视网膜由多类细胞组成，每类细胞都有着独特的生物学功能。即使是同类细胞，也会因遗传异质性导致细胞功能出现差异。以往传统的研究手段无法分辨这些差异，有些细胞由于缺乏特异性分子标记或数量稀缺也难以定义，阻碍了人们对这些细胞的认识及研究。随着生物技术的发展，单细胞转录组测序技术可以获得单个细胞转录组表达谱、识别细胞间异质性、鉴别细胞亚类及稀有细胞群，揭示每个细胞的转录组表达谱特征和功能差异，剖析细胞的起源、功能及变异特征。可获得与疾病相关的特征性细胞亚类及特异性差异表达基因，加深我们对疾病起因、发展的理解，也为临床诊断及靶向治疗提供帮助。
引用本文： 朱禾, 周翔天, 赵福新. 视网膜单细胞转录组测序研究进展. 中华眼底病杂志, 2023, 39(1): 73-77. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220117-00030 复制
细胞是生命活动最基本的单位，每个细胞在特定的时空分裂分化，并与相邻细胞协调精准发挥生物学功能。同种细胞因存在遗传异质性，在细胞分裂或分化中呈现不同的基因组、转录组及表观基因修饰组，会产生差异性的生物学功能。以往传统的基因表达分析是在混合组织多细胞水平层面进行的，获得的是多个细胞的表达平均信号值，丢失了细胞间异质性信息和特异性变化。常规的细胞分类方法主要根据细胞分子标记、细胞形态及功能等来区分，但这些方法因人为主观因素而存在争议；另外有些细胞则因特异性抗体缺乏或数量稀少也无法鉴别。随着单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术的出现，这些问题也迎刃而解。scRNA-seq是指对单个细胞转录组进行测序获得单个细胞的RNA表达谱，可在单细胞水平分析基因表达、细胞内群体异质性、定义细胞类型、识别新细胞亚型及稀有细胞群、辨识细胞状态和细胞的动态转变，分析转录动态表达谱和基因调控关系。2009年，Tang等[1]首次报道单细胞mRNA转录组高通量测序研究并证实方法具有可靠性。随着各种单细胞测序技术平台的涌现以及下一代测序仪相继推出，单细胞测序成本不断降低，使得scRNA-seq技术在视网膜研究中被广泛运用[2-4]。现就scRNA-seq在视网膜细胞分类、视网膜分化发育、视网膜疾病中的应用作一综述，以期为视网膜疾病病因解析及精准化干预治疗提供指导。
1 scRNA-seq技术
自2009年Tang等[1]开发出了第一代scRNA-seq技术，目前已经有几十种不同的scRNA-seq技术相继被开发[5-10]。目前商业产品最成熟、最为普及的为哈佛大学McCarroll团队在2015年研发的液滴测序（Drop-Seq）技术平台，该技术利用微流体装置将带有独特标识（barcode）的微珠和单个细胞一起包装到微小液滴，可检测数千个细胞，开启了高通量scRNA-seq研究的先河[7]。检测流程简述如下：（1）对解剖分离的视网膜用蛋白酶（常用消化能力温和的木瓜蛋白酶）消化获得单个细胞悬液；（2）通过微流体芯片装置，单个细胞与带有独特标识的微珠和油滴形成油包水液滴；（3）在10× Genomics仪器上对油包水液滴进行消化，释放出mRNA并逆转录合成互补脱氧核糖核酸（cDNA）；（4）cDNA文库构建；（5）高通量测序仪进行双端测序；（6）生物信息学分析：细胞质量控制并过滤，降维分析（t-SNE、UMAP），根据细胞特征表达基因进行细胞分类及表达谱分析。一次可成功捕获细胞约5 000～10 000个，按平均7 500个计算，建库加测序成本约2元/个细胞。目前国内浙江大学郭国骥团队开发的Microwell-seq技术可把建库成本降到约0.07元/个细胞[11-12]。
2 视网膜细胞分类
视网膜结构极其精细且复杂，细胞类型众多，其各类细胞功能并未完全明确。既往主要通过免疫荧光、电子显微镜、电生理等传统方法依靠细胞分子标记、形态特征、空间位置结构及生物学功能对细胞进行分类[13-15]。视网膜细胞主要被分为视杆细胞（Rod）、视锥细胞（Cone）、水平细胞（HC）、双极细胞（BC）、无长突细胞（AC）、视网膜神经节细胞（RGC）、Müller细胞7种，且视网膜各种细胞的比例已大致明确[13]。其中BC通过免疫荧光、电生理及细胞膜片钳技术进一步分成12个亚类[14]，而AC分成伽玛氨基丁酸能（GABA）、甘氨酸能（Gly）、非GABA非Gly能（nGnG）细胞三类，但还有大量AC未被定义。scRNA-seq技术出现使视网膜细胞精准分类及特征解析变成可能。
2.1 小鼠视网膜细胞分类
目前应用scRNA-seq技术对小鼠的视网膜细胞分类最为详尽。2015年，Macosko等[7]对小鼠44 808个视网膜细胞进行scRNA-seq，并将视网膜细胞定义为10种主要类型并明确各类细胞比例，包括Rod（65.6%）、Cone（4.2%）、HC（0.6%）、BC（14.0%）、AC（9.9%）、RGC（1.0%）、Müller细胞（3.6%）、小胶质细胞（0.2%）、视网膜内皮细胞（0.6%）及星形胶质细胞（0.1%）。10种细胞依据细胞表达谱特征经t-SNE降维处理进一步定义为38个亚类，这也是当时对视网膜细胞最精确的系统性分类和定义，首次解析了视网膜每类细胞的特征表达谱及每类细胞的准确比例。
BC作为中间神经元，负责把光感觉器视觉信息传递给RGC，在信号加工处理传递处于关键环节。2015年，经scRNA-seq技术BC被分成8个亚类[7]，随后该团队利用BC荧光标记进一步把BC分成15个亚类[16]，包括1类ON型视杆BC，6类OFF型视锥BC和8类ON型视锥BC，肯定了以前传统的分类结果[14]，并鉴定出3个新亚类（BC1重新分为BC1a、BC1b，BC5a-b新定义出BC5c-d两个亚类）。
AC在视网膜神经递质分泌、信号加工整合、传递过程中发挥重要作用。2015年，研究人员利用scRNA-seq技术把AC分成21个亚类并发现一些新亚类的分子标记（如Maf、Pppp1r17）[7]。Yan等[17]把AC进一步定义为63个亚类，鉴定出一些以前从未报道的新亚类（如Cd140a+ AC、Gad+ GlyT+ AC）并通过原位杂交和免疫荧光予以证实。这些研究首次对AC进行系统地分类并对各类细胞表达谱特征进行了分析，为明确AC亚类在视网膜的功能提供坚实的数据基础。
RGC负责把BC传递过来的信号传到大脑形成可感知的视觉信号。2018年，Rheaume等[18]把小鼠RGC分成40个亚类；随后Tran等[19]把小鼠RGC进一步分成46个亚类，细胞分类结果与传统的电子显微镜分类结果（约35个亚类）[20]大体相似，并发现一些新的RGC细胞亚类（如Mmp7+ RGC、Col25a1+ RGC、Calb1+ RGC），RGC作为重要的视觉信号传导细胞被进一步精确定义和解析。目前随着单细胞测序数据的增加，小鼠视网膜细胞已被定义出多达128个亚类，其中Rod（1类）、Cone（2类）、HC（1类）、BC（15类）、AC（63类）、RGC（46类）[17]；与以往传统研究[21-22]相比，BC新定义出3类，AC新定义出33类，RGC新定义出26类。这些数据为后继的视网膜功能及视觉信号精细调控机制研究提供了有力保证。
2.2 人类视网膜细胞分类
因样本来源及伦理限制，对人类视网膜细胞定义及表达谱特征解析的研究较少。Lukowski等[23]对三位成年捐献者视网膜细胞进行scRNA-seq，获得约2万个有效细胞并定义为9种细胞类型（与传统方法分类一致）共16个细胞亚类，包括Rod（首次定义出6个亚类）、HC（3个亚类）、Cone、BC、AC、RGC、Müller细胞、小胶质细胞及星形胶质细胞各1类。Yi等[24]利用scRNA-seq分析成人及婴儿视网膜，除了定义上述9种类型，另外还鉴定出内皮细胞、周细胞两种细胞类型。利用scRNA-seq技术，研究者获得了详尽的视网膜细胞亚类及每个细胞的表达谱特征，鉴定出一些新亚类及可用的分子标记并经原位杂交及免疫荧光技术等证实，这为后继视网膜功能及致病机制研究工作提供了良好的基础数据。
3 视网膜分化发育
解析视网膜分化发育的时空规律对了解视网膜的功能极其重要。有学者对1 174个人类胚胎干细胞来源的RGC培养36 d后进行scRNA-seq，发现3类不同成熟度的细胞亚类，其中一个亚类中与轴突导向、细胞外基质交互及蛋白聚糖相关的基因（如FN1、CTGF、ELN等）表达明显上调，提示其为一类成熟的RGC，这也为后继胚胎干细胞定向RGC分化用于治疗视神经病变研究提供线索[25]。有研究对16个时间点的人胚胎期到成体期的视网膜和4个发育阶段的人视网膜类器官进行scRNA-seq，将捕获的约12万个单细胞定义为126个亚类，并首次描绘了人视网膜主要细胞类型发育顺序及分化的时空规律，如发现ATOH7可能是调控Cone分化发育的一个关键因子[26]。Hu等[27]对人胚胎视网膜及视网膜色素上皮（RPE）进行scRNA-seq分析，解析了视循环和配体-受体互作基因的动态表达谱模式，并发现了与遗传性视网膜疾病相关的一些致病基因（如USH2A、EYS、CRB1、CLRN1、KCNJ13和KIF11）在胚胎期视网膜表达，这为视网膜遗传病干预研究提供了重要分子靶点。
利用scRNA-seq技术，Wang等[28]首次绘制了非人灵长类（食蟹猴）视网膜衰老的高精度单细胞转录组图谱，定义了具有特异基因表达特征的15个亚类细胞，并鉴定出一个具有神经发育潜能的Müller细胞亚类。通过差异表达基因（DEG）分析发现，老年食蟹猴视网膜氧化应激反应明显增加，RPE和脉络膜细胞炎性反应明显增强，提示氧化应激及炎症与视网膜衰老有关。Clark等[29]对小鼠胚胎期14、18 d及出生后2 d三个时间点的视网膜进行scRNA-seq，研究视网膜神经细胞的增生分化过程，发现Nfi转录因子家族（Nfia、Nfib、Nfix）主要表达在发育后期的视网膜神经祖细胞上，并决定BC和Müller细胞的命运与增生。
scRNA-seq技术可清晰地剖析视网膜定向发育分化的时空规律、细胞命运决择及关键的调控分子及信号通路，发现视网膜疾病相关的一些特殊细胞类型，这为视网膜疾病的靶点鉴定和视网膜定向修复提供良好的指导。
4 视网膜变性
scRNA-seq技术在视网膜变性疾病已有广泛应用，并发现一些与视网膜变性相关的DEG及独特的细胞亚类[23, 30-32]。Lukowski等[23]对三位捐献者视网膜细胞进行scRNA-seq，发现健康者和视网膜变性患者间的Rod具有明显的异质性，死亡时间较长的捐献者视网膜中Rod MALAT1基因（长链非编码RNA）表达丧失，提示MALAT1低表达容易引起Rod死亡，MALAT1可作为维持Rod正常功能的指标分子。Voigt等[30]对1例老年视网膜变性患者和4名正常健康者视网膜进行scRNA-seq，发现视网膜中心凹和外周部的基因表达谱存在明显差异，并在视网膜变性患者中发现存在一类特殊的胶质细胞（星形胶质细胞和Müller细胞），并呈现神经胶质细胞增生相关的表达谱变化，提示这类胶质细胞与视网膜变性进程有关。
Ronning等[32]利用光诱导建立Arr-/-小鼠视网膜损伤模型并进行视网膜scRNA-seq，其分析发现有4类CD11b+CD5+细胞（小胶质细胞、激活小胶质细胞、单核细胞、巨噬细胞）参与光感受器细胞死亡，提示这类CD11b+CD5+细胞参与光损伤。Yu和Saban[33]则发现小鼠一类独特的小胶质细胞参与光损伤导致的视网膜变性，这类细胞P2ry12、Tmem119、Siglech基因表达明显下调，而基因Lgals3、Lpl、Cd68则高表达，提示这些基因与光损伤视网膜变性有关，为后续光损伤干预提供分子靶点。这些人类及小鼠的研究结果均提示胶质细胞与视网膜变性进展有关。通过干预这些靶基因及某类细胞达到治疗视网膜变性的目的，如提高MALAT1基因表达可抑制光感受器死亡，干预胶质细胞可能成为视网膜变性治疗的一个潜在靶点。
5 老年性黄斑变性（AMD）
AMD目前缺乏有效的治疗手段。Voigt等[34]对7个人类捐献的眼球样本进行scRNA-seq，发现黄斑区与视网膜外周部RPE的一些基因表达差异显著，如黄斑区RPE高表达CXCL14（调节免疫细胞迁移和增加血管生成的趋化因子），提示CXCL14引起免疫反应增强可能损伤RPE导致视网膜变性；视网膜外周部RPE有两个基因（TFPI2、IGFBP5）表达显著增加，TFPI2在体外可促进RPE增生，而IGFBP5则与新生血管减少有关；通过分析脉络膜血管细胞的基因特征表达谱及关系树，发现RGCC基因在AMD患者中高表达，影响内皮细胞补体激活及凋亡。这为研究RPE和脉络膜基因表达，特别是脉络膜内皮细胞基因表达提供了丰富的信息。Menon等[35]对3位捐献者的视网膜进行scRNA-seq，发现人类视网膜胶质细胞比想象中的更具多样性，并证实几类细胞（Cone、大胶质细胞、小胶质细胞、血管细胞）与AMD的患病风险显著相关；此外还发现一些转录因子（FOS、FTL、EGR1）与萎缩型或渗出型AMD相关；确定了风险基因（CFI、TIMP3、VEGFA、COL4A3）与AMD的关系，TIMP3主要表达在Müller细胞，提示可通过阻断血管内皮生长因子受体来抑制视网膜新生血管，从而减少AMD的发生。
Luthert和Kiel[36]开发了一个系统基因本体数据库，整合文献中人脉络膜/RPE及视网膜的scRNA-seq数据，定义出17个细胞亚类并通过蛋白互作分析筛选AMD风险基因；此外通过功能富集分析还发现一些未曾报道的涉及细胞粘附功能的基因（如ADGRL3、CDH6、EMP2、ERC2s）与AMD相关，以及一些新的细胞类型（成纤维细胞、小胶质细胞）也可能参与调控AMD。scRNA-seq技术可充分剖析特定视网膜区域的细胞类型及基因表达谱变化，并重构了黄斑区及脉络膜细胞的基因表达动态变化，发现一些特异性AMD基因，为解析AMD分子调控机制提供了新的思路，AMD药物开发提供了新的干预靶点。
6 小结与展望
scRNA-seq技术也存在一些不足。如细胞消化成单细胞悬液时失去原来的空间结构位置，无法剖析并还原细胞在组织上空间异质性特征。空间转录组可提供每个细胞在组织上空间信息及组织内的细胞通讯和发育轨迹。通过整合单细胞转录组与空间转录组学，可产生组织内细胞亚类的高分辨率空间表达图谱，达到精确分辨细胞及空间定位的目的。当前视网膜研究难点之一是缺乏动物疾病模型情况下，只能使用临床生物样本，但很难获得视网膜活体样本，极大地限制了对视网膜相关疾病的研究。人源胚胎干细胞及诱导干细胞可诱导分化出视网膜类器官，对这些视网膜类器官进行干预构建相关视网膜疾病模型用于后继scRNA-seq研究[37-38]，可能是目前较好的代替选择方案。
视网膜功能及相关疾病的研究一直是本领域的难点，之前由于缺乏能够有效解析单细胞功能的技术手段而限制了相关领域的深入研究。scRNA-seq为视网膜研究提供了一个全新的技术和机会[39-44]。如通过scRNA-seq发现MALAT1基因与视网膜变性有关[23]，提示MALAT1可作为视网膜退行性疾病治疗的新靶点。胶质细胞参与AMD进程和糖尿病视网膜病变（DR），可针对这些胶质细胞进行特异性干预治疗，延缓或阻止AMD和DR进展[34-35, 45-46]。目前针对胶质细胞的干预也是治疗视网膜变性的一个好的手段[32]。为便于眼部单细胞数据使用，有学者收集并整合了已发表的眼部单细胞转录组数据，建立了一个眼部单细胞转录组数据库[47]和眼宏组学数据集[48]，研究者可进行个体化DEG分析、靶基因筛查，寻找眼部疾病早期分子标记及筛选潜在的药物作用靶点。scRNA-seq技术将有助于视网膜基础研究向临床应用转化，有望为视网膜疾病的诊断及治疗提供全新的指导。
细胞是生命活动最基本的单位，每个细胞在特定的时空分裂分化，并与相邻细胞协调精准发挥生物学功能。同种细胞因存在遗传异质性，在细胞分裂或分化中呈现不同的基因组、转录组及表观基因修饰组，会产生差异性的生物学功能。以往传统的基因表达分析是在混合组织多细胞水平层面进行的，获得的是多个细胞的表达平均信号值，丢失了细胞间异质性信息和特异性变化。常规的细胞分类方法主要根据细胞分子标记、细胞形态及功能等来区分，但这些方法因人为主观因素而存在争议；另外有些细胞则因特异性抗体缺乏或数量稀少也无法鉴别。随着单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术的出现，这些问题也迎刃而解。scRNA-seq是指对单个细胞转录组进行测序获得单个细胞的RNA表达谱，可在单细胞水平分析基因表达、细胞内群体异质性、定义细胞类型、识别新细胞亚型及稀有细胞群、辨识细胞状态和细胞的动态转变，分析转录动态表达谱和基因调控关系。2009年，Tang等[1]首次报道单细胞mRNA转录组高通量测序研究并证实方法具有可靠性。随着各种单细胞测序技术平台的涌现以及下一代测序仪相继推出，单细胞测序成本不断降低，使得scRNA-seq技术在视网膜研究中被广泛运用[2-4]。现就scRNA-seq在视网膜细胞分类、视网膜分化发育、视网膜疾病中的应用作一综述，以期为视网膜疾病病因解析及精准化干预治疗提供指导。
1 scRNA-seq技术
自2009年Tang等[1]开发出了第一代scRNA-seq技术，目前已经有几十种不同的scRNA-seq技术相继被开发[5-10]。目前商业产品最成熟、最为普及的为哈佛大学McCarroll团队在2015年研发的液滴测序（Drop-Seq）技术平台，该技术利用微流体装置将带有独特标识（barcode）的微珠和单个细胞一起包装到微小液滴，可检测数千个细胞，开启了高通量scRNA-seq研究的先河[7]。检测流程简述如下：（1）对解剖分离的视网膜用蛋白酶（常用消化能力温和的木瓜蛋白酶）消化获得单个细胞悬液；（2）通过微流体芯片装置，单个细胞与带有独特标识的微珠和油滴形成油包水液滴；（3）在10× Genomics仪器上对油包水液滴进行消化，释放出mRNA并逆转录合成互补脱氧核糖核酸（cDNA）；（4）cDNA文库构建；（5）高通量测序仪进行双端测序；（6）生物信息学分析：细胞质量控制并过滤，降维分析（t-SNE、UMAP），根据细胞特征表达基因进行细胞分类及表达谱分析。一次可成功捕获细胞约5 000～10 000个，按平均7 500个计算，建库加测序成本约2元/个细胞。目前国内浙江大学郭国骥团队开发的Microwell-seq技术可把建库成本降到约0.07元/个细胞[11-12]。
2 视网膜细胞分类
视网膜结构极其精细且复杂，细胞类型众多，其各类细胞功能并未完全明确。既往主要通过免疫荧光、电子显微镜、电生理等传统方法依靠细胞分子标记、形态特征、空间位置结构及生物学功能对细胞进行分类[13-15]。视网膜细胞主要被分为视杆细胞（Rod）、视锥细胞（Cone）、水平细胞（HC）、双极细胞（BC）、无长突细胞（AC）、视网膜神经节细胞（RGC）、Müller细胞7种，且视网膜各种细胞的比例已大致明确[13]。其中BC通过免疫荧光、电生理及细胞膜片钳技术进一步分成12个亚类[14]，而AC分成伽玛氨基丁酸能（GABA）、甘氨酸能（Gly）、非GABA非Gly能（nGnG）细胞三类，但还有大量AC未被定义。scRNA-seq技术出现使视网膜细胞精准分类及特征解析变成可能。
2.1 小鼠视网膜细胞分类
目前应用scRNA-seq技术对小鼠的视网膜细胞分类最为详尽。2015年，Macosko等[7]对小鼠44 808个视网膜细胞进行scRNA-seq，并将视网膜细胞定义为10种主要类型并明确各类细胞比例，包括Rod（65.6%）、Cone（4.2%）、HC（0.6%）、BC（14.0%）、AC（9.9%）、RGC（1.0%）、Müller细胞（3.6%）、小胶质细胞（0.2%）、视网膜内皮细胞（0.6%）及星形胶质细胞（0.1%）。10种细胞依据细胞表达谱特征经t-SNE降维处理进一步定义为38个亚类，这也是当时对视网膜细胞最精确的系统性分类和定义，首次解析了视网膜每类细胞的特征表达谱及每类细胞的准确比例。
BC作为中间神经元，负责把光感觉器视觉信息传递给RGC，在信号加工处理传递处于关键环节。2015年，经scRNA-seq技术BC被分成8个亚类[7]，随后该团队利用BC荧光标记进一步把BC分成15个亚类[16]，包括1类ON型视杆BC，6类OFF型视锥BC和8类ON型视锥BC，肯定了以前传统的分类结果[14]，并鉴定出3个新亚类（BC1重新分为BC1a、BC1b，BC5a-b新定义出BC5c-d两个亚类）。
AC在视网膜神经递质分泌、信号加工整合、传递过程中发挥重要作用。2015年，研究人员利用scRNA-seq技术把AC分成21个亚类并发现一些新亚类的分子标记（如Maf、Pppp1r17）[7]。Yan等[17]把AC进一步定义为63个亚类，鉴定出一些以前从未报道的新亚类（如Cd140a+ AC、Gad+ GlyT+ AC）并通过原位杂交和免疫荧光予以证实。这些研究首次对AC进行系统地分类并对各类细胞表达谱特征进行了分析，为明确AC亚类在视网膜的功能提供坚实的数据基础。
RGC负责把BC传递过来的信号传到大脑形成可感知的视觉信号。2018年，Rheaume等[18]把小鼠RGC分成40个亚类；随后Tran等[19]把小鼠RGC进一步分成46个亚类，细胞分类结果与传统的电子显微镜分类结果（约35个亚类）[20]大体相似，并发现一些新的RGC细胞亚类（如Mmp7+ RGC、Col25a1+ RGC、Calb1+ RGC），RGC作为重要的视觉信号传导细胞被进一步精确定义和解析。目前随着单细胞测序数据的增加，小鼠视网膜细胞已被定义出多达128个亚类，其中Rod（1类）、Cone（2类）、HC（1类）、BC（15类）、AC（63类）、RGC（46类）[17]；与以往传统研究[21-22]相比，BC新定义出3类，AC新定义出33类，RGC新定义出26类。这些数据为后继的视网膜功能及视觉信号精细调控机制研究提供了有力保证。
2.2 人类视网膜细胞分类
因样本来源及伦理限制，对人类视网膜细胞定义及表达谱特征解析的研究较少。Lukowski等[23]对三位成年捐献者视网膜细胞进行scRNA-seq，获得约2万个有效细胞并定义为9种细胞类型（与传统方法分类一致）共16个细胞亚类，包括Rod（首次定义出6个亚类）、HC（3个亚类）、Cone、BC、AC、RGC、Müller细胞、小胶质细胞及星形胶质细胞各1类。Yi等[24]利用scRNA-seq分析成人及婴儿视网膜，除了定义上述9种类型，另外还鉴定出内皮细胞、周细胞两种细胞类型。利用scRNA-seq技术，研究者获得了详尽的视网膜细胞亚类及每个细胞的表达谱特征，鉴定出一些新亚类及可用的分子标记并经原位杂交及免疫荧光技术等证实，这为后继视网膜功能及致病机制研究工作提供了良好的基础数据。
3 视网膜分化发育
解析视网膜分化发育的时空规律对了解视网膜的功能极其重要。有学者对1 174个人类胚胎干细胞来源的RGC培养36 d后进行scRNA-seq，发现3类不同成熟度的细胞亚类，其中一个亚类中与轴突导向、细胞外基质交互及蛋白聚糖相关的基因（如FN1、CTGF、ELN等）表达明显上调，提示其为一类成熟的RGC，这也为后继胚胎干细胞定向RGC分化用于治疗视神经病变研究提供线索[25]。有研究对16个时间点的人胚胎期到成体期的视网膜和4个发育阶段的人视网膜类器官进行scRNA-seq，将捕获的约12万个单细胞定义为126个亚类，并首次描绘了人视网膜主要细胞类型发育顺序及分化的时空规律，如发现ATOH7可能是调控Cone分化发育的一个关键因子[26]。Hu等[27]对人胚胎视网膜及视网膜色素上皮（RPE）进行scRNA-seq分析，解析了视循环和配体-受体互作基因的动态表达谱模式，并发现了与遗传性视网膜疾病相关的一些致病基因（如USH2A、EYS、CRB1、CLRN1、KCNJ13和KIF11）在胚胎期视网膜表达，这为视网膜遗传病干预研究提供了重要分子靶点。
利用scRNA-seq技术，Wang等[28]首次绘制了非人灵长类（食蟹猴）视网膜衰老的高精度单细胞转录组图谱，定义了具有特异基因表达特征的15个亚类细胞，并鉴定出一个具有神经发育潜能的Müller细胞亚类。通过差异表达基因（DEG）分析发现，老年食蟹猴视网膜氧化应激反应明显增加，RPE和脉络膜细胞炎性反应明显增强，提示氧化应激及炎症与视网膜衰老有关。Clark等[29]对小鼠胚胎期14、18 d及出生后2 d三个时间点的视网膜进行scRNA-seq，研究视网膜神经细胞的增生分化过程，发现Nfi转录因子家族（Nfia、Nfib、Nfix）主要表达在发育后期的视网膜神经祖细胞上，并决定BC和Müller细胞的命运与增生。
scRNA-seq技术可清晰地剖析视网膜定向发育分化的时空规律、细胞命运决择及关键的调控分子及信号通路，发现视网膜疾病相关的一些特殊细胞类型，这为视网膜疾病的靶点鉴定和视网膜定向修复提供良好的指导。
4 视网膜变性
scRNA-seq技术在视网膜变性疾病已有广泛应用，并发现一些与视网膜变性相关的DEG及独特的细胞亚类[23, 30-32]。Lukowski等[23]对三位捐献者视网膜细胞进行scRNA-seq，发现健康者和视网膜变性患者间的Rod具有明显的异质性，死亡时间较长的捐献者视网膜中Rod MALAT1基因（长链非编码RNA）表达丧失，提示MALAT1低表达容易引起Rod死亡，MALAT1可作为维持Rod正常功能的指标分子。Voigt等[30]对1例老年视网膜变性患者和4名正常健康者视网膜进行scRNA-seq，发现视网膜中心凹和外周部的基因表达谱存在明显差异，并在视网膜变性患者中发现存在一类特殊的胶质细胞（星形胶质细胞和Müller细胞），并呈现神经胶质细胞增生相关的表达谱变化，提示这类胶质细胞与视网膜变性进程有关。
Ronning等[32]利用光诱导建立Arr-/-小鼠视网膜损伤模型并进行视网膜scRNA-seq，其分析发现有4类CD11b+CD5+细胞（小胶质细胞、激活小胶质细胞、单核细胞、巨噬细胞）参与光感受器细胞死亡，提示这类CD11b+CD5+细胞参与光损伤。Yu和Saban[33]则发现小鼠一类独特的小胶质细胞参与光损伤导致的视网膜变性，这类细胞P2ry12、Tmem119、Siglech基因表达明显下调，而基因Lgals3、Lpl、Cd68则高表达，提示这些基因与光损伤视网膜变性有关，为后续光损伤干预提供分子靶点。这些人类及小鼠的研究结果均提示胶质细胞与视网膜变性进展有关。通过干预这些靶基因及某类细胞达到治疗视网膜变性的目的，如提高MALAT1基因表达可抑制光感受器死亡，干预胶质细胞可能成为视网膜变性治疗的一个潜在靶点。
5 老年性黄斑变性（AMD）
AMD目前缺乏有效的治疗手段。Voigt等[34]对7个人类捐献的眼球样本进行scRNA-seq，发现黄斑区与视网膜外周部RPE的一些基因表达差异显著，如黄斑区RPE高表达CXCL14（调节免疫细胞迁移和增加血管生成的趋化因子），提示CXCL14引起免疫反应增强可能损伤RPE导致视网膜变性；视网膜外周部RPE有两个基因（TFPI2、IGFBP5）表达显著增加，TFPI2在体外可促进RPE增生，而IGFBP5则与新生血管减少有关；通过分析脉络膜血管细胞的基因特征表达谱及关系树，发现RGCC基因在AMD患者中高表达，影响内皮细胞补体激活及凋亡。这为研究RPE和脉络膜基因表达，特别是脉络膜内皮细胞基因表达提供了丰富的信息。Menon等[35]对3位捐献者的视网膜进行scRNA-seq，发现人类视网膜胶质细胞比想象中的更具多样性，并证实几类细胞（Cone、大胶质细胞、小胶质细胞、血管细胞）与AMD的患病风险显著相关；此外还发现一些转录因子（FOS、FTL、EGR1）与萎缩型或渗出型AMD相关；确定了风险基因（CFI、TIMP3、VEGFA、COL4A3）与AMD的关系，TIMP3主要表达在Müller细胞，提示可通过阻断血管内皮生长因子受体来抑制视网膜新生血管，从而减少AMD的发生。
Luthert和Kiel[36]开发了一个系统基因本体数据库，整合文献中人脉络膜/RPE及视网膜的scRNA-seq数据，定义出17个细胞亚类并通过蛋白互作分析筛选AMD风险基因；此外通过功能富集分析还发现一些未曾报道的涉及细胞粘附功能的基因（如ADGRL3、CDH6、EMP2、ERC2s）与AMD相关，以及一些新的细胞类型（成纤维细胞、小胶质细胞）也可能参与调控AMD。scRNA-seq技术可充分剖析特定视网膜区域的细胞类型及基因表达谱变化，并重构了黄斑区及脉络膜细胞的基因表达动态变化，发现一些特异性AMD基因，为解析AMD分子调控机制提供了新的思路，AMD药物开发提供了新的干预靶点。
6 小结与展望
scRNA-seq技术也存在一些不足。如细胞消化成单细胞悬液时失去原来的空间结构位置，无法剖析并还原细胞在组织上空间异质性特征。空间转录组可提供每个细胞在组织上空间信息及组织内的细胞通讯和发育轨迹。通过整合单细胞转录组与空间转录组学，可产生组织内细胞亚类的高分辨率空间表达图谱，达到精确分辨细胞及空间定位的目的。当前视网膜研究难点之一是缺乏动物疾病模型情况下，只能使用临床生物样本，但很难获得视网膜活体样本，极大地限制了对视网膜相关疾病的研究。人源胚胎干细胞及诱导干细胞可诱导分化出视网膜类器官，对这些视网膜类器官进行干预构建相关视网膜疾病模型用于后继scRNA-seq研究[37-38]，可能是目前较好的代替选择方案。
视网膜功能及相关疾病的研究一直是本领域的难点，之前由于缺乏能够有效解析单细胞功能的技术手段而限制了相关领域的深入研究。scRNA-seq为视网膜研究提供了一个全新的技术和机会[39-44]。如通过scRNA-seq发现MALAT1基因与视网膜变性有关[23]，提示MALAT1可作为视网膜退行性疾病治疗的新靶点。胶质细胞参与AMD进程和糖尿病视网膜病变（DR），可针对这些胶质细胞进行特异性干预治疗，延缓或阻止AMD和DR进展[34-35, 45-46]。目前针对胶质细胞的干预也是治疗视网膜变性的一个好的手段[32]。为便于眼部单细胞数据使用，有学者收集并整合了已发表的眼部单细胞转录组数据，建立了一个眼部单细胞转录组数据库[47]和眼宏组学数据集[48]，研究者可进行个体化DEG分析、靶基因筛查，寻找眼部疾病早期分子标记及筛选潜在的药物作用靶点。scRNA-seq技术将有助于视网膜基础研究向临床应用转化，有望为视网膜疾病的诊断及治疗提供全新的指导。