔注射后4周，随机选取C组、S组小鼠各3只，颈椎脱臼处死摘除眼球，固定脱水后将视网膜包埋于OCT胶中，冰切机经视神经出口处作矢状切片，厚度14 μm。另将视网膜剪切成“四叶草”形状，含5%牛血清白蛋白和0.3% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）于室温封闭2 h，抗GFP抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，10 min/次。加入二抗AlexaFluor 488免疫球蛋白G（1∶500）室温孵育 2 h，PBS洗涤3次，10 min/次，抗荧光淬灭剂封片。激光共聚焦显微镜观察病毒转染情况。
1.5 免疫荧光染色观察内皮细胞、周细胞、RGC变化
建模后3 d，随机选取C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组小鼠各3只，颈椎脱臼法处死并摘除眼球，4%多聚甲醛室温固定1 h，于含有5%牛血清白蛋白和0.5%TritonX-100的溶液中4 °C封闭过夜，用抗IB4抗体标记血管内皮细胞，抗NG2抗体标记周细胞，抗Brn3a抗体标记RGC，将视网膜剪切成“四叶草”形状并用抗荧光淬灭剂封片，用荧光显微镜观察和拍摄。以视盘为中心，每个瓣膜为一象限，每个象限距视盘半径处平等划分为中央、中间及外周3个区域，在每个视网膜瓣的中间区域随机选取视野，于荧光显微镜下按序拍摄。各组的内皮细胞或周细胞覆盖面积与C组作比较来表示它们的覆盖率，使用Image J软件及AngioTool软件计算内皮细胞、周细胞覆盖率。
1.6 蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测小鼠视网膜中TLR4、p38、NRF2蛋白相对表达量
建模后3 d，随机选取C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组小鼠各4只，颈椎脱臼法处死并摘除眼球，提取视网膜总蛋白，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭后，TLR4抗体（1∶1 000）、抗p38抗体（1∶1 000）、抗NRF2抗体（1∶500）、抗GAPDH抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。室温下加入二抗HRP（1∶8 000）孵育，化学发光底物试剂盒制备免疫反应条带，使用分析软件Image J对灰度值进行分析，以GAPDH作为内参照评估目的蛋白的相对表达量。
1.7 统计学方法
采用Graphpad Prism 9.0软件行统计学分析。定量数据以均数±标准差（x±s）表示。多组间数据比较采用单因素方差分析；组间两两比较采用Bonferroni校正检验水准。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病毒成功转染至视网膜
荧光显微镜观察发现，C组小鼠视网膜各层未见绿色荧光表达；S组小鼠视网膜各层可见强绿色荧光表达（图1）。
图1
S组小鼠视网膜组织荧光显微镜像（标尺：200 μm）
1A、1B分别示视网膜铺片、视网膜切面，视网膜各层可见强绿色荧光表达 S组：玻璃体腔注射腺相关病毒2-S100A4-绿色荧光蛋白
2.2 过表达S100A4减少周细胞丢失
建模后3 d，C组、S组、SIR组、RIRI组、GIR组小鼠视网膜毛细血管内皮细胞与周细胞比值分别为2.07±0.08、2.20±0.01、2.05±0.03、3.47±0.12、3.43±0.06。C组内皮细胞与周细胞比值与S组、SIR组比较，差异均无统计学意义（F=106.30，P＞0.05）（图2）；SIR组与RIRI组、GIR组比较，差异均有统计学意义（F=106.30，P＜0.000 1）。
图2
各组小鼠视网膜脉管系统
2A～2E分别示C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组毛细血管网光学显微镜像（标尺：20 μm），黑箭头示内皮细胞，黑箭示周细胞。2F示各组视网膜毛细血管内皮细胞与周细胞比值比较（
建模后3 d，C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组小鼠视网膜毛细血管内皮细胞覆盖率分别为（99.67±1.09）%、（90.07±1.06）%、（95.27±2.07）%、（90.95±1.19）%、（92.78± 0.70）%；组间比较，差异均无统计学意义（F=3.44，P＞0.05）。周细胞覆盖率分别为（100.00±1.62）%、（57.50±1.48）%、（89.98±2.09）%、（62.82±0.62）%、（87.58±4.19）%。与C组周细胞覆盖率比较，SIR组、S组差异均无统计学意义（F=62.69，P＞0.05），RIRI组、GIR组差异均有统计学意义（F=62.69，P＜0.001）（图3，4）。
图3
各组小鼠视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞荧光显微镜像（标尺：20 μm）
3A～3E、3F～3H分别示C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组内皮细胞、周细胞，IB4标记的内皮细胞呈红色荧光，NG2标记的周细胞呈黄色荧光 RIRI：视网膜缺血再灌注损伤；GFP：绿色荧光蛋白；AAV：腺相关病毒；C组：正常对照组；S组：玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP组；GIR组：RIRI+玻璃体腔注射AAV2-GFP组；SIR组：RIRI+玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP组
图4
各组大鼠视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞覆盖率比较（n=3）
4A、4B分别示内皮细胞、周细胞覆盖率 RIRI：视网膜缺血再灌注损伤；GFP：绿色荧光蛋白；AAV：腺相关病毒；C组：正常对照组；S组：玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP组；GIR组：RIRI+玻璃体腔注射AAV2-GFP组；SIR组：RIRI+玻璃体腔注射AAV2-S100A4-GFP组；***
2.3 过表达S100A4降低RIRI对RGC的影响
建模后3 d，C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组小鼠RGC存活率分别为（100.00±3.63）%、（42.80±1.06）%、（96.72±1.40）%、（43.35±1.39）%、（71.09±1.56）%。与C组比较，RIRI组、GIR组RGC存活率明显降低，差异有统计学意义（F=171.60，P＜0.000 1）；与RIRI组、GIR组比较，SIR组RGC存活率明显增高，差异有统计学意义（F=171.60，P＜0.000 1）（图5）。
图5
各组小鼠RGC存活情况
5A～5E分别示C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组RGC荧光显微镜像（标尺：20 μm），Brn3a标记的RGC呈红色荧光。5F示各组RGC存活率比较（
Western blot检测结果显示，C组、RIRI组、S组、GIR组、SIR组小鼠视网膜中TLR4、p38、NRF2蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1，图6）。
表1
各组小鼠视网膜中TLR4、p38、NRF2蛋白相对表达量比较（x±s）
图6
各组小鼠视网膜中TLR4、p38、NRF2蛋白表达情况
6A示电泳图；6B示各组视网膜组织中TLR4、p38、NRF2蛋白相对表达量比较（
3 讨论
在CNS中，为满足神经元的高代谢需求，各个NVU组分之间维持着高效通讯，因此组成NVU的各个细胞对缺血缺氧十分敏感。为了响应于身体或精神活动的强化，神经元活动显著增强的同时伴随着NVU的功能性充血，即神经血管耦联[15]。视网膜内皮细胞与周细胞的比例在健康条件下是恒定的，在CNS中，内皮细胞和周细胞共同形成物理和化学屏障以维持神经稳态[16]。既往研究表明，内皮细胞和周细胞比例以及被周细胞覆盖的血管壁表面积决定了毛细血管的相对渗透性[17]。周细胞功能障碍或缺乏会导致血视网膜屏障通透性增加。RGC作为视网膜NVU的核心，既往在RIRI模型发现RGC损伤先于毛细血管变性[5]。然而神经元细胞和血管细胞（内皮细胞和周细胞）对RIRI的易感性差异可能导致神经元和毛细血管退行性变之间的进展速度不同。因此从整体观念出发，我们打算探究过表达S100A4对IR后的视网膜脉管内皮细胞和周细胞比例的影响。
本研究建立RIRI模型，观察视网膜血管细胞（内皮细胞和周细胞）和RGC变化，并初步探索S100A4蛋白的神经血管保护作用和相关机制。结果显示，建模后3 d，视网膜周细胞和RGC显著丢失，内皮细胞变化不明显。既往研究认为，成熟视网膜脉管系统的退化通常是由周细胞损失和其后内皮细胞退化引起[18]。本研究结果与既往研究结论相似。在RIRI模型中周细胞丢失后造成神经血管耦联并导致血视网膜屏障通透性增加，进而损害RGC[19-20]，而神经元细胞的损伤往往早于毛细血管内皮细胞变性[5]。周细胞位于NVU中心，含有收缩蛋白，能够对神经元的刺激作出快速反应以调节微循环血流和神经血管耦合[11]。因此，除氧化应激和炎症之外，周细胞损失也共同参与了血管功能缺陷，而视网膜内皮的功能障碍在早期不影响RGC的存活[21]。
既往研究发现，周细胞通过响应细胞内Ca2+浓度变化而收缩毛细血管，导致血液供应减少并损害神经元，在大脑IR模型和视网膜高眼压模型特异性阻断周细胞内Ca2+流入可挽救神经血管耦合并促进神经元存活[11, 22]。在心脏IR模型中，使用腺苷和钙离子受体阻滞剂可使周细胞松弛，增加周细胞收缩部位毛细血管缺血后直径并减少缺血后上游动脉再灌注时阻塞的毛细血管百分比[23]。总之，这些研究结果表明，Ca2+稳态丧失引起的周细胞病理变化在导致RGC功能障碍和微循环血流不足中发挥关键作用。
S100A4是一种钙结合蛋白，是体外海马神经元神经突生长的有效促进剂和原代神经元的神经保护剂，能够影响细胞内Ca2+浓度，从而调节神经元分化[24]。有研究表明，该蛋白的过表达可通过诱导丝体拆卸抑制非肌肉肌球蛋白ⅡA活性，有效降低细胞收缩力[25]。S100A4的信号传导尚未得到很好表征。已有研究表明，S100A4通过TLR4-细胞外信号调节激酶1/2信号传导保护髓源性抑制细胞免于内源性凋亡，TLR4激活还导致缺血性脑卒中p38的表达升高[26]。NRF2是一种负责细胞防御氧化应激的转录因子，也有助于TLR4介导的先天免疫应答[27]。在胶质母细胞瘤中高迁移率族蛋白B1通过激活TLR4/p38/NRF2炎症通路促进肿瘤细胞上皮间质转化和侵袭[28]。滨蒿酮通过抑制活性氧/p38/NRF2通路来改善小鼠中非酒精性脂肪性肝炎相关炎症[29]。本研究结果表明，过表达S100A4通过抑制TLR4/p38/ NRF2通路减轻RIRI引起的视网膜损伤。此外，此前在相同模型中还证实了过表达S100A4通过上调磷酸化蛋白激酶B和下调B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白的表达发挥神经保护作用，表明S100A4可能作用于多种通路发挥作用[12]。S100A4在细胞内外都可发挥不同的作用，因此其具体的机制未来还需要进一步探索。同样的，NVU概念作为近年来神经系统的热点，通过强调内皮细胞、神经胶质细胞、周细胞和神经元之间细胞间相互作用的共生性质以及细胞外基质成分的贡献，增加了对神经系统疾病的理解。本次研究对象主要为血管细胞和RGC，而小胶质细胞作为与炎症相关的主要细胞，在视网膜缺血相关疾病所发挥的作用仍未知晓，未来我们将进一步探索。
